KR100829083B1

KR100829083B1 - 생리활성을 갖는 애기달맞이 추출물

Info

Publication number: KR100829083B1
Application number: KR1020060071100A
Authority: KR
Inventors: 박수영; 정용환; 이욱재; 이정아; 김지영; 윤원종; 오대주
Original assignee: 재단법인 제주하이테크산업진흥원
Priority date: 2006-07-28
Filing date: 2006-07-28
Publication date: 2008-05-16
Also published as: KR20080010720A

Abstract

본 발명은 생리활성을 갖는 애기달맞이 추출물에 관한 것이다.

본 발명의 생리활성을 갖는 애기달맞이 추출물은, 애기달맞이(Oenothera laciniata) 전초(全草)를 준비하고, 음건한 다음 분쇄하여 미세분말로 만들어 80 % 에탄올에 침적하고, 이 에탄올 침적물을 초음파를 이용하여 1 시간씩 3 회 추출한 다음, 추출액의 상층액을 회수하여 감압 농축하고, 농축물을 물에 현탁시킨 후, 현탁액을 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올로 순차적으로 추출하여 애기달맞이 추출물을 제조하는 것으로 구성된다.

본 발명에 의해 항산화활성, 항염활성, 항암활성 및 항균활성의 생리활성이 뛰어난 애기달맞이 추출물이 제공되며, 애기달맞이 추출물을 활성성분으로 포함하는 생리활성이 뛰어난 조성물이 제공된다.

애기달맞이, 추출, 항산화활성, 항염활성, 항암활성, 항균활성

Description

생리활성을 갖는 애기달맞이 추출물{OENOTHERA LACINIATA EXTRACTS HAVING PHYSIOLOGICAL ACTIVITY}

도 1은 본 발명의 애기달맞이 추출물에 대한 폴리페놀화합물 함량을 나타내는 그래프

도 2는 본 발명의 애기달맞이 추출물에 대한 항염활성을 나타내는 그래프

도 3은 본 발명의 애기달맞이 추출물 중 에틸아세테이트 분획물에 대한 DNA 단편화의 전기영동사진

M : DNA 마커, Lane 1 : 대조군

Lane 2 : 에틸아세테이트 분획물(100 ㎍/㎖)

도 4는 본 발명의 애기달맞이 추출물의 세포사멸 정도를 나타내는 유동세포분석에 의한 DNA 함량 그래프

A : 대조군, B : 에틸아세테이트 분획물(12 시간)

C : 에틸아세테이트 분획물(24 시간)

도 5는 본 발명의 애기달맞이 추출물의 세포사멸 정도를 나타내는 핵 응집현상 사진

A : 대조군, B : 에틸아세테이트 분획물(12 시간)

C : 에틸아세테이트 분획물(24 시간)

도 6은 본 발명의 애기달맞이 추출물 중 에틸아세테이트 분획물의 스타필로코커스 아우레우스균(Straphylococcus aureus)에 대한 농도별 항균활성을 나타내는 결과사진

C : 대조군, 1 : 2,000 ppm, 2 : 1,000 ppm

3 : 500 ppm, 4 : 250 ppm 5 : 100 ppm

도 7은 본 발명의 애기달맞이 에틸아세테이트 분획물의 살모넬라 티피뮤리움균(Salmonella typhimurium)에 대한 농도별 항균활성을 나타내는 결과사진

C : 대조군, 1 : 2,000 ppm 2 : 1,000 ppm,

3 : 500 ppm, 4 : 250 ppm 5 : 100 ppm

도 8은 본 발명의 애기달맞이 에탄올 추출물 및 분획물에 대한 항균활성을 나타내는 그래프

최근 약용식물로부터 특정성분을 추출하여 천연물이 가지는 2차 대사산물인 생리활성 물질에 대한 관심이 증대되고 있다.

생리활성을 나타내는 물질 중 식품의 기능 강화를 위해 주로 활용되고 있는 것은 항산화, 항염, 항암, 항균활성 관련 물질이다. 그 중 식물체내의 페놀성 화합물은 페놀 하이드록실기(phenolic hydroxyl)를 가지고 있기 때문에 단백질 등의 거대 분자들과 결합하는 성질을 가지며, 항산화 활성, 항미생물 활성 및 세포의 산화적 손상을 보호하여 심장질환이나 암과 같은 질병의 진정효과가 보고되어 있다.

한편, 달맞이꽃(Oenothera odorata Jacquin)은 바늘꽃과(Onagraceae)에 속하는 2 년생 초본으로서, 최근에 귀화가 이루어진 관상용 및 식용작물이다.

이 식물은 남아메리카 원산이며 우리나라에 야생하는 동속식물로는 큰달맞이꽃, 겹달맞이꽃, 애기달맞이꽃 등 4종이 알려져 있다.

달맞이꽃은 아메리카 인디안들이 그 추출액을 피부의 염증 또는 발진에 바르거나 해소 기침약으로 사용했던 약초로 한방에서는 대소초(待宵草)라 하여 해열 및 소염제로 사용하였고 민간요법으로는 달인물로 인후염이나 피부염의 환부를 세척하는 것으로 전해지며, 뿌리와 전초를 감기, 해열, 인후염, 신장염, 고혈압 등에 사용한다고 알려져 있다.

그러나, 애기달맞이(Oenothera laciniata Hill)는 근래에 도래한 귀화식물로서 바닷가의 모래밭에 자라는 식물로서, 제주도를 제외하고는 찾아보기가 힘든 식물로 알려져 있어 달맞이꽃에 비해 활성성분이나 약리 연구는 거의 보고 된 바가 없는 실정이다.

