CN104055838B - 一种核桃青皮多酚的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种核桃青皮多酚的提取方法，通过选取新鲜核桃为原料，采用机械去皮法得到核桃青皮，经漂烫后自然晒干、粉碎后过40目筛，将经干燥粉碎过筛后的核桃青皮粉按液料比21:1(mL:g)加入纯净水，置于超声波提取设备中，采用超声波辅助提取工艺，超声功率670W，加热温度57℃，单次超声时间5s，超声间隙时间5s，超声全程时间25min，搅拌速度400r/min。多酚得率可以高达55.473mg/g，本发明在核桃青皮多酚生产中具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及果品多酚提取制备技术领域，具体的说，本发明涉及一种从核桃青皮中提取多酚的制备工艺的技术领域。
背景技术
核桃是胡桃科核桃属多年生落叶乔木，在中国其主要分布在新疆、云南、河北、山东等省份。核桃青皮，又名青龙衣，是核桃的未成熟外果皮。现代研究表明，核桃青皮含有丰富的多酚类物质，具有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、抑菌等活性。
新疆核桃栽培面积280万亩，年产干果核桃24万吨， 核桃青皮年产量在36万吨左右，由于没有进一步开展加工利用，大量废弃的青皮堆放在田间、地头或沟边，不仅会造成资源的极大浪费，还会严重污染生态环境，危及动植物的生存。目前在核桃属植物多酚类物质研究的应用中仍处于初级阶段，因此研究以核桃青皮为原料提取多酚工艺技术，对核桃产业链的发展、实现废弃物才综合利用具有重要意义。
发明内容
针对现有未见有关针对核桃青皮中提取多酚的技术现状,本发明旨在提供一种核桃青皮多酚的提取方法，本发明围绕核桃生产过程中产生的大量核桃青皮综合利用的技术问题，获得核桃青皮多酚物质提取的生产工艺，为工业化生产核桃青皮多酚物质提供技术支撑，以解决新疆核桃产业发展中的综合利用问题，对延长产业链，提升核桃的精深加工与综合利用水平、提高核桃加工品的附加值方面都具有重要的意义和价值。
本发明通过以下技术方案实现的。
本发明以经预处理干燥的核桃青皮为原料，利用响应面法优化超声波辅助提取多酚的工艺条件，通过将核桃青皮漂烫、自然晒干、粉碎,与纯净水混合置于超声波提取设备中在不同工艺条件下进行提取，在单因素试验的基础上，选择对多酚得率影响较为显著的超声波功率、加热温度、液料比三个因素为自变量，以多酚得率为响应值,进行Box-behnken试验和响应面分析，得出最佳工艺条件为：超声波功率670W，加热温度57℃，液料比21:1(mL:g)，单次超声时间5s，超声间隙时间5s，超声全程时间25min，搅拌速度400r/min，在获得的工艺条件下，多酚得率可以高达55.473mg/g，工艺参数可操作性强、可以用于核桃青皮多酚物质的提取。
本发明具体提供一种核桃青皮多酚的提取方法，具体提取方法如下：
选取新鲜核桃为原料，采用机械去皮法得到核桃青皮，经漂烫、自然晒干后粉碎过40目筛，将经干燥粉碎过筛后的核桃青皮粉按液料比21:1(mL:g)加入纯净水，置于超声波提取设备中，采用超声波辅助提取核桃青皮多酚，工艺参数为超声功率670W，加热温度57℃，，单次超声时间5s，超声间隙时间5s，超声全程时间25min，搅拌速度400r/min。
本发明采用的核桃青皮的预处理、超声波辅助提取等技术手段尽管离不开现有技术的支持和启发，但是对于多酚的提取，特别是对于针对核桃青皮原料中多酚的提取、为提高核桃青皮中多酚的保存率而采用热风干燥、自然晒干、漂烫后65℃热风干燥、漂烫后自然晒干等多种核桃青皮不同的干制方法、选择适合核桃青皮多酚提取的合适的超声波辅助提取工艺,对于决定多酚的提取率的高低、提取的效率都具有重要的作用，也是决定性因素，不能说采用的技术手段和工具是现有技术，进而否定本发明提供的整体核桃青皮多酚的提取方法的创新性，现有所有技术发明和创新离不开现有技术的支撑和基础。可见，本发明提供的核桃青皮多酚的提取方法中各技术因素和技术参数都经过综合考量和设计，本发明提供的核桃青皮多酚的提取方法中各技术环节具有上下一体，任何技术步骤不可或缺，紧密不可分割的特点，不能任何取舍肢解其中的技术步骤。
