CN111675741A - 用制备液相法同时获得四种淫羊藿稀有黄酮的分离方法 - Google Patents
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Abstract
一种用制备液相法同时获得四种淫羊藿稀有黄酮的分离方法，包括如下步骤：步骤一：超声提取；步骤二：大孔吸附树脂柱层析；步骤三：真空浓缩；步骤四：高效制备液相色谱分离；步骤五：浓缩结晶；步骤六：干燥；步骤七：纯度检测。本发明和现有技术相对比，通过制备液相等步骤能提取分离出五种高纯度化合物单体，该种分离方法相对于其他分离方法工艺简单，操作方便，能同时分离，化合物单体纯度高、数量多，且均大于98.0％，对药品等的研究开发有很好的促进作用，并提高了对淫羊藿的利用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种用制备液相法同时获得四种淫羊藿稀有黄酮的分离 方法，属于生物医药技术领域。
背景技术
淫羊藿甙是来源于小檗科(Berberidaceae)淫羊藿属(Epimedium) 植物的一种大多含有异戊烯基的黄酮甙类化合物，研究表明淫羊藿 黄酮苷具有改善心脑血管系统功能、增强机体免疫力和促进DNA合 成等生理活性，以及强心、降血压、抗心律失常、增加脑血流量、 抑菌、抗病毒、抗炎、降血脂、抗肿瘤等多种作用，具有较高的药 用和保健价值。但是，目前对淫羊藿的开发研究还处于初级阶段， 对淫羊藿有效成分的研究尚不够深入。因此，利用我国淫羊藿的资 源优势，运用祖国传统医学经验与现代科学技术相结合，在其有效成分、制剂工艺、药理作用和临床应用等方面进行深入的研究，淫 羊藿有可能成为具有良好开发前景的增强免疫功能和免疫调节、抗 骨质疏松、治疗心脑血管疾病的优势药物，具有广阔的应用前景。 目前从淫羊藿中初分离淫羊藿总黄酮苷的方法有两大类。一类是采用溶剂萃取的方法进行初分离，此方法得到的是淫羊藿总黄酮苷的 粗品，且收率不高，还有有机溶剂残留会影响产品质量。另一类采 用大孔吸附树脂来分离，但其技术关键都是传统的吸附-解吸工艺， 操作过程跟踪检测困难，此方法也是只能得到淫羊藿总黄酮苷粗品。淫羊藿中黄酮苷类单体物质的分离鉴定文献中涉及到大量的采用正 相硅胶柱层析，凝胶柱层析，反相半制备HPLC分离的方法，其中正 相硅胶柱层析由于对苷类物质吸附强而使分离效果拖尾严重，分离 效果不佳，凝胶柱层析和反相半制备HPLC分离由于要用到昂贵的色谱级溶剂并且分离量小无法用于规模化分离。
发明内容
本发明所要解决的是通过大孔吸附树脂、制备液相分离及洗脱、结 晶及干燥等步骤分离出高纯度的化合物单体，该分离方法过程简单 可行、可控，提高了对淫羊藿利用价值的技术问题。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种用制备液相法同时获得四种淫羊藿稀有黄酮的分离方法，包括 如下步骤：
步骤一：超声提取
将淫羊藿药材粉碎，低碳醇溶液超声提取3次，每次超声时间20～ 60min，合并提取液，过滤，在-0.05～-0.1MPa真空中，40～80℃ 浓缩至无醇度；
步骤二：大孔吸附树脂柱层析
浓缩液加纯化水悬浮，加入到已经处理好的大孔吸附树脂层析柱里， 甲醇、水梯度洗脱，分段收取馏分；
步骤三：真空浓缩
馏分在-0.05～-0.1MPa真空中，40～80℃浓缩至小体积，加入甲醇 或者DMSO，使溶液澄清，得到待制备溶液；
步骤四：高效制备液相色谱分离
待制备溶液用0.45um有机膜过滤，制备液相色谱柱用初始流动相平 衡色谱柱20min，每次进样5ml，用25～60％纯度的乙腈-酸水梯度 洗脱，并用紫外检测器实时监控，按照各自不同的保留时间收集四 个组份的洗脱液，峰出完后按照初始比例平衡色谱柱，再次进样， 收集含量大于98.0％的馏分，按照保留时间合并相同组份；