본 발명은 항산화, 항염, 항암 및 항균활성의 생리활성이 뛰어난 애기달맞이 추출물을 제공하는데 목적이 있다.

또한, 본 발명은 애기달맞이 추출물을 활성성분으로 포함하는 생리활성이 뛰어난 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 주 재료인 애기달맞이(Oenothera laciniata Hill)는 근래에 도래한 귀화식물로서 바닷가의 모래밭에 자라며, 줄기는 밑에서부터 가지가 갈라지고 높이 20 ~ 60 ㎝로 달맞이꽃에 비해 아주 작은 것이 특징이다.

특히, 애기달맞이는 제주도를 제외하고는 찾아보기가 힘든 식물로 알려져 있어 달맞이꽃에 비해 활성성분이나 약리 연구는 거의 보고 된 바 없는 식물이다.

본 발명은 애기달맞이를 이용하여 생리활성이 큰 추출물을 제조하고, 그 생리활성을 가진 애기달맞이 추출물을 활성성분으로 하는 각종 질병의 예방 및 개선용 조성물로서의 가능성을 모색하는 데 목적을 두고 연구를 하였다.

애기달맞이 전초를 80 % 에탄올로 추출하고 극성이 다른 4가지 용매(에탄올, 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올)로 분획하여 본 발명의 애기달맞이 추출물의 폴리페놀 함량을 분석한 결과 에탄올추출물 및 모든 분획물에서 폴리페놀이 나타났으며, 그 중 가장 높은 폴리페놀 함량을 나타낸 분획물은 에틸아세테이트 분획물로서, 에탄올추출물에 비해 2.7 배 가량 높은 함량을 나타냈다(도 1).

이는 본 발명의 애기달맞이 추출물이 다양한 생리활성을 가지는 페놀성 화합물을 다수 함유하고 있는 것을 추측할 수 있는 결과였다.

또한, 본 발명의 애기달맞이 추출물의 항산화활성에 대해 실험한 결과, DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl)의 자유라디칼 소거활성은 80 % 에탄올 조추출물과 에틸아세테이트, 부탄올 분획물에서 다른 용매 분획물에 비해 대단히 높은 라디칼 소거 활성을 나타냈으며, 크산틴 옥시다제 활성 억제는 80 % 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획물에서, 과산화물 라디칼 소거활성은 에틸아세테이트와 부탄올 분획물이 가장 높은 과산화물 라디칼 소거활성을 나타내었다.

전반적으로 가장 항산화활성이 높게 나타난 에틸아세테이트 분획물의 DPPH 자유라디칼 소거활성의 IC₅₀ 값은 16.19 ㎍/㎖, 크산틴 옥시다제 억제활성은 220.37 ㎍/㎖, 과산화물 자유라디칼 소거활성은 42.07 ㎍/㎖ 이었다.

특히, 이 값은 대조군으로 사용된 아스코르빈산(ascorbic acid), BHA (butylated hydroxy anisole), 트롤록스(trolox), 알로푸리놀(allopurinol) 값에 비해 조금도 뒤떨어지지 않는 활성이라 할 수 있다.

따라서, 산소유리기의 자유기를 소거할 수 있는 물질 또한 산화적 손상의 예방에 유용하게 쓰일 수 있으므로, 본 발명의 애기달맞이 추출물도 산화적 손상의 예방에 사용될 수 있는 항산화 물질임을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명의 애기달맞이 에탄올추출물의 RAW264.7 에서의 세포독성이 나타나지 않는 농도로 추출물을 처리하여 NO 생성 억제효과를 세포 배양액 중에 존재하는 NO₂ ^-의 형태로 측정한 결과, LPS 단독 처리군에서는 NO가 과량 생성되는 것을 확인할 수 있었으며, 애기달맞이 추출물을 동시에 처리한 시험구에서는 NO 생성량이 감소됨을 확인할 수 있었고, 특히 헥산과 디클로로메탄, 에틸아세테이트 분획물에서 NO의 생성량이 현저히 저해됨을 볼 수 있었다(도 2).

따라서, 본 발명의 애기달맞이 추출물이 항염활성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명의 애기달맞이 추출물에 대한 항암활성 실험 결과, 애기달맞이 80 % 에탄올추출물의 IC₅₀ 값은 72.848 ㎍/㎖를 보였으며, 헥산 분획물은 47.72 ㎍/㎖, 디클로로메탄 12.40 ㎍/㎖, 에틸아세테이트 43.03 ㎍/㎖로 나타났다.

그러나, 부탄올과 물 분획물은 IC₅₀ 값을 구할 수가 없었으며, 농도 의존적으로 세포성장 억제효과가 가장 좋은 분획물은 에틸아세테이트 분획물이었다.

에틸아세테이트 분획물을 여러 농도로 처리하였을 때의 세포성장 억제율은 12.5 ㎍/㎖ 농도에서 22.00 ± 6.97 %, 25 ㎍/㎖ 농도에서 30.44 ± 2.83 %, 50 ㎍/㎖ 농도에서 54.92 ± 6.35 %, 100 ㎍/㎖ 농도에서 77.67 ± 2.29 %로 유의적인 세포성장 억제효과를 보였다(표 3).

애기달맞이 분획물의 세포독성효과에 의한 HL-60 세포 증식억제 작용이 세포사멸(apoptosis) 유도에 의한 것인지 그 기전을 알아보기 위하여, 세포사멸 유도에 의하여 나타나는 DNA 단편화 현상을 전기영동으로 관찰한 결과, 애기달맞이 에틸아세테이트 분획물은 HL-60 세포에 100 ㎍/㎖의 농도로 처리시 DNA 단편화 현상이 두드러지게 나타났다(도 3).