本发明的目的围绕核桃生产过程中产生的大量核桃青皮综合利用的技术问题，获得核桃青皮多酚物质提取的生产工艺参数，采用对核桃青皮进行漂烫处理以钝化氧化酶活性防止多酚物质的氧化、提高核桃青皮多酚保存率的预处理方法使得核桃青皮中多酚的含量大大提高，本发明所使用的超声波辅助提取工艺，是将聚能式和发散式超声波相结合并循环作用于物料，即聚能式、发散式超声场固定分布，在搅拌作用下使物料循环依次通过超声场，从而最大限度提高了超声场的利用率，解决了静止物料在超声提取时作用范围有限的问题，增加了超声场的物料处理量，提高了效率。以纯净水为提取溶剂时提取率高达55.473mg/g，且以水为提取溶剂具有成本低廉、安全、无污染等优点。
通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下效果：
本发明通过对核桃青皮进行预处理、采用超声波辅助提取工艺、以多酚得率为响应值进行Box-behnken试验和响应面分析优化核桃青皮多酚提取的工艺参数，得出最佳工艺条件，在获得工艺条件下多酚得率可以高达55.473mg/g，该方法在核桃青皮多酚生产中具有较好的应用前景。
附图说明
图1显示为不同干制方法对多酚保存率的影响图。
图2 显示为搅拌速度对多酚得率的影响图。
图3显示为超声间隙时间对多酚得率的影响图。
图4显示为超声全程时间对多酚得率的影响图。
图5显示为超声波功率对多酚得率的影响图。
图6显示为温度对多酚得率的影响图。
图7显示为液料比对多酚得率的影响图。
图8显示为超声波功率和加热温度的交互作用响应曲面图。
图9显示为超声波功率和液料比的交互作用响应面图。
图10显示为加热温度和液料比的交互作用响应面图。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。另外，在下述各实施例的试验描述中，无特别说明，％皆指质量百分比，即按m/m计。
仪器设备：AL204-IC型电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SB-2000型数控恒温水浴锅，上海爱朗仪器有限公司；TU-1810紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；Anke LXJ-ⅡB 离心机，上海安亭科学仪器厂；CTXNW-2B超声循环提取机，北京弘祥隆生物技术开发有限公司。
原料采用核桃青皮采摘自新疆阿克苏市乌什县，经漂烫、自然晒干后密封包装、避光保存，使用时粉碎过40目筛；试剂采用没食子酸，无水碳酸钠，钨酸钠，钼酸钠，硫酸锂，溴水，浓磷酸，浓盐酸，均为分析纯。
本发明中选用的所有试剂、仪器、原辅材料都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
实施例一：核桃青皮多酚的提取
核桃青皮多酚的提取的具体方法如下。
（1）核桃青皮原料的制备：选取新鲜核桃为原料，采用机械去皮法得到核桃青皮，分别经45℃、50℃、55℃、60℃、65℃热风干燥、自然晒干、漂烫后65℃热风干燥、漂烫后自然晒干8种干制方法干制后避光保存。多酚含量测定：将干燥的核桃青皮粉碎后过40目筛，采用30%乙醇、液料比25:1（mL/g）,提取温度50℃、提取时间1h的条件进行多酚的提取和含量的测定，以考察不同干制方法对多酚保存率的影响。结果为：8种干制方法干燥后的多酚含量由高到低的顺序为：漂烫后65℃热风干燥﹥漂烫后自然晒干﹥45℃热风干燥﹥65℃热风干燥﹥60℃热风干燥﹥55℃热风干燥﹥自然晒干﹥50℃热风干燥，与新鲜核桃青皮的多酚含量（85.03mg/g（干基））相比，其损失率分别为 34.25%、34.32%、37.61%、38.06%、39.07%、40.39%、42.9%、43.12%。同时可知经漂烫后65℃热风干燥与漂烫后自然晒干的相比多酚的损失率相差较小，且热风干燥能耗高，故经漂烫后采用自然晒干的方法是节能且适宜规模化生产的最优方法，所以选择漂烫后自然晒干的方法干燥核桃青皮，参见附图1。
（2）将经干燥粉碎后的核桃青皮粉末固定液料比20:1（mL:g）计加入纯净水，置于超声波提取设备中，采用超声波辅助提取工艺进行多酚物质的提取。