步骤五：浓缩结晶
将收集的馏分在-0.05～-0.1MPa真空中，40～80℃浓缩至0.1～ 0.15倍体积，在0～3℃温度下放置于1～5h结晶，过滤得到不同组 分的结晶体；
步骤六：干燥
将不同组分的结晶体在60～80℃温度下干燥，得到Sagittasine A、 HexandrasidF、neo-sagittasine、koreanoside G四个化合物单 体；
步骤七：纯度检测
对四个化合物单体成分经分析型HPLC检测，分析条件为：
填料：C18(4.6*250mm，i.d.5um)，流速：1.0～1.2ml/min；
洗脱程序：0～20min、25～60％乙腈-酸水，检测波长：270nm；
进样量10ul，柱温30～40℃。
在步骤一中，药材粉碎为1～5mm，低碳醇为甲醇、乙醇、异丙醇等 中的一种，超声次数1～3次，超声时间每次20～60min。
在步骤二中，加入水的体积为1/2～5倍浓缩液体积，大孔吸附树脂 型号为AB-8、D101中的一种。
在步骤二中，大孔吸附树脂梯度洗脱，洗脱包括依次用3倍柱体积 纯水，3倍柱体积10％甲醇水溶液，3倍柱体积40％甲醇水溶液，3 倍柱体积60％甲醇水溶液梯度洗脱。
在步骤三中，浓缩至1/5～1/10体积，加入甲醇或者DMSO体积为 1/3～1/2体积。
在步骤四中，制备液相所用酸为甲酸、乙酸、三氟乙酸及磷酸中的 一种，浓度为0.1％～2％，洗脱梯度为乙腈-水-磷酸体系、乙腈-水- 乙酸体系或乙腈-水-三氟乙酸体系。
在步骤四中，反相制备色谱填料为C18，粒径为5～12um，流速 50-300ml/min，紫外检测波长为270nm，洗脱梯度如下：
在步骤七中，分析型高效液相所用酸为甲酸、乙酸、三氟乙酸及磷 酸中的一种，浓度为0.1％～2％。
优选的，在步骤一中，药材粉碎为3mm，低碳醇为乙醇，醇浓度为 80％，真空度为-0.8Mpa，真空浓缩温度为60℃。
优选的，在步骤二中，洗脱包括依次用3倍柱体积纯水、3倍柱体 积20％、3倍柱体积40％、3倍柱体积80％甲醇-水梯度洗脱。
优选的，在步骤四中，制备液相所用酸为甲酸、乙酸、三氟乙酸及 磷酸中的一种，浓度为0.1％～2％，洗脱梯度为乙腈-水-磷酸体系、 乙腈-水-乙酸体系或乙腈-水-三氟乙酸体系。
优选的，在步骤四中，反相制备色谱填料为C18，粒径为5～12um。 采用上述技术方案的有益效果是：
本发明和现有技术相对比，通过制备液相等步骤能提取分离出四种 高纯度化合物单体，该种分离方法相对于其他分离方法工艺简单， 操作方便，能同时分离，化合物单体纯度高、数量多，且均大于98.0％， 对药品等的研究开发有很好的促进作用，并提高了对淫羊藿的利用 价值。
具体实施方式
为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下 面对本发明的技术方案做进一步的描述。
一种用制备液相法同时获得四种淫羊藿稀有黄酮的分离方法，该方 法包括以下步骤：
步骤一：药材粉碎、超声提取 以1Kg淫羊藿药材为原料，粉碎成3mm的颗粒，按照重量比加入6 倍量的80％乙醇溶液，超声3次，每次40min，合并提取液，过滤， 在-0.8MPa真空下，60℃减压浓缩至无醇度溶液1000ml；
步骤二：大孔吸附树脂柱层析
给步骤一的溶液中加入纯化水2000ml，摇匀，加入到已经处理好的 AB-8大孔吸附树脂层析柱上，依次用纯化水、20％甲醇溶液、40％甲 醇溶液、80％甲醇溶液洗脱，每个比例洗脱3倍柱体积后，收集80％ 洗脱液；
步骤三：真空浓缩
在-0.9MPa真空下，60℃减压浓缩至无醇度溶液500ml；
步骤四：高效制备液相色谱分离
将步骤三得到的溶液加入300mlDMSO使其澄清，用反相高效液相色 谱C18柱制备样品，每次进样5ml，用的乙腈梯度洗脱，洗脱梯度 为乙腈-水-乙酸体系，洗脱比例为：
