CN113440547B - 采用大孔树脂串联动态轴向压缩柱分离纯化大蓟总苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种采用大孔树脂串联动态轴向压缩柱分离纯化大蓟总苷的方法，包括药材净选、热水提取、絮凝沉降、过滤、大孔树脂富集、洗脱、浓缩、动态轴向压缩柱层析纯化、干燥处理等步骤。本发明方法避免了传统溶剂萃取，提取分离纯化过程繁琐、有机溶剂用量大、能耗高等缺点，提高了大蓟总苷加工技术的环境友好性，且在不改变目标产品特征成份的前提下，通过实时检测，流份收集切换操作，可以提高大蓟总苷的纯度、工艺指向性明确，操作简单、分离效率高。
Description
技术领域
本发明属于分离纯化技术领域，具体涉及一种采用大孔树脂串联动态轴向压缩柱分离纯化大蓟总苷的方法。
背景技术
大蓟，别名大刺儿菜、大刺盖、山萝卜、刺萝卜等，其基源植物为菊科蓟属植物大蓟Cirsium japonicum DC.。大蓟以其干燥地上部分入药，收载于中国药典I部（2020版）。大蓟性凉，味甘、苦；归心、肝经。大蓟富含黄酮类成分，柳穿鱼叶苷、蒙花苷、橙皮苷、柳穿鱼黄素等均有报道。
其中柳穿鱼叶苷和蒙花苷是一种黄酮氧苷类化合物，具有较好的抗炎、保肝、降糖和抗肿瘤等生理活性，极具开发利用价值。经申请人前期研究发现，大蓟中柳穿鱼叶苷和蒙花苷等成分含量较低（药典规定其柳穿鱼叶苷含量不低于0.2%）。然而，大蓟为多年生草本，野生于山坡、路边等处，在我国南北各省区都有分布，资源较为丰富、价格低廉，且其人工栽培也比较方便，是极好的柳穿鱼叶苷和蒙花苷的来源，且柳穿鱼叶苷和蒙花苷的混合物同样具有二者相同的生物活性，所以本发明将二者混合制备，并将二者的混合物命名为大蓟总苷（TFC90）。
目前，对大蓟成分的提取和分离纯化通常采用下述工艺的几步或全过程：原料粗碎、用水或溶剂浸泡、加热回流提取或超声提取、过滤和离心、沉淀、浓缩、大孔树脂吸附分离、溶剂萃取、柱层析等，最后减压蒸发浓缩与溶剂回收、喷雾或冷冻干燥、重结晶等。上述传统提取分离工艺存在耗时长、能耗高、溶剂用量大、环境兼容性差、产物纯度低等缺陷。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明的首要目的在于提供一种采用大孔树脂串联动态轴向压缩柱分离纯化大蓟总苷的方法，该方法避免了传统溶剂萃取，提取分离纯化过程繁琐、有机溶剂用量大、能耗高等缺点，提高了大蓟总苷加工技术的环境友好性，且在不改变目标产品特征成份的前提下，通过实时检测，流份收集切换操作，可以提高大蓟总苷的纯度、工艺指向性明确，操作简单、分离效率高。
本发明是通过以下技术方案实现：
一种采用大孔树脂串联动态轴向压缩柱分离纯化大蓟总苷的方法，包括如下步骤：
（1）以大蓟地上部分为原料，纯水加热提取，提取液粗滤，得到粗提液，将粗提液絮凝
沉降，取上清液过滤，得到澄清上清液；
（2）将澄清上清液经大孔树脂富集，洗脱、浓缩，膜过滤，得到膜滤液；
（3）将膜滤液经动态轴向压缩柱层析纯化，采用LC-qTOF-MS精确分子量快速鉴定和对照品保留时间锁定的方法，收集含柳穿鱼叶苷和蒙花苷的流份，浓缩、干燥，得到大蓟总苷。
优选的，步骤（1）中，所述纯水提取时间为1-4小时，提取温度为90-95℃，提取次数为1-2次，料液比为1：10-30。
优选的，步骤（1）中，所述提取液粗滤是采用90~100µm烧结金属滤头接真空泵对提取液进行过滤。
优选的，步骤（1）中，所述取上清液过滤是采用50~60µm烧结金属滤头接真空泵对上清液进行过滤。
优选的，步骤（2）中，所述大孔树脂的种类为AB-8 或D-101，洗脱溶剂为70-95%的甲醇或乙醇。
优选的，步骤（3）中，所述动态轴向压缩柱以C18反相硅胶键合相为填料；甲醇为流动相A和0.05% 甲酸水溶液为流动相B；梯度洗脱，洗脱程序为0~17 min，95%B→44% B；17~21min，44%B → 38%B；21~32 min，38%B→ 5%B；32~35 min，5％B→5％B；35～37min，5％→95％B；37～45min，95％B→95％B；流速 70 mL·min-1，检测波长为 254nm和330 nm，柱温25℃，进样量10mL。
优选的，步骤（3）中，所述干燥为冷冻干燥或真空加热干燥。