이에 에틸아세테이트 분획물을 갖고 세포사멸이 일어난 세포에서 볼 수 있는 가장 특징적인 변화인 형태학적 관찰을 실시하였다.

그 결과, 정상세포들의 핵들의 형태는 정상적인 둥근형태이나 에틸아세테이트 추출물이 처리된 세포에서는 시간이 경과될 수록 세포의 크기가 축소되며, 핵의 모양이 불규칙하고 부분적인 핵의 응집현상을 관찰할 수 있었다(도 5).

또한, 애기달맞이 추출물에 의한 세포사멸 유도에 의하여 Sub-G1 이배수성 (hypodiploid) 세포가 증가하는지 DNA에 결합하여 형광을 나타내는 물질인 PI를 처리하여 유세포분석기로 분석하였다.

그 결과, 처리 시간이 경과될 수록 sub-G1 hypodiploid 세포가 증가되는 됨을 확인할 수가 있었다(도 4).

또한, 본 발명의 애기달맞이 추출물에 대한 항균활성 실험 결과, 그램 양성균에서는 80 % 에탄올 추출물, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물 분획물에서 처리농도가 증가할수록 항균활성을 나타내는 억제환(inhibition zone)의 크기도 비례적으로 증가하였으며, 특히 에틸아세테이트 분획물의 경우 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에서 2,000 ppm 농도에 18 mm의 생육저해환이 나타나 다른 추출물보다 높은 항균력을 나타냈다(도 6).

그램 음성균에 대한 항균활성 결과는 표 4에서 보는 바와 같이 애기달맞이 조추출물과 분획물 모두에서 모든 균주를 대상으로 우수한 항균활성을 나타냈으며, 특히 에틸아세테이트 분획물이 살모넬라(Salmonella typhimurium) 균주에서 2,000 ppm으로 처리시 19 mm로 가장 우수한 생육저해환(clear zone)을 나타내었다(도 7).

한편, 헥산과 디클로로메탄 분획물은 모든 균주에서 항균활성을 보이지 않았으며, 특히 에틸아세테이트 분획물은 그램 양성, 그램 음성 모든 균주를 대상으로 폭넓은 항균력을 보여주었다.

애기달맞이 추출물과 분획물들의 농도를 TBS 배지 10 ㎖에 2,000 ppm으로 처리하여 미생물에 대한 생육저해를 흡광도(A=650 nm)를 측정하여 저해율을 구하였다.

그 결과, 에탄올 추출물은 본 실험에서 사용된 모든 균주에 대해 약 25 ~ 53 % 정도의 생육저해 효과를 나타내었고, 특히 살모넬라 엔테리티디스균(Salmonella enteritidis)에 대해 53.8 %로 가장 높은 저해율을 나타내었다(도 8).

그리고, 분획물 중에는 에틸아세테이트 분획물과 부탄올 분획물이 44 ~ 62 %로 가장 높은 생육 억제율을 보였으며, 거의 모든 미생물 균주에 대해 약 50 % 이상의 강력한 생육저해를 나타냈다.

특히, 에틸아세테이트 분획물은 리스테리아 식중독균(Listeria monocytogenes)에 대하여 62.4 % 로 가장 높은 미생물 생육저해율을 나타내었다.

따라서, 본 발명의 애기달맞이 추출물은 항산화 활성, 항염활성, 항암활성 및 항균활성이 뛰어난 것을 확인할 수 있었으며, 특히 전반적으로 폴리페놀 함량이 높게 나타난 에틸아세테이트 분획물에서 높은 항산화, 항염, 항암 및 항균활성을 보이는 것을 알 수 있었다.

한편, 본 발명의 생리활성을 가지는 애기달맞이 추출물은 식품첨가제, 사료첨가제, 음료조성물, 화장료조성물 등 다양하게 활용할 수 있으며, 다양한 질병에 대한 예방 및 개선용 조성물로 활용할 수도 있다.

또한, 본 발명의 애기달맞이 추출물을 활성성분으로 포함하는 항산화활성, 항염활성, 항암활성 및 항균활성의 생리활성을 갖는 기능성 조성물을 제조할 수 있다.

이하, 본 발명의 생리활성을 갖는 애기달맞이 추출물에 대하여 실시예 및 실험예를 통하여 상세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

<실시예 1> 본 발명의 애기달맞이 추출물의 제조

제주도 해안가에 자생하고 있는 애기달맞이(Oenothera laciniata)를 2006년 4월에 채집하여 준비하였다.

준비한 애기달맞이 전초(全草)를 음건한 다음 마쇄기로 분쇄하여 미세분말을 80 % 에탄올에 침적하고 초음파를 이용하여 1 시간씩 3 회 추출하였다.

그 후, 상층액을 회수하여 감압 농축하여 에탄올 추출물을 얻었다.

농축한 에탄올 추출물을 물에 현탁시킨 후에 헥산(1ℓ×3), 디클로로메탄(1ℓ×3), 에틸아세테이트(1ℓ×3), 부탄올(1ℓ×3)로 순차적으로 추출하여 본 발명의 애기달맞이 추출물을 제조하였다.

<실험예 1> 본 발명의 애기달맞이 추출물에 대한 폴리페놀 함량 분석실험

페놀성 물질은 식물계에서 널리 분포되어 있는 2차 대사산물의 하나로 다양한 구조와 분자량을 가진다.

이들은 페놀릭 하이드록실(phenolic hydroxyl)기를 가지기 때문에 단백질 및 기타 거대 분자들과 결합하는 성질을 가지며, 항산화 효과 등의 생리활성 기능도 가진다.