| 时间(min) | 乙腈(％) | 水(％) | 磷酸(％) |
| 0 | 25 | 74.8 | 0.2 |
| 20 | 60 | 39.8 | 0.2 |
制备液相条件为：酸浓度为0.2％乙酸，C18(10um*250mm*50mm)，紫 外检测波长为270nm，洗脱流速为80ml/min，并用紫外检测器实时 监控，按照保留时间不同，分别收集含量98.0％的馏分；
步骤五：浓缩结晶
将收集的馏分浓缩至0.1倍体积，在0℃低温下放置2h进行结晶， 过滤得到不同组分的结晶体；
步骤六：干燥
将不同组分的结晶体在60℃温度下干燥，依次得到Sagittasine A、 HexandrasidF、neo-sagittasine、koreanoside G四个化合物单 体；
步骤七：纯度检测
对四个化合物单体成分经HPLC检测，分析条件为：
填料：C18(4.6*250mm，i.d.5um)，流速：1.0ml/min；
洗脱程序：
| 时间(min) | 乙腈(％) | 水(％) | 磷酸(％) |
| 0 | 25 | 74.8 | 0.2 |
| 20 | 60 | 39.8 | 0.2 |
检测波长：270nm；进样量10ul，柱温35℃；
检测得出Sagittasine A、Hexandrasid F、neo-sagittasine、 koreanoside G纯度依次为：98.8％、99.1％、98.4％、98.1％。 Sagittasine A其结构式如下所示：
Hexandrasid F其结构式如下所示：
neo-sagittasine其结构式如下所示：
koreanoside G其结构式如下所示：
通过实施例提取分离出四种纯度大于98.0％化合物单体，对药品等 的研究开发有很好促进作用，本发明的分离方法和现有技术相对比， 工艺简单可控，操作方便，能够同时取得四种高纯度化合物单体， 提高了对淫羊藿的利用价值。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。 本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述 实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明 精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和 改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附 的权利要求书及其等效物界定。
Claims (8)
1.一种用制备液相法同时获得四种淫羊藿稀有黄酮的分离方法，其特征在于：它包括如下步骤：
步骤一：超声提取
将淫羊藿药材粉碎，低碳醇溶液超声提取3次，每次超声时间20～60min，合并提取液，过滤，在-0.05～-0.1MPa真空中，40～80℃浓缩至无醇度；
步骤二：大孔吸附树脂柱层析
浓缩液加纯化水悬浮，加入到已经处理好的大孔吸附树脂层析柱里，甲醇、水梯度洗脱，分段收取馏分；
步骤三：真空浓缩
馏分在-0.05～-0.1MPa真空中，40～80℃浓缩至小体积，加入甲醇或者DMSO，使溶液澄清，得到待制备溶液；
步骤四：高效制备液相色谱分离
待制备溶液用0.45um有机膜过滤，制备液相色谱柱用初始流动相平衡色谱柱20min，每次进样5ml，用25～60％纯度的乙腈-酸水梯度洗脱，并用紫外检测器实时监控，按照各自不同的保留时间收集四个组份的洗脱液，峰出完后按照初始比例平衡色谱柱，再次进样，收集含量大于98.0％的馏分，按照保留时间合并相同组份；
步骤五：浓缩结晶
将收集的馏分在-0.05～-0.1MPa真空中，40～80℃浓缩至0.1～0.15倍体积，在0～3℃温度下放置于1～5h结晶，过滤得到不同组分的结晶体；
