CN101234147A - 注射用金莲花总黄酮的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种注射用金莲花总黄酮的制备方法，该提取物中主要含有荭草苷和牡荆苷等黄酮类成分，总黄酮含量大于70％，本发明公开了所述提取物的制备方法，主要特征在于该提取物经两次柱层析精制处理获得，其中所用吸附材料为大孔树脂、聚酰胺或硅胶、反相硅胶、凝胶等吸附材料中的两种，该提取物经过现代科学方法加以提取、浓缩、精制而成，工艺简单易行，提高了原药材的有效成份纯度，减小了服用剂量和不良反应。

Description

注射用金莲花总黄酮的制备方法

技术领域

本发明涉及一种药物总黄酮的提取、纯化方法，具体是金莲花总黄酮的制备方法。

背景技术

毛茛科金莲花属(Trollius)植物为多年生草本植物，在世界上共有约25种种，主要分布于北温带及寒温带高山区域，我国有16种和6个变种，以河北、山西、内蒙古产量最多。在同属的10余种金莲花植物中，金莲花(Trollius chinensis Bge.)和亚洲金莲花(Trollius asiaticus L.)被《中药大辞典》收录供药用。近年来，人们对同属的长瓣金莲花(Trollius macropetalus Fr.Schmidt)和短瓣金莲花(Trollius ledebouri Reichb.)研究较多，显示短瓣金莲花可能成为中药金莲花的重要代用新资源。

在中国，金莲花具有悠久的药用历史，它收载于本草，最初见于清赵学敏所著《本草纲目拾遗》。夏季花盛开时采收晾干。以花入药，其味苦，性寒，毒，具有清热解毒、抗菌消炎的作用。近代研究表明，其对急性化脓性扁桃体炎、咽炎、上呼吸道感染、中耳炎及急性结膜炎、急性肠炎、泌尿系统感染、痤疮等均有较好的疗效[袁强，等.金莲花片治疗感冒风热证90例疗效观察.中国临床医生，2006，34(2)：53；王平.金莲花冲剂治疗上呼吸道感染疗效观察.中成药，1996，18(3)：50.]。

天然药物化学和现代药理学研究表明各种金莲花属植物中主要有效成分为总黄酮，总黄酮中的主要成分均为牡荆苷(vitexin)和荭草苷(orientin)。有报道从金莲花中分离出的黄酮类物质有牡荆苷、荭草苷、槲皮素、异当药黄素、异日本当药黄素、蓟黄素等[任正博，等.金莲花化学成分究.2006，8(2)：14；Wang R.F，et al.Trollioside，a new compound from the flowers of Trolliuschinensis.Journal of Asian Natural Products Research，2004，6(2)：139.]。有报道从长瓣金莲花的花和茎叶中分离得到牡荆苷、荭草苷、牡荆素2″-O-β-D-吡喃木糖苷和荭草素2″-O-β-D-吡喃木糖苷[刘丽娟等.长瓣金莲花茎叶化学成分的研究.药学学报，1992，27(11)：837]。从短瓣金莲花中分离得到牡荆苷、荭草苷、槲皮素-新橙皮苷[黄文哲等.短瓣金莲花化学成分的研究.中草药，2000，31(10)：731]，从阿尔泰金莲花中分离得到柯伊利素(chrysoeriol)、荭草苷(orientin)等[宋冬梅等.阿尔泰金莲花化学成分的研究.中国药物化学杂志，2004，14(4)：233]。林秋凤等[林秋凤等.金莲花抑菌抗病毒活性成分的初步研究.浙江大学学报(理学版)，2004，31(4)：412]对金莲花中总黄酮、牡荆苷、荭草苷对抑菌、体外抗病毒作用展开研究，实验结果表明了总黄酮、牡荆苷、荭草苷对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌有很好的抑制作用，总黄酮对呼吸道合胞病毒、A型流感病毒合副流感3型病毒均有一定的抑制作用，而牡荆苷、荭草苷对副流感3型病毒有较强的抑制作用。王凌云等[王凌云等.长瓣金莲花中黄酮苷的抑菌活性研究及牡荆苷的含量测定.中药新药与临床药理，2003，14(4)：252]亦对长瓣金莲花中黄酮苷的抑菌活性进了研究，结果亦表明总黄酮、荭草苷、牡荆苷对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌有较强的抑制作用。中国专利CN1872084公开了短瓣金莲花提取物及荭草苷、牡荆苷等10种黄酮单体有效成分具有显著的抗炎作用，各单体化合物与COX2酶均具有一定结合能力，可用于制备治疗炎性疾病例如风湿性关节炎或类风湿性关节炎等病症的药物的用途。