탄닌산(Tannic acid) 표준곡선을 이용하여 본 발명의 애기달맞이 추출물의 총 폴리페놀 함량을 측정하여 비교 분석하였다.

폴리페놀 화합물의 함량은 Folin-Denis법(Gutfinger, T: Polyphenols in olive olis. J. Am. Oil Chem. Soc., 58, 966-968(1981)을 약간 변형시켜 측정하였다.

즉, 애기달맞이 추출물을 1 ㎎/㎖로 녹인 다음 0.2 ㎖를 시험관에 취하고 증류수를 가하여 2 ㎖로 만든 후, 여기에 0.2 ㎖ Folin-ciocalteu's phenol reagent (Sigma)를 첨가하여 잘 혼합한 후 3 분간 실온에 방치하였다.

그리고, 2 M Na₂CO₃용액 0.4 ㎖를 가하여 혼합하고 증류수를 첨가하여 4 ㎖로 만든 후, 실온에서 1 시간 동안 방치하여 상징액을 725 nm에서 흡광도를 측정하였RH, 표준물질은 탄닌산(Tannic acid, Sigma Chemical co. USA)을 이용하였다.

표준곡선을 작성한 후 애기달맞이 꽃 추출물 및 분획물 시료의 총 폴리페놀 함량은 ㎎/g 탄닌산 으로 나타내었다.

그 결과, 총 폴리페놀 함량은 에탄올추출물에서 6.396 ㎎/g ± 0.185, 헥산 분획물에서 0.849 ㎎/g ± 0.038, 디클로로메탄 분획물에서 2.811 ㎎/g ± 0.090, 에틸아세테이트 분획물에서 17.264 ㎎/g ± 0.473, 부탄올 분획물에서 11.456 ㎎/g ± 0.319, 그리고 잔사인 물층에서 3.491 ㎎/g ± 0.108로 나타났으며, 그 중 가장 높은 폴리페놀 함량을 나타낸 것은 에틸아세테이트 분획물로 에탄올 조추출물에 비해 2.7 배 가량 증가하는 경향을 보였다(도 1).

이와 같은 결과로서 본 발명의 애기달맞이 추출물이 페놀성 화합물을 다수 함유하고 있다는 것을 알 수 있었다.

<실험예 2> 본 발명의 애기달맞이 추출물에 대한 항산화활성 실험

본 발명의 실시예 1에서 제조한 애기달맞이 추출물을 준비하여 실험에 사용하였다.

대조군으로는 아스코르빈산(ascorbic acid), BHA(butylated hydroxy anisole), 트롤록스(trolox), 알로푸리놀(allopurinol)을 사용하였다.

1. DPPH 라디칼 소거활성에 의한 항산화활성 검색

전자공여능(electron donating ability) 측정은 Blosis 방법 (Blois, M. S. 1958. Antioxidant determination by the use a stable free radical. Nature 26: 1199-1200)에 의한 DPPH 자유라디칼 소거법에 따라 측정하였다.

메탄올에 녹인 시료 각각의 농도를 96 well plate에 100 ㎕씩 분주하고 0.4 mM DPPH용액을 동량 첨가하여 실온에서 10 분간 방치한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.

DPPH 라디칼 소거활성은 아래식으로부터 산출하였고, DPPH의 흡광도가 50 % 감소할 때 나타나는 시료의 농도(IC₅₀)로 표시하였으며, 각 시료는 3 회 반복하여 실험을 실시하여 평균값을 구하였다.

DPPH radical 소거활성 (%) = (A_control - A_sample)/A_control × 100

A_sample = 시료를 첨가한 반응액의 흡광도

A_control = 시료대신 메탄올을 첨가한 반응액의 흡광도

2. 크산틴 산화효소 억제활성 및 과산화물 소거활성 실험

크산틴/크산틴 산화효소(Xanthine/xanthine oxidase)에 의한 요산(uric acid) 생성은 290 nm에서 증가된 흡광도에 의해 측정하였고, 과산화물(superoxide)의 양은 NBT(nitroblue tetrazolium) 환원방법에 의해 측정하였다.

반응액은 각 시료의 여러 농도와 0.5 mM 크산틴과 1 mM EDTA를 200 mM 인산버퍼(phosphate buffer, pH 7.5) 100 ㎕에서 준비하였고, 50 mU/ml 크산틴 산화효소를 첨가하여 요산의 생성을 유도하였다.

과산화물(Superoxide) 소거활성은 위 반응액에 0.5 mM NBT를 첨가하여 반응 시켰다.

크산틴 산화효소 억제 활성 및 과산화물 소거활성은 생성된 요산과 과산화물의 흡광도가 50 % 감소할 때 나타나는 시료의 농도(IC₅₀)로 표시하였다.

3. 항산화활성 실험결과

항산화활성 실험결과는 아래의 표 1에 나타내었다.

즉, DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl)의 자유라디칼 소거활성으로 본 발명의 애기달맞이추출물의 항산화 활성을 측정한 결과, 80 % 에탄올 조추출물과 에틸아세테이트, 부탄올 분획물에서 다른 용매 분획물에 비해 대단히 높은 라디칼 소거 활성을 나타냈으며, 크산틴 옥시다제 활성 억제는 80 % 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획물에서, 과산화물 라디칼 소거활성은 에틸아세테이트와 부탄올 분획물이 가장 높은 과산화물 라디칼 소거활성을 나타내었다.