步骤（3）中，所述柳穿鱼叶苷和蒙花苷的qTOF-MS m/z([M-H]-)分别为621.1755±0.05Da和591.1654±0.05Da，动态轴向压缩柱色谱保留时间约为24.45± 0.2min。
本发明还提供了一种采用上述方法制备得到的大蓟总苷，所述大蓟总苷中主要包括2种组份：柳穿鱼叶苷和蒙花苷，其中柳穿鱼叶苷和蒙花苷的总重量含量不小于90%。
优选的，其中柳穿鱼叶苷的重量含量为75-85%，蒙花苷的重量含量为5-15%。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
本发明提供一种大孔树脂富集串联动态轴向压缩柱分离纯化大蓟总苷的新方法，避免了传统提取分离纯化过程繁琐、有机溶剂用量大、能耗高的缺点，采用LC-qTOF-MS精确分子量快速鉴定和对照品保留时间锁定的方法，提高了大蓟总苷的纯化效率及其纯度。同时，本发明采用动态轴向压缩柱层析技术对大蓟总苷的纯化性能好，且其中试和工业放大可靠性强；本发明采用的大孔树脂富集串联动态轴向压缩柱层析技术，工艺紧凑，降低了污染风险环节。
附图说明
图1为本发明分离制备的大蓟总苷液相色谱图；其中A为动态轴向压缩柱色谱图，B为HPLC分析色谱图。
图2为本发明分离制备的蒙花苷的高分辨质谱图；
图3为本发明分离制备的柳穿鱼叶苷的高分辨质谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。
实施例1：
一种采用大孔树脂串联动态轴向压缩柱分离纯化大蓟总苷的方法，包括如下步骤：
（1）以大蓟地上部分1kg为原料，净选、除杂，加入纯水，90-95℃加热提取2次，第一次提取的料液比为1：20，提取时间为2h，第二次提取的料液比为1：15，提取时间为1.5h，
采用90~100µm烧结金属滤头接真空泵对两次提取液进行粗滤，合并得到粗提液，将粗提液加入絮凝剂（0.005%的聚丙烯酰胺）絮凝沉降，取上清液采用50~60µm烧结金属滤头接真空泵对上清液过滤，得到澄清上清液；
（2）将澄清上清液倒入已经预处理好的D101大孔吸附树脂中，静态吸附12h；接着，将吸附后的树脂滤出，用2倍量的纯水漂洗后，用95%的乙醇分3次洗脱，每次30分钟，收集洗脱液，减压浓缩后用70%乙醇溶解，0.45µm膜过滤；
（3）采用江苏汉邦科技有限公司制备色谱系统，配置NP7000输液泵和NU3000 UV/VIS检测器，串联DAC-HB 动态轴向压缩柱（50×650 mm），填料为十八烷基硅烷键合硅胶（C18，华谱新创科技有限公司，ZK2016080701），以甲醇（A）-0.05% 甲酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱，洗脱程序为0~17 min，95%B→44% B；17~21min，44%B → 38%B；21~32 min，38%B→ 5%B；32~35 min，5％B→5％B；35～37min，5％→95％B；37～45min，95％B→95％B；流速 70 mL·min-1，检测波长为 254nm和330 nm，柱温25 ℃，进样量10mL；其色谱图如附图1所示。
以柳穿鱼叶苷对照品（成都埃法生物科技有限公司，AF21021105）建立保留时间指数，保留时间约为24.45 min。采用LC-qTOF-MS对目标流份进行分子量测定，收集含柳穿鱼叶苷和蒙花苷的流份，柳穿鱼叶苷和蒙花苷的qTOF-MS m/z ([M-H]-)分别为621.1755Da和591.1654Da（如图2-3）；
将目标流份经减压浓缩后用冷冻真空干燥机（德国，Christ Alpha 1-2LDplus型冻干机）进行冻干处理，最终得到淡黄色粉末1.812g；冻干机的冷阱温度设为-55℃，冷冻温度-36℃，真空度0.20mbar。
将所得淡黄色粉末约10mg，精确称定后70%乙醇溶解并定容至10mL，进HPLC（Waters, 2695型，DAD检测器）分析（色谱图如图1所示），以外标法计算，其中柳穿鱼叶苷和蒙花苷的含量分别为84.17%和7.96%。