（3）核桃青皮多酚提取的单因素试验：固定单次超声时间5s,考察搅拌速度、超声间隙时间、超声全程时间、超声波功率、加热温度、液料比等6个因素对核桃青皮多酚得率的影响。
分别设置搅拌速度为0r/min、400r/min、600r/min、800r/min、1200r/min、1600r/min，固定液料比20:1（mL:g）,超声波功率600W，加热温度60℃，单次超声时间5s，超声间隙时间5s，超声全程时间15min，考察不同搅拌速度对核桃青皮多酚得率的影响。
通过分别设置超声间隙时间1s、3s、5s、7s、9s，固定液料比20:1（mL:g）, 超声波功率600W，搅拌速度400r/min，加热温度60℃，单次超声时间5s，超声全程时间15min，考察不同超声间隙时间对核桃青皮多酚得率的影响。
通过分别设置超声全程时间为10min、15min、20min、25min、30min，固定液料比20:1（mL:g）, 超声波功率600W，搅拌速度400r/min，加热温度60℃，单次超声时间5s，超声间隙时间5s，考察不同超声全程时间对核桃青皮多酚得率的影响。
通过分别设置超声波功率200W、400W、600W、800W、1000W，固定液料比20:1（mL:g），搅拌速度400r/min，加热温度60℃，单次超声时间5s，超声间隙时间5s，超声全程时间15min，考察不同超声波功率对核桃青皮多酚得率的影响。
通过分别设置加热温度 40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，固定液料比20:1（mL:g）,超声波功率600W，搅拌速度400r/min，单次超声时间5s，超声间隙时间5s，超声全程时间15min，考察不同温度对核桃青皮多酚得率的影响。
通过分别采用液料比10:1、15:1、20:1、25:1、30:1（mL:g）, 加热温度60℃，超声波功率600W，搅拌速度400r/min，单次超声时间5s，超声间隙时间5s，超声全程时间15min，考察不同液料比对核桃青皮多酚得率的影响。
（4）响应面试验：根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理，选择加热温度、超声波功率、料液比对核桃青皮多酚得率影响显著的三个因素，在单因素试验的基础上进行响应面试验设计对超声波辅助提取核桃青皮多酚的工艺条件进行优化，得到超声波辅助提取核桃青皮多酚的最佳工艺参数为：超声波功率670W，加热温度57℃，液料比21:1(mL:g)，单次超声时间5s，超声间隙时间5s，超声全程时间25min，搅拌速度400r/min。
由上可见，本发明采用的核桃青皮多酚的提取方法，通过选取新鲜核桃为原料，采用机械去皮法得到核桃青皮，经漂烫后采用自然晒干，粉碎后过40目筛，将经干燥粉碎过筛后的核桃青皮粉按比例加入纯净水，置于超声波提取设备中，采用超声波辅助提取工艺，超声功率670W，加热温度57℃，液料比21:1(mL:g)，单次超声时间5s，超声间隙时间5s，超声全程时间25min，搅拌速度400r/min。
实施例二：核桃青皮多酚提取的单因素试验
基于上述实施例，采用的核桃青皮多酚的提取方法，通过选取新鲜核桃为原料，采用机械去皮法得到核桃青皮，经漂烫后采用自然晒干，粉碎后过40目筛，将经干燥粉碎过筛后的核桃青皮粉按比例加入纯净水，置于超声波提取设备中，经超声波辅助提取工艺，具体工艺参数验证单因子试验如下。
在固定单次超声时间5s，分别以0r/min、400r/min、600r/min、800r/min、1200r/min、1600r/min不同的搅拌速度，以200W、400W、600W、800W、1000W不同的超声波功率，以1s、3s、5s、7s、9s不同的超声间隙时间，以10min、15min、20min、25min、30min不同的超声全程时间，以40℃、50℃、60℃、70℃、80℃不同的加热温度，以10:1、15:1、20:1、25:1、30:1不同的液料比（mL:g）等因素进行单因素试验，以研究不同因素对核桃青皮多酚得率的影响。
结果与分析：
1.1 搅拌速度对多酚得率的影响：参见附图2可知，当搅拌速度为400r/min时多酚得率最高为44.13mg/g，故选择400r/min作为最佳搅拌速度。