특히, 이 값은 대조군으로 사용된 아스코르빈산(ascorbic acid), BHA(butylated hydroxy anisole), 트롤록스(trolox), 알로푸리놀(allopurinol) 값에 비해 조금도 뒤떨어지지 않는 활성이라 할 수 있다.

<표 1> 본 발명의 애기달맞이 추출물에 대한 항산화활성 실험 결과

처리	IC₅₀(㎍/㎖)^a)
처리	DPPH 라디칼 소거활성	크산틴 산화효소 억제활성	과산화물 라디칼 소거활성
80% 에탄올추출물	44.21 ± 1.65	773.00 ± 2.89	62.15 ± 1.79
헥산분획물	611.07 ± 2.79	> 1000	> 1000
디클로로메탄 분획물	108.00 ± 2.03	> 1000	91.43 ± 1.96
에틸아세테이트 분획물	16.19 ± 1.21	220.37 ± 2.34	42.07 ± 1.66
부탄올분획물	40.53 ± 1.61	> 1000	46.07 ± 1.66
물 분획물	342.76 ± 2.53	> 1000	95.32 ± 1.98
BHA^b ⁾	22.70 ± 0.61	NA^c ⁾	NA^c ⁾
아스코르빈산	3.90 ± 3.22	-	-
트롤록스	8.62 ± 2.20	288.60 ± 4.4	189.9 ± 2.03
알로푸리놀	NA^c ⁾	3.12 ± 0.17	22.65 ± 0.35

* a) IC₅₀ 값은 흡광도가 50 % 감소할 때 나타나는 시료의 농도로써 3 회 반복 실험하여 계산된 값임.

* b) BHA : 부틸하이드록시 아니솔(Butylated hydroxy anisole)

* c) NA : 적용되지 않음

항산화물질의 가장 특징적인 기작은 유리기와 반응하는 것으로 유기리 소거작용은 활성라디칼에 전자를 공여하여 식물 중의 항산화 효과나 인체에서 노화를 억제하는 척도로 사용된다.

크산틴 산화효소는 산화적 환경에서 크산틴 탈수소효소(xanthine dehydrogenase)로부터 생성된다.

크산틴 산화효소는 하이포크산틴(hypoxanthine)을 산화시켜 최종적으로 요산(uric acid)과 산소를 생성하며, 산소유리기와 수소과산화기가 이 산소로부터 발생하게 된다.

요산의 축적은 고요산혈증과 통풍을 유발하는 것으로 알려져 있으므로 요산 형성의 억제제가 이들 질환을 위한 치료 물질로서 유용할 것이다.

크산틴 산화효소에 의해 생성된 산소유리기는 세포의 손상을 초래한다. 그러나, 이 내인성 항산화 방어체계가 세포내 산화-환원 균형을 유지하는데에 문제가 생길 경우 결과적으로 산화스트레스가 일어나게 되며, 이 산화스트레스는 직접적으로 세포내 거대분자의 손상을 일으키거나 세포손상을 일으키는데 중요한 역할을 한다.

<실험예 3> 본 발명의 애기달맞이 추출물에 대한 항염활성 실험

내독소로 잘 알려진 LPS는 그람음성균의 세포외막에 존재하며, RAW264.7와 같은 macrophage 또는 monocyte에서 TNF-α, IL-6, IL-1β와 같은 pro-inflammatory cytokine을 증가시키는 것으로 알려져 있다.

또한, 이러한 염증매개 물질의 형성은 포스포리파제 A2(phospholipase A2)의 활성으로 인해 아라키돈산(arachidonic acid)이 프로스타글라딘(prostagladin)으로 바뀌는 과정 및 질소산화물(NO)형성 과정으로 이어지게된다.

질소산화물(Nitric oxide, NO)은 산화질소 합성효소(NOS)에 의해 L-arginine으로부터 생성되는 무기유리체로 면역반응, 세포독성, 신경전달계 및 혈관이완 등 여러 가지 생물학적인 과정에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 농도에 따라 세포 기능유지에 중요한 작용을 하기도 하고 세포독성을 일으키기도 한다.

NO를 생산하는 NOS는 세포내에 존재하여 칼슘이나 칼모듈린(calmodulin)에 의존적인 형태인 비유발성 NOS(constitutive NOS, cNOS)와 칼슘에 비의존적으로 대식세포나 혈관내피세포가 활성화되거나, 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)와 같은 세균의 내독소나 여러 가지 사이토킨(cytokine)에 의해 유도되는 형태인 유발성 NOS(inducible NOS, iNOS)의 형태가 있다.

LPS 자극에 의해 발현된 iNOS는 많은 양의 NO를 생성하게 되며 이에 의한 세포독성은 염증반응, 세포의 돌연변이 및 종양 발생 등에도 관여하는 것으로 알려져 있다. 염증반응과 관련된 조직 손상에서 NO와 iNOS의 생성이 증가되어 있음이 보고되어 있다.

이에 본 실험은 애기달맞이추출물의 뮤린 마크로파지 세포(murine macrophage cell line RAW264.7)로부터의 LPS 자극에 의한 NO의 형성억제 효과 및 그 독성정도를 확인해보았다.

1. 세포 배양

마우스 대식세포주인 RAW264.7 세포는 한국유전자은행(Korean Cell Line Bank)로 부터 분양 받아 100 units/㎖ 페니시린-스트렙토마이신(penicillin- streptomycin)과 10 % 우태혈청(fetal bovine serum, FBS)이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37 ℃, 5 % CO₂ 항온기에서 배양하였으며, 계대 배양은 3 ~ 4 일에 한번씩 시행하였다.

지질다당류(Lipopolysaccharide, LPS. E. coli serotype 0111:B4)는 Sigma사로부터 구입하여 실험에 사용하였다.