其中，HPLC的色谱条件：Waters 2695高效液相色谱仪（PDA 2998检测器、Empower2色谱工作站），色谱柱为Kromasil 100-5C18（4.6×250mm，5μm），以 0.05%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱（0-15 min，10%B→14%B；15-20 min，14%B→24%B；20-33 min，24%B→26%B；33-54 min，26％B→57％B；54-59 min，57％→68％B；59-65 min，68％B→90％B，流速 1.0 mL·min-1，检测波长为 330 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL。
同样的，按照中国药典2020版大蓟项下规定的方法，测定其柳穿鱼叶苷含量为0.23%，蒙花苷为0.05%。
实施例2：
一种采用大孔树脂串联动态轴向压缩柱分离纯化大蓟总苷的方法，包括如下步骤：
（1）以大蓟地上部分1kg为原料，净选、除杂，加入纯水，90-95℃加热提取2次，第一次提取的料液比为1：15，提取时间为2h，第二次提取的料液比为1：10，提取时间为1.5h，
采用90~100µm烧结金属滤头接真空泵对两次提取液进行粗滤，合并得到粗提液，将粗提液加入絮凝剂（0.0075%的聚丙烯酰胺）絮凝沉降，取上清液采用50~60µm烧结金属滤头接真空泵对上清液过滤，得到澄清上清液；
（2）将澄清上清液倒入已经预处理好的AB-8大孔吸附树脂中，静态吸附12h；接着，将吸附后的树脂滤出，用2倍量的纯水漂洗后，用甲醇分3次洗脱，每次20分钟，收集洗脱液，减压浓缩后用甲醇溶解，0.45µm膜过滤；
（3）采用江苏汉邦科技有限公司制备色谱系统，配置NP7000输液泵和NU3000 UV/VIS检测器，串联DAC-HB 动态轴向压缩柱（50×650 mm），填料为十八烷基硅烷键合硅胶（C18，华谱新创科技有限公司，ZK2016080701），以甲醇（A）-0.05% 甲酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱，洗脱程序为0~17 min，95%B→44% B；17~21min，44%B → 38%B；21~32 min，38%B→ 5%B；32~35 min，5％B→5％B；35～37min，5％→95％B；37～45min，95％B→95％B；流速 70 mL·min-1，检测波长为 254nm和330 nm，柱温25 ℃，进样量10mL；
将目标流份经减压浓缩后置于真空加热干燥箱（DZF型真空干燥箱）中，将其干燥后研磨，即得浅黄色TFC90粉末1.502g。干燥箱真空度-0.085MPa，干燥箱温度65±1℃。
将所得淡黄色粉末约10mg，精确称定后70%乙醇溶解并定容至10mL，进HPLC（Waters, 2695型，DAD检测器）分析，以外标法计算，其中柳穿鱼叶苷和蒙花苷的含量分别为84.76%和8.27%。
实施例3：
一种采用大孔树脂串联动态轴向压缩柱分离纯化大蓟总苷的方法，包括如下步骤：
（1）以大蓟地上部分5kg为原料，净选、除杂，加入纯水，90-95℃加热提取2次，第一次提取的料液比为1：25，提取时间为2h，第二次重复操作1次，采用90~100µm烧结金属滤头接真空泵对两次提取液进行粗滤，合并得到粗提液，将粗提液加入絮凝剂（0.01%的聚丙烯酰胺）絮凝沉降，取上清液采用50~60µm烧结金属滤头接真空泵对上清液过滤，得到澄清上清液；
（2）将澄清上清液倒入已经预处理好的D101大孔吸附树脂中，静态吸附12h；接着，将吸附后的树脂滤出，用2倍量的纯水漂洗后，用甲醇分3次洗脱，每次20分钟，收集洗脱液，对最后一次甲醇洗脱后的大孔树脂，用纯水漂洗4次，每次2倍量树脂体积，滤干后的大孔树脂加入之前吸附后的残余液中，重复上面的吸附和洗脱操作，合并两次的洗脱液，减压浓缩后用70%乙醇溶解，0.45µm膜过滤；
（3）采用江苏汉邦科技有限公司制备色谱系统，配置NP7000输液泵和NU3000 UV/VIS检测器，串联DAC-HB 动态轴向压缩柱（50×650 mm），填料为十八烷基硅烷键合硅胶（C18，华谱新创科技有限公司，ZK2016080701），以甲醇（A）-0.05% 甲酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱，洗脱程序为0~17 min，95%B→44% B；17~21min，44%B → 38%B；21~32 min，38%B→ 5%B；32~35 min，5％B→5％B；35～37min，5％→95％B；37～45min，95％B→95％B；流速 70 mL·min-1，检测波长为 254nm和330 nm，柱温25 ℃，进样量10mL；