目前市场上金莲花的成药有：金莲花片，金莲花咀嚼片、金莲花润喉片、金莲花分散片、金莲花颗粒剂，金莲花口服液，金莲花胶囊等。但该类药物均为水提制备，工艺较为粗糙，存在服用剂量大、有效成分不清楚、剂型简单等缺点。中国专利CN1876031公开了金莲花注射液及其制备方法，其中金莲花提取物原料仅采用大孔树脂洗脱，总黄酮含量较低；中国专利CN1452974公开了一种金莲花粉针剂及其制备方法，该粉针包括以金莲花为主共四味中药制成，其中金莲花提取物仅采用水醇法制备。目前还没有一种产品是以金莲花有效部位为基础的注射剂等产品，有必要对金莲花总黄酮进行提取纯化和深入开发研究。已有报道的金莲花总黄酮多以水提，亦有报道用聚酰胺或AB-8大孔树脂进行纯化的，但总黄酮纯度均不高(低于70％)。虽然有报道[胡冰等.金莲花注射剂精制新工艺研究.哈尔滨商业大学雪豹(自然科学版)，2006，22(3)，8～13]将水沉法和大孔树脂吸附法联合应用对金莲花粗提物进行精制总黄酮含量能达到80％，但其反复醇沉、冷冻，并用活性炭吸附，对总黄酮的损失比较大，并且工艺复杂，不利于工业化生产。中国专利CN1268631C公开了采用高速逆流色谱法(HSCCC)和制备液相色谱对短瓣金莲花总黄酮进行分离纯化，得到纯度高于98％的荭草苷、牡荆苷、槲皮素-新橙皮糖苷，但该法需要采用特制设备，不利于工业化推广使用。

发明内容

本发明提供一种新的注射用金莲花总黄酮的提取纯化方法，该方法生产的金莲花总黄酮含量可达到70％以上，使得到的金莲花总黄酮在纯度、性状和疗效方面均符合药典规定的注射用标准，同时能适应工业化生产，并且对环境无污染。

本发明提供的制备金莲花总黄酮的方法包括以下工艺步骤：

(1)选取金莲花属植物药材，自然干燥；

(2)由(1)所得金莲花药材采用水或醇水(10-95％)混合溶媒提取，提取液合并，浓缩至密度为1.05～1.15mg/ml，得金莲花浓缩液；

(3)由(2)所得金莲花浓缩液，过滤；滤液经大孔树脂、聚酰胺或反相硅胶、凝胶等吸附材料中的一种，先用水洗，再用醇水混合溶媒梯度洗脱；收集富含黄酮部位洗脱液，合并后减压回收乙醇至干，得浸膏；

(4)由(3)所得浸膏经水溶解，过滤；滤液经大孔树脂、聚酰胺或硅胶、反相硅胶、凝胶等吸附材料中的一种但不同于步骤(3)所用的吸附材料吸附，先用水洗，再用醇水混合溶媒梯度洗脱；收集富含黄酮部位洗脱液，合并后经浓缩，干燥，除尽溶剂，即得金莲花总黄酮提取物。

所述工艺步骤(1)中金莲花药材为金莲花属植物的一种，如金莲花、亚洲金莲花、长瓣金莲花、短瓣金莲花、阿尔泰金莲花等。

所述工艺步骤(2)中采用水或醇水(10-95％的乙醇或甲醇)混合溶媒提取，提取液合并，常法浓缩至密度为1.05～1.15mg/ml，得金莲花浓缩液。

所述工艺步骤(3)中，取(2)所得金莲花浓缩液，过滤，滤液经过大孔树脂、聚酰胺或硅胶、反相硅胶、凝胶等吸附材料中的一种进行柱层析吸附，其中优选大孔树脂；大孔树脂柱洗脱时先用水洗，再用醇(乙醇或甲醇)-水混合溶媒梯度洗脱，收集富含黄酮部位洗脱液，其中优选乙醇-水混合溶媒梯度洗脱，更优选用20％～80％乙醇分别洗脱，收集富含黄酮部位的20％～80％乙醇洗脱液，合并后减压回收乙醇至干，得浸膏。

所述工艺步骤(4)中，将(3)中所得浸膏经水溶解，过滤，滤液经过大孔树脂、聚酰胺或反相硅胶、凝胶等吸附材料中的一种进行柱层析吸附；洗脱时先用水洗，再用醇水混合溶媒梯度洗脱，其中优选20％～80％乙醇-水混合溶媒洗脱；收集富含黄酮部位洗脱液，合并后经浓缩、干燥，除尽溶剂，即得金莲花总黄酮提取物，其中优选减压浓缩、真空干燥。

由本发明以上工艺步骤制备所得的金莲花总黄酮提取物，总黄酮含量大于70％。所采用的总黄酮测定方法：以芦定为对照品，以亚硝酸钠-硝酸铝为显色剂，采用分光光度法在500nm处进行测定。