2. LDH 세포독성 검색

젖산탈수소효소(Lactate dehydrogenase, LDH)는 대부분의 세포에 존재하는 안정적인 세포질효소(stable cytoplasmic enzyme)로서 원형질막이 손상을 입으면 세포배양액으로 방출된다.

본 실험에서는 손상을 입은 세포가 방출하는 LDH 활성을 측정하는 비색분석법(colorimetric assay)을 사용하였다.

즉, RAW264.7 세포를 1.0×10⁵ cells/㎖의 농도로 48 well plate의 각 well에 넣고 24 시간 동안 배양 후, 시료를 농도별로 첨가하여 세포배양이 끝난 후, LDH 세포독성 검색키트(LDH cytotocixity detection kit,Promega)를 사용하여 492 ㎚에서 효소활성을 측정하였다.

3. NO 생성 억제률 검색

RAW264.7 세포를 10 % FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1.0× 10⁵cells/㎖로 조절한 후 48 well plate 에 접종하고, 시험물질과 LPS(1 ㎍/㎖)를 동시에 처리하여 24 시간 배양하였다.

생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO₂ ^-의 형태로 측정하였다.

세포배양 상등액 100㎕와 Griess시약 [1% (w/v) sulfanilamide, 0.1% (w/v) naphylethylenediamine in 2.5% (v/v) phosphoric acid] 100 ㎕를 혼합하여 96 well plates에서 10 분동안 반응시킨 후 530 nm에서 흡광도를 측정하였다.

생성된 NO의 양은 sodium nitrite (NaNO₂)를 표준으로 비교하였다.

4. 항염활성 실험결과

애기달맞이 에탄올추출물의 RAW264.7 에서의 세포독성이 나타나지 않는 농도로 추출물을 처리하여 NO 생성 억제효과를 세포 배양액 중에 존재하는 NO₂ ^-의 형태로 측정한 결과, LPS 단독 처리군에서는 NO가 과량 생성되는 것을 확인할 수 있었으며, 애기달맞이 추출물을 동시에 처리한 시험구에서는 NO 생성량이 감소됨을 확인할 수 있었고, 특히 헥산과 디클로로메탄, 에틸아세테이트 분획물에서 NO의 생성량이 현저히 저해됨을 볼 수 있었다(도 2).

그러나, 애기달맞이 에탄올추출물에서는 RAW264.7 에서의 세포독성이 거의 나타나지 않았지만, 에틸아세테이트 분획물에서는 세포독성이 강하게 나타났다.

<실험예 4> 본 발명의 애기달맞이 추출물에 대한 항암활성 실험

1. 세포배양

급성 전골수성 백혈병 환자에서 유래한 HL-60 세포주를 한국 세포주 은행(KCLB)으로부터 분양 받아 100 units/㎖의 페니실린-스트렙토마이신 (penicillin-streptomycin, GIBCO)과 10 %의 우태혈청(FBS, GIBCO)이 함유된 RPMI 1640 배지(GIBCO)를 사용하여 37 ℃, 5 % CO₂ 항온기에서 배양하였으며, 계대 배양은 3 ~ 4 일에 한번씩 시행하였다.

2. 세포의 대사활성 측정

HL-60 세포에 대한 증식억제는 세포의 대사활성을 측정하여 알아보았다.

HL-60 세포 (2.0× 10⁵/㎖)를 96 well plate의 각 well에 넣고, 시료를 농도별로 첨가하였다.

이를 3 일간 배양한 다음, 3-(4,5-dimehtylthiazol)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, Sigma) 100 ㎍을 첨가하고 4 시간 동안 더 배양하였다.

플레이트를 1,000 rpm에서 10 분간 원심분리하고 조심스럽게 배지를 제거한 다음, 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide, DMSO, Sigma) 150 ㎕를 가하여 MTT의 환원에 의해 생성된 포마즌 침전물을 용해시킨 후 마이크로플레이트 리더 (microplate reader, Bio-TEK instrumenis. USA)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 성장억제정도를 조사하였다.

3. DNA 단편화(DNA fragmentation) 분석

HL-60 세포 (3.5× 10⁵/㎖)에 시료를 처리하여 배양이 끝난 후 세포를 수집하여 Promega Wizard^ⓡ게놈 DNA 정제키트(Genomic DNA Purification Kit)를 이용하여 DNA를 분리하였다.

분리한 DNA를 1.5% 아가로스 겔에서 30 분(100 V)동안 전기영동을 한 다음 EtBr(ethidium bromide)로 염색하고 자외선 투사조명기(UV transilluminator)하에서 DNA 단편화 현상을 관찰하였다.

4. 핵의 형태학적 변화(Morphological changes) 측정

세포사멸의 형태학적 특징 중의 하나인 핵의 변화를 관찰하기 위해 HL-60 세포 (3.5× 10⁵/㎖)에 시료를 처리하여 배양이 끝나기 30 분전에 DNA 특이적으로 결합하는 생체 형광 염색액인 H33342를 사용하여 DNA를 염색하고 형광현미경으로 관찰하였다.

5. 세포주기 분석(Cell cycle analysis)

HL-60 세포 (3.5× 10⁵/㎖)에 시료를 처리하여 시간별로 배양한 후, HL-60 세포를 수확하여 PBS로 세척하였다.

HL-60 세포를 -20 ℃에서 70 % 에탄올로 30분 동안 고정시킨 후, PBS로 세척하고, RNase A를 처리한 다음 요오드화 프로피디엄(propidium iodide, Sigma)으로 염색하고, 유동세포분석기(BD FACSCalibur flow cytometer, BD, USA)로 세포주기를 분석하였다.