1.2 超声间隙时间对多酚得率的影响：参见附图3可知，多酚得率随着超声间隙时间的延长总体呈先上升后下降的趋势，在超声间隙时间为5s时多酚得率最高为42.65mg/g。故选择最佳超声间隙时间为 5s。
1.3 超声全程时间对多酚得率的影响：参见附图4可知，在超声全程时间为25min时多酚得率最高为42.89mg/g，随着时间的继续延长多酚得率反而下降，这有可能是部分多酚氧化所致。故选择最佳超声全程时间为25min。
1.4 超声波功率对多酚得率的影响：参见附图5可知，多酚得率随超声波功率的升高总体呈先上升后下降的趋势，且在超声波功率为600W时多酚得率最高为48.73mg/g。这是由于随着超声波功率的增加，空化作用增强，加速了细胞的破碎，从而提高了多酚的得率；但当超声波功率超过600W时，可能是由于一些大分子物质的溶出会阻碍多酚的溶出，反而会降低多酚的得率。故选择最佳超声波功率为600W。
1.5 温度对多酚得率的影响：参见附图6可知，多酚得率随温度的升高而增加，且在50℃～60℃之间增加趋势明显，随着温度的继续升高，多酚得率增加相对较缓慢，且温度升高所需能耗也会相应增加。综合考虑选择最佳温度为60℃，此时多酚得率为43.93mg/g。
1.6 液料比对多酚得率的影响：参见附图7可知，当液料比小于20:1（mL：g）时，多酚得率随液料比增加而增加，但当液料比大于20:1（mL：g）时，多酚得率基本保持不变。故选择最佳液料比为20:1（mL：g），此时多酚得率为42.52mg/g。
结论：综上可见，通过分析搅拌速度、超声间隙时间、超声全程时间、超声波功率、加热温度、液料比多个因素中不同参数对多酚得率影响的变化趋势认为超声波功率、加热温度、液料比三个因素对多酚得率的影响较为显著，因此后续试验中固定单次超声时间5s，超声间隙时间5s 、超声全程时间25min、搅拌速度400r/min后进一步研究超声波功率、加热温度、液料比三个因素间的交互作用，以得到超声波辅助提取核桃青皮多酚的最佳工艺参数。
实施例三：核桃青皮多酚的响应面试验
通过上述实施例二单因素试验可知，超声波功率、加热温度、液料比三个因素对多酚得率影响较为显著。因此选择超声波功率、加热温度、液料比三个因素，以多酚得率为响应值进行Box-behnken试验，见表1所示，利用Design Expert8.0.5.b软件进行数据分析，以优化超声波辅助提取核桃青皮多酚的工艺参数。
表1 响应面因素水平编码表
1.1响应面结果分析：
表2 Box-benhnken实验设计结果
表3 响应面二次模型的方差分析
| 方差来源 | 平方和 | 自由度 | 均方 | F值 | P值 | 显著性 |
| 模型 | 674.16 | 9 | 74.91 | 45.78 | ＜0.0001 | ** |
| A | 42.49 | 1 | 42.49 | 25.96 | 0.0014 | ** |
| B | 157.30 | 1 | 157.30 | 96.13 | ＜0.0001 | ** |
| C | 8.16 | 1 | 8．16 | 4.99 | 0.0607 | |
| AB | 6.99 | 1 | 6.99 | 4.27 | 0.0776 | |
| AC | 0.071 | 1 | 0.071 | 0.044 | 0.8407 | |
| BC | 10.49 | 1 | 10.49 | 6.41 | 0.0391 | * |
| A2 | 66.25 | 1 | 66.25 | 40.49 | 0.0004 | ** |
| B2 | 309.75 | 1 | 309.75 | 189.3 | ＜0.0001 | ** |
| C2 | 36.77 | 1 | 36.77 | 22.47 | 0.0021 | ** |
| 残差 | 11.45 | 7 | 1.64 | |||
| 失拟向 | 0.35 | 3 | 0.12 | 0.042 | 0.9868 | |
| 纯误差 | 11.10 | 4 | 2.78 | |||
| 总和 | 685.61 | 16 |
注：**表示极显著；*表示显著
通过回归分析，得到多酚得率的三元二次回归方程：