将目标流份经减压浓缩后置于真空加热干燥箱中，将其干燥后研磨，即得浅黄色TFC90粉末7.724g。干燥箱真空度-0.085~-0.090MPa，干燥箱温度65±1℃。
将所得淡黄色粉末约10mg，精确称定后70%乙醇溶解并定容至10mL，进HPLC（Waters, 2695型，DAD检测器）分析，以外标法计算，其中柳穿鱼叶苷和蒙花苷的含量分别为83.74%和7.25%。
Claims (9)
1.一种采用大孔树脂串联动态轴向压缩柱分离纯化大蓟总苷的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）以大蓟地上部分为原料，纯水加热提取，提取液粗滤，得到粗提液，将粗提液絮凝沉降，取上清液过滤，得到澄清上清液；
（2）将澄清上清液经大孔树脂富集，洗脱、浓缩，膜过滤，得到膜滤液；
（3）将膜滤液经动态轴向压缩柱层析纯化，采用LC-qTOF-MS精确分子量快速鉴定和对照品保留时间锁定的方法，收集含柳穿鱼叶苷和蒙花苷的流份，浓缩、干燥，得到大蓟总苷；
所述动态轴向压缩柱以C18反相硅胶键合相为填料；甲醇为流动相A和0.05% 甲酸水溶液为流动相B；梯度洗脱，洗脱程序为0~17 min，95%B→44% B；17~21min，44%B → 38%B；21~32 min，38%B→ 5%B；32~35 min，5％B→5％B；35～37min，5％→95％B；37～45min，95％B→95％B；流速 70 mL·min-1，检测波长为 254nm和330 nm，柱温25 ℃，进样量10mL。
2.根据权利要求1所述的一种采用大孔树脂串联动态轴向压缩柱分离纯化大蓟总苷的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述纯水提取时间为1-4小时，提取温度为90-95℃，提取次数为1-2次，料液比为1﹕10-30。
3.根据权利要求1所述的一种采用大孔树脂串联动态轴向压缩柱分离纯化大蓟总苷的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述提取液粗滤是采用90~100µm烧结金属滤头接真空泵对提取液进行过滤。
4.根据权利要求1所述的一种采用大孔树脂串联动态轴向压缩柱分离纯化大蓟总苷的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述取上清液过滤是采用50~60µm烧结金属滤头接真空泵对上清液进行过滤。
5.根据权利要求1所述的一种采用大孔树脂串联动态轴向压缩柱分离纯化大蓟总苷的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述大孔树脂的种类为AB-8 或D-101，洗脱溶剂为60-95%的甲醇或乙醇。
6.根据权利要求1所述的一种采用大孔树脂串联动态轴向压缩柱分离纯化大蓟总苷的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述干燥为冷冻干燥或真空加热干燥。
7.根据权利要求1所述的一种采用大孔树脂串联动态轴向压缩柱分离纯化大蓟总苷的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述柳穿鱼叶苷和蒙花苷的qTOF-MS m/z([M-H]-)分别为621.1755±0.05Da和591.1654±0.05Da，动态轴向压缩柱色谱保留时间约为24.45±0.2min。
8.权利要求1-7任一项所述的方法制备得到的大蓟总苷，其特征在于，所述大蓟总苷中主要包括2种组份：柳穿鱼叶苷和蒙花苷，其中柳穿鱼叶苷和蒙花苷的总重量含量不小于90%。
9.根据权利要求8所述的大蓟总苷，其特征在于，其中柳穿鱼叶苷的重量含量为75-85%，蒙花苷的重量含量为5-15%。
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