6. 항암활성 실험결과

애기달맞이 추출물 및 용매분획물의 HL-60 세포의 성장에 대한 효과는 테트라졸리움 염(tetrazolium salt)의 하나인 MTT를 사용하여 MTT의 환원에 의해 생성되는 포마즌의 흡광도로 측정하였다.

그 결과, 애기달맞이 80 % 에탄올추출물의 IC₅₀ 값은 72.848 ㎍/㎖를 보였으며, 헥산 분획물은 47.72 ㎍/㎖, 디클로로메탄 12.40 ㎍/㎖, 에틸아세테이트 43.03 ㎍/㎖로 나타났다.

에틸아세테이트 분획물을 여러 농도로 처리하였을 때의 세포성장 억제율은 12.5 ㎍/㎖ 농도에서 22.00 ± 6.97 %, 25 ㎍/㎖ 농도에서 30.44 ± 2.83 %, 50 ㎍/㎖ 농도에서 54.92 ± 6.35 %, 100 ㎍/㎖ 농도에서 77.67 ± 2.29 %로 유의적인 세포성장 억제효과를 보였다(표 2).

이 중 디클로로메탄 분획물은 처리 농도가 가장 낮은 12.5 ㎍/㎖에서도 세포 독성이 너무 강한 탓에 세포성장 억제율이 IC₅₀ 값보다 높게 나와 유의적인 데이터를 얻지 못하였다.

<표 2> HL-60 세포에서의 애기달맞이 추출물에 대한 세포독성 결과

처리 (㎍/㎖)	성장 억제율(%)				IC₅₀ (㎍/㎖)
처리 (㎍/㎖)	12.5	25	50	100	IC₅₀ (㎍/㎖)
80 % 에탄올	10.44±7.32	22.12±7.33	34.57±5.15	56.63±5.99	72.84
헥산분획물	35.36±3.19	36.39±3.94	45.51±5.16	75.42±3.46	47.72
디클로로메탄	51.11±5.58	50.13±5.18	69.00±2.29	82.34±1.37	12.40
에틸아세테이트	22.00±6.97	30.44±2.83	54.92±6.35	77.67±2.29	43.03
부탄올분획물	3.58±1.13	4.65±4.84	14.19±4.52	42.58±9.57	NA^*
물층	0.67±6.60	6.78±6.41	0.75±5.88	5.29±4.90	NA

* 상기 데이터는 3회 반복실험한 값의 표준편차를 나타냄

* NA : 적용되지 않음

애기달맞이 용매분획물의 세포독성효과에 의한 HL-60 세포 증식억제 작용이 세포사멸(apoptosis) 유도에 의한 것인지 그 기전을 알아보기 위하여, 세포사멸 유도에 의하여 나타나는 DNA 단편화 현상을 전기영동으로 관찰하였다.

그 결과, 애기달맞이 에틸아세테이트 분획물은 HL-60 세포에 100 ㎍/㎖의 농도로 처리시 DNA 단편화 현상이 두드러지게 나타났다(도 3).

그 결과, 정상세포들의 핵들의 형태는 정상적인 둥근형태이나 에틸아세테이트 추출물이 처리된 세포에서는 시간이 경과될 수록 세포의 크기가 축소되며, 핵의 모양이 불규칙하고 부분적인 핵의 응집현상을 관찰할 수 있었다(도 5). 또한, 애기달맞이 추출물에 의한 세포사멸 유도에 의하여 Sub-G1 이배수성(hypodiploid) 세포가 증가하는지 DNA에 결합하여 형광을 나타내는 물질인 PI를 처리하여 유세포분석기로 분석하였다.

세포사멸 기전에 대하여는 확실하게 증명된 바는 없지만 세포질 내 칼슘치가 증가되어 칼슘의존성 핵산중간가수분해효소(endonuclease)가 활성화되어 핵내 DNA 분절이 일어나며, 단백질연결효소(transglutaminase)가 활성화되어 세포질내 단백질의 가교반응(cross-linking)이 일어나면서 세포질 농축이 일어나고 수액이 세포밖으로 빠져나가면서 세포사멸체(apoptotic bodies)를 형성하는 것으로 알려져 있다.

<실험예 5> 본 발명의 애기달맞이 추출물에 대한 항균활성 실험

1. 사용균주 및 배지준비

애기달맞이 추출물에 대한 항균활성을 식중독을 일으키는 균주를 그램 양성 균 3종과 그램 음성균 3종으로 총 6 종의 균주를 사용하였다(표 3).

배지는 Tryptic soybean agar(TSA), Tryptic soybean broth(TSB), Brain heart infusion는 Difco(USA)사의 제품을 사용하였다.

<표 3> 항균활성 실험을 위한 균주 및 배지 리스트

	균주명	배지	온도(℃)
그램 양성균	Bacillus cereus	TSA/TSB	30
	Listeria monocytogenes	BHI	37
	Staphylococcus aureus	TSA/TSB	37
그램 음성균	Escherichia coli	TSA/TSB	37
	Salmonella enteritidis	TSA/TSB	37
	Salmonella trphimurium	TSA/TSB	37

2. 항균력 측정

본 발명의 애기달맞이 추출물의 항균성 물질을 검색하기 위해 본 실험에서는 페이퍼 디스크 방법(16)으로 식품 유해미생물을 적용시켜 항균활성을 측정하였다(표 3).

즉, 각 균주 1 백금이를 취하여 10 ㎖의 배양액(broth)에 접종하고 표 2에 기재된 최적온도에서 18 시간 동안 배양하였다.