本制备工艺所得原料含有70％以上的金莲花总黄酮，符合国家新药报批中“以有效部位为组分的注射液，其有效部位的含量应不少于总固体量的70％(静脉用不少于80％)”的规定。本发明中仅使用了水和乙醇这两种无害的溶媒，避免了有害有机溶剂，降低了提取、纯化成本，保证了用药安全性，非常适合工业化生产。

本发明内容是通过大量实验研究、进行工艺优化分析完成的，以下述具体实施例进行说明。

具体实施方式

本发明所述的金莲花提取物是按如下实施例所表示的方法制造，所涉及到的方法是本领域的技术人员能够掌握和运用的技术手段。但以下实施例不得理解为任何意义上的对本发明权利要求的限制。

实施例1：

取金莲花药材500克，加15倍量水煎煮两次，每次1小时，合并提取液，减压回收溶剂至药液密度为1.05，过滤，上样于处理好的DA201大孔树脂，分别用水、40％乙醇洗脱；收集40％乙醇洗脱液，并将其减压回收乙醇至干，所得浸膏经水溶解，过滤，滤液上样于已处理好的反相硅胶，分别用水、80％乙醇洗脱；收集80％乙醇洗脱液，将其减压浓缩并真空干燥后粉碎，得到金莲花总黄酮5.5g，总黄酮含量为86.7％。

实施例2：

取金莲花药材500克，加10倍量水煎煮两次，每次1.5小时，合并提取液，减压回收溶剂至药液密度为1.09，过滤，上样于处理好的HPD450大孔树脂，分别用水、50％乙醇洗脱；收集50％乙醇洗脱液，并将其减压回收乙醇至干，所得浸膏经水溶解，过滤，滤液上样于已处理好的LH-20凝胶，分别用水、70％乙醇洗脱；收集70％乙醇洗脱液，将其减压浓缩并真空干燥后粉碎，得到金莲花总黄酮5.7g，总黄酮含量为87.1％。

实施例3：

取金莲花药材500克，加12倍量水煎煮两次，每次2小时，合并提取液，减压回收溶剂至药液密度为1.06，过滤，上样于处理好的S-8大孔树脂，分别用水、60％乙醇洗脱；收集60％乙醇洗脱液，并将其减压回收乙醇至干，所得浸膏经水溶解，过滤，滤液上样于已处理好的聚酰胺，分别用水、50％乙醇洗脱；收集50％乙醇洗脱液，将其减压浓缩并真空干燥后粉碎，得到金莲花总黄酮5.8g，总黄酮含量为88.3％。

实施例4：

取金莲花药材500克，加8倍量水煎煮两次，每次1.5小时，合并提取液，减压回收溶剂至药液密度为1.10，过滤，上样于处理好的AB-8大孔树脂，分别用水、70％乙醇洗脱；收集70％乙醇洗脱液，并将其减压回收乙醇至干，所得浸膏经水溶解，过滤，滤液上样于已处理好的聚酰胺，分别用水、70％乙醇洗脱；收集70％乙醇洗脱液，将其减压浓缩并真空干燥后粉碎，得到金莲花总黄酮5.9g，总黄酮含量为84.3％。

Claims (5)

1、一种注射用金莲花总黄酮的制备方法，由以下步骤组成：

(1)选取金莲花药材，自然干燥；

(2)由(1)所得金莲花药材采用水或醇水混合溶媒提取，提取液，浓缩至密度为1.05～1.15mg/ml；

(3)由(2)所得金莲花浓缩液，过滤；滤液经大孔树脂、聚酰胺、硅胶、反相硅胶或凝胶中的至少一种进行吸附，先用水洗，再用醇水混合溶媒梯度洗脱；收集富含黄酮部位洗脱液，合并后减压回收乙醇至于，得浸膏；

(4)由(3)所得浸膏经水溶解，过滤；滤液经大孔树脂、聚酰胺、硅胶、反相硅胶或凝胶中的至少一种但不同于步骤(3)所用的吸附材料吸附，先用水洗，再用醇水混合溶媒梯度洗脱；收集富含黄酮部位洗脱液，合并后经浓缩，干燥，除尽溶剂，即得。

2、根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤(1)中所述金莲花药材为金莲花属植物的一种。

3、根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤(3)中选用大孔树脂吸附材料，步骤(4)中选用除大孔树脂外的其它吸附材料。

4、根据权利要求3所述的制备方法，其中步骤(4)中选用聚酰胺吸附材料，采用水、20％～80％乙醇进行洗脱；收集20％～50％乙醇部分富含黄酮部位洗脱液。

5、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述总黄酮中含有荭草苷和牡荆苷类的黄酮成分，总黄酮含量大于70％。