Y=54.82 +2.30 A－4.43 B+1.01 C－1.32 AB +0.13AC－1.62BC－3.97 A2－8.58 B2－2.96 C2
由表3可知，回归模型极显著，模型的相关系数R2=0.9833。失拟项不显著，说明该回归方程与实验的拟合度较高。其中，A、B、A2、B2、C2极显著，BC显著。由此可知，各因素对多酚得率的影响不是呈简单的线性关系，它们之间是有交互作用的。各因素交互作用的影响参见附图8至附图10，由附图8至附图10可以直观的看出，各因素对多酚得率影响程度的大小顺序为：B＞A＞C，即：加热温度＞超声波功率＞液料比。
1.2最优提取条件的确定
在选取的各因素范围内，利用Design Expert8.0.5.b软件进行分析，得出超声波辅助提取核桃青皮多酚的最佳工艺条件为：超声波功率669.34W，加热温度56.91℃，液料比21.32:1(mL:g)；在此条件下，多酚得率的理论值为56.039mg/g。为检验所得结果的可靠性，采用上述优化条件进行多酚的提取，考虑到实际操作的可能性和方便性，将工艺条件调整为：超声波功率670W，加热温度57℃，液料比21:1(mL:g)，实际测得多酚得率为55.473mg/g，与预测值很接近，说明该模型与实际情况比较吻合，具有良好的可操作性。
结论：通过对搅拌速度、超声间隙时间、超声全程时间、超声波功率、加热温度、液料比进行单因素试验可知，加热温度、超声波功率、液料比三个因素对多酚得率影响较为明显。故选择这三个因素进行响应面试验，利用Design Expert软件对进行数据分析，得出超声波辅助提取核桃青皮多酚的最佳工艺条件为：超声波功率670W，加热温度57℃，液料比21:1(mL:g)，单次超声时间5s，超声间隙时间5s，超声全程时间25min，搅拌速度400r/min。在此条件下，多酚得率的理论值为56.039mg/g，验证试验实际测得多酚得率为55.473mg/g，与单因素试验相比大大提高了多酚得率，因此响应面试验有效地优化了超声波辅助提取核桃青皮多酚的工艺参数。
实施例四：多酚标准曲线的绘制
精确称取0.2500g没食子酸，用蒸馏水溶解后定容到1000mL。再分别准确移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mL到25mL容量瓶中，用蒸馏水定容。其浓度分别为10、20、30、40、50、60、70ug/mL。然后每个浓度梯度准确移取1mL至具塞比色管内，再每个比色管都分别加入1mLFC试剂，5mL蒸馏水，3mL12.5%的Na2CO3溶液，30℃水浴条件下反应1h后在764nm下测定其吸光度。
以没食子酸浓度为X轴、吸光度为Y轴建立的标准曲线,得到标准曲线方程为Y=0.0128X+0.016，当没食子酸浓度在10ug/mL -70ug/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系（R2=0.9998）。
实施例五：核桃青皮多酚得率的测定
将经提取后的样品液在4500r/min转速下离心10min,准确移取1mL上清液进行100稀释。再准确移取1mL稀释液至具塞比色管内，按照标准曲线绘制的方法进行多酚浓度测定，然后计算出样品中多酚的得率。计算方程如下：
多酚得率（mg/g）=
计算方程中：C为根据标准曲线测得的样品中多酚的质量浓度（ug/mL）；N为稀释倍数；V为提取液体积（mL）； m为样品质量（g）。
以上阐述本发明中的实施例，并不是对本发明作其它形式上了的限制，本专业的人员可以对上述阐述的技术内容进行变更等效实施例。但是只要是没有脱离本发明技术方案内容，根据本发明的技术实质，只是对以上实例进行简单修改、等同变化与改型，仍然属于本发明技术的保护范围。
Claims (1)
1.一种核桃青皮多酚的提取方法，其特征在于，选取新鲜核桃为原料，采用机械去皮法得到核桃青皮，经漂烫后自然晒干、粉碎后过40目筛，将经干燥粉碎过筛后的核桃青皮粉按液料比21mL:1g加入纯净水，置于超声波提取设备中，采用超声波辅助提取工艺，超声功率670W，加热温度57℃，单次超声时间5s，超声间隙时间5s，超声全程时间25min，搅拌速度400r/min。
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