步骤六：干燥
将不同组分的结晶体在60～80℃温度下干燥，得到Sagittasine A、Hexandrasid F、neo-sagittasine、koreanoside G四个化合物单体；
步骤七：纯度检测
对四个化合物单体成分经分析型HPLC检测，分析条件为：
填料：C18(4.6*250mm，i.d.5um)，流速：1.0～1.2ml/min；
洗脱程序：0～20min、25～60％乙腈-酸水，检测波长：270nm；
进样量10ul，柱温30～40℃。
2.根据权利要求1所述用制备液相法同时获得四种淫羊藿稀有黄酮的分离方法，其特征在于：在步骤一中，药材粉碎为1～5mm，低碳醇为甲醇、乙醇、异丙醇等中的一种，超声次数1～3次，超声时间每次20～60min。
3.根据权利要求1所述用制备液相法同时获得四种淫羊藿稀有黄酮的分离方法，其特征在于：在步骤二中，加入水的体积为1/2～5倍浓缩液体积，大孔吸附树脂型号为AB-8、D101中的一种。
4.根据权利要求1所述用制备液相法同时获得四种淫羊藿稀有黄酮的分离方法，其特征在于：在步骤二中，大孔吸附树脂梯度洗脱，洗脱包括依次用3倍柱体积纯水，3倍柱体积10％甲醇水溶液，3倍柱体积40％甲醇水溶液，3倍柱体积60％甲醇水溶液梯度洗脱。
5.根据权利要求1所述用制备液相法同时获得四种淫羊藿稀有黄酮的分离方法，其特征在于：在步骤三中，浓缩至1/5～1/10体积，加入甲醇或者DMSO体积为1/3～1/2体积。
6.根据权利要求1所述用制备液相法同时获得四种淫羊藿稀有黄酮的分离方法，其特征在于：在步骤四中，制备液相所用酸为甲酸、乙酸、三氟乙酸及磷酸中的一种，浓度为0.1％～2％，洗脱梯度为乙腈-水-磷酸体系、乙腈-水-乙酸体系或乙腈-水-三氟乙酸体系。
7.根据权利要求1所述用制备液相法同时获得四种淫羊藿稀有黄酮的分离方法，其特征在于：在步骤四中，反相制备色谱填料为C18，粒径为5～12um，流速50-300ml/min，紫外检测波长为270nm，洗脱梯度如下：
8.根据权利要求1所述用制备液相法同时获得四种淫羊藿稀有黄酮的分离方法，其特征在于：在步骤七中，分析型高效液相所用酸为甲酸、乙酸、三氟乙酸及磷酸中的一种，浓度为0.1％～2％。
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|---|---|---|---|---|
| CN114790222A (zh) * | 2022-05-11 | 2022-07-26 | 遵义医科大学 | 一种基于淫羊藿的黄酮类化合物及其制备方法 |
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| CN101747393A (zh) * | 2008-12-17 | 2010-06-23 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 同时制备淫羊藿苷、朝藿定a、b、c化学对照品的方法 |
| CN104910216A (zh) * | 2015-03-07 | 2015-09-16 | 宝鸡文理学院 | 一种用制备液相法同时得到多种淫羊藿黄酮的分离方法 |
-
2020
- 2020-06-23 CN CN202010579168.8A patent/CN111675741A/zh active Pending
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| CN114790222B (zh) * | 2022-05-11 | 2024-03-01 | 遵义医科大学 | 一种基于淫羊藿的黄酮类化合物及其制备方法 |
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