배양한 세균을 분광분석기(Spetrophotometer, Ultrospec 2100 pro, Amersham Biosciences, USA)를 사용하여 650 nm에서 광밀도(optical density) 값 0.4 (10⁶ CFU/㎖)로 흡광도를 조절하고, 주가평판법(pour-plate)에 따라 배지가 분주된 배양 접시에 균일하게 섞은 후 실온에서 굳혔다.

이 배지 위에 멸균된 페이퍼 디스크(paper disc)를 시료 수에 맞게 올리고 밀착시킨 후 각각의 시료를 2,000 ppm, 1,000 ppm, 500 ppm, 250 ppm, 그리고 100 ppm으로 흡수 시켰다.

대조구는 80 % 에탄올을 실험군과 동일한 방법으로 점적하였다.

최적온도에서 24 시간 배양한 후 디스트 주변에 생성된 생육저해환(clear zone, mm)의 크기를 측정하여 항균 활성 정도를 비교 분석하였다.

3. 농도별 미생물 생육저해율 측정

애기달맞이가 미생물에 미치는 생육저해율 측정은 TSB 배지 10 mL 에 추출물 및 분획물을 membrane 여과(filter)로 제균시키고, 액체배지에 각 분획물을 2,000 ppm 농도별로 첨가하였다.

여기에 O.D 값이 0.4가 될 때까지 키운 세균 배양액 10 ㎕를 접종하여 shaking 인큐베이터(120 rpm)를 이용하여 37 ℃에서 24 시간 배양하여 마이크로플레이트 리더(microplate reader, Bio-TEK instrumenis. USA)를 통해 650 nm에서 측정하였다.

다음 식으로 생육저해율(%)을 확인하였다.

4. 항균활성 실험 결과

본 발명의 애기달맞이 추출물에 대한 항균활성 실험 결과, 그램 양성균에서는 80 % 에탄올 추출물, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물 분획물에서 처리농도가 증가할수록 항균활성을 나타내는 억제환(inhibition zone)의 크기도 비례적으로 증가하였으며, 특히 에틸아세테이트 분획물의 경우 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에서 2,000 ppm 농도에 18 mm의 생육저해환이 나타나 다른 추출물보다 높은 항균력을 나타냈다(도 6).

일반적으로 식물의 에틸아세테이트 분획물에는 사포닌성분, 유기산류, 탄닌당, 배장체 및 기타 알칼로이드류가 주로 용출되는 것으로 알려져 있다.

그 결과, 에탄올 추출물은 본 실험에서 사용된 모든 균주에 대해 약 25 ~ 53 % 정도의 생육저해 효과를 나타내었고, 특히 살모넬라 엔테리티디스 균(Salmonella enteritidis)에 대해 53.8 %로 가장 높은 저해율을 나타내었다(도 8).

<표 4> 그램 양성균에 대한 애기달맞이추출물의 항균활성 실험결과

균주명	생육저해환(clear zone)의 직경(mm)
균주명	농도 (ppm)	에탄올 추출물	헥산 분획물	디클로로메탄 분획물	에틸아세테이트 분획물	부탄올 분획물	물 분획물
B. cereus	100	-	-	-	9	10	-
	250	9	-	-	10	11	-
	500	11	-	-	13	11	9
	1000	13	-	-	16	13	11
	2000	15	-	-	18	13	12
L.monocytogenes	100	-	-	-	11	9	-
	250	9	-	-	12	11	-
	500	11	-	-	12	12	9
	1000	12	-	-	13	12	10
	2000	15	-	-	14	13	10
S.aureus	100	-	-	-	11	10	-
	250	9	-	-	12	12	-
	500	11	-	-	13	13	9
	1000	13	-	-	15	14	11
	2000	15		-	18	14	12

<표 5> 그램 음성균에 대한 애기달맞이추출물의 항균활성 실험결과

균주명	생육저해환(clear zone)의 직경(mm)
균주명	농도 (ppm)	에탄올 추출물	헥산 분획물	디클로로메탄 분획물	에틸아세테이트 분획물	부탄올 분획물	물 분획물
E. coli	100	2	-	-	9	10	--
	250	9	-	-	10	11	-
	500	11	-	-	12	12	9
	1000	13	-	-	15	13	11
	2000	16	-	-	17	14	12
S. enteritidis	100	8	-	-	11	9	-
	250	9	-	-	12	11	-
	500	11	-	-	13	12	9
	1000	12	-	-	15	14	11
	2000	15	-	-	15	17	13
S. trphimurium	100	-	-	-	11	10	-
	250	9	-	-	12	12	-
	500	11	-	-	13	13	9
	1000	12	-	-	16	14	11
	2000	15	-	-	19	14	12

본 발명에 의해 항산화활성, 항염활성, 항암활성 및 항균활성의 생리활성이 뛰어난 애기달맞이 추출물이 제공된다.

또한, 본 발명에 의해 생리활성이 뛰어난 애기달맞이 추출물을 활성성분으로 포함하는 질병예방 및 개선을 위한 조성물이 제공된다.

Claims

애기달맞이(Oenothera laciniata)를 에탄올로 추출한 후, 이를 극성이 다른 용매인 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올을 이용하여 순차적으로 추출하여 제조한 애기달맞이 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물.
애기달맞이를 에탄올로 추출한 후, 이를 극성이 다른 용매인 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올을 이용하여 순차적으로 추출하여 제조한 애기달맞이 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염용 조성물.
애기달맞이를 에탄올로 추출한 후, 이를 극성이 다른 용매인 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올을 이용하여 순차적으로 추출하여 제조한 애기달맞이 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물.