CN114907184A - 一种高纯度丹参素钠的提取工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高纯度丹参素钠的提取工艺，包括：通过采用混合溶剂对中药材丹参进行渗漉提取，然后测定浓缩液中丹酚酸B的含量并加入碱进行反应，再经大孔吸附树脂纯化分离后，加入有机溶剂进行重结晶纯化，最后制得高纯度丹参素钠。本发明的高纯度丹参素钠提取工艺操作简单、方便、低成本，所制备的高纯度丹参素钠对肌肉组织无刺激、安全性高。本发明可实现大批量、规模化地制备高纯度丹参素钠，完全满足工业化生产要求，且经济效益突出。

Description

一种高纯度丹参素钠的提取工艺
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种可适用于工业化生产的高纯度丹参素钠提取工艺。
背景技术
丹参是中医最常用的活血化瘀类中药，为唇形科植物丹参(Salvia miltiorrhizaBge.)的干燥根和根茎，临床上广泛用于心绞痛、心肌梗死、中风等心脑血管疾病的治疗，如丹参注射液、注射用丹参多酚酸、复方丹参注射液、丹红注射液、复方丹参滴丸等(Cheng TO.Int J Cardiol,2007,121(1):9-22.)。丹参主要化学成分为水溶性丹酚酸类化合物和脂溶性丹参酮二萜类化合物。近年来研究发现，水溶性丹酚酸为丹参的主要活性成分，以丹酚酸为有效成分的丹参注射液占有我国最大的中药注射剂市场(Du Guanhua,et al.AdvPharmacol.,2020,87:1-41)。丹参素，第一个报道的从丹参中分离得到的丹酚酸类化合物，是丹酚酸类化合物的基本结构单元，此后发现的一系列丹酚酸类化合物大多数(如丹酚酸A、B、C、D、E、F、G、H、I、L、T、U)是由丹参素与其他有机酸(如咖啡酸)通过酯键聚合而成(MeiXiaodan,et al.Chin J Nat Med,2019,17(1):0059-0080；Wu Yibing,et al.ChemicalReviews,2012,112(11):5967-6026)。丹参素在丹参药材中的含量较低，主要靠提取过程中丹酚酸类化合物水解生成(Peng Rong,et al.Ind Eng Chem Res.2017,56:8972-8980)。
丹参素(Danshensu)化学名为[D-(+)-β-(3,4-二羟基苯基)乳酸]，因结构不稳定通常将其制成钠盐进行保存。丹参素钠的分子式为C9H9O5Na，分子量为220.15，结构式为：
Figure BDA0002942608330000011
丹参素是丹参的主要活性成分之一，国内外学者对其药理作用进行了大量的研究。发现丹参素具有清除自由基、抗氧化、抗炎、抗纤维化、抗脂质过氧化、抗凋亡、抗自噬、抗Ca2+超载、抑制血小板聚集、抑制血栓形成、预防动脉粥样硬化、保护脉管内皮细胞、保护心肌缺血缺氧、扩张冠脉血管、改善内皮祖细胞功能、改善微循环、改善线粒体功能及免疫调节脂肪代谢等多种药理活性，对心脑血管、肝脏、肾脏、肺都有保护作用，是丹参治疗心脑血管疾病的主要成分之一(Zhang Jinli,et al.Eur J Pharmacol.2019,864:172710；BaoXiaoyi,et al.Front Pharmacol.2018,9:1445)。
丹参素的提取纯化方法已经有不少文献报导，目前公开丹参素的提取纯化主要主要通过以下方法实现：水煎煮法提取(如中国专利CN1670008A、CN101129463A、CN106995369A、CN1161317C、CN101434534A、CN101985417A、CN103145548A、CN104974033A)，热酸水提取(如中国专利CN105566092A、CN105541602A、CN106478412A)，热碱水提取法(如中国专利CN1868994A、CN101289385A、CN102464581A、CN108310057A)，醇水混合溶液加热提取(如中国专利CN101012163A)，乙醇或乙酸乙酯除去脂溶性成分后用热水提取(如中国专利CN102336652A、CN101445451A)，醇沉除杂或无机陶瓷膜去杂，经大孔吸附树脂或离子吸附树脂分离，重结晶等等。
上述提取纯化方法虽能获得丹参素钠，但提取制备量小，所获得的丹参素的纯度低都无法满足药用。醇沉、过滤等手段虽然能除去提取液中大量蛋白质、鞣质等大分子物质，但较难获得高纯度丹参素，需要经过多步色谱分离才能获得高纯度丹参素钠。如专利CN101445451A经过2次树脂分离后重结晶获得纯度大于98％丹参素钠；CN101012163A经过大孔吸附树脂、凝胶柱或硅胶柱2次色谱分离后重结晶获得纯度大于98％丹参素钠；CN102464581A经过大孔吸附树脂分离、LS-18树脂脱糖、凝胶柱3次色谱分离后重结晶获得纯度大于99％丹参素钠。
现有的丹参素提取分离纯化方法基本上都是采用高温煎煮回流提取、浓缩来获得丹参药材中有效成分丹参素，这样长时间受热使丹参素易降解及氧化，导致最终收率很低；丹参药材组分复杂，水溶性成分除了丹酚酸类化合物还有大量的蛋白、鞣质、多糖、胶体状杂质和金属离子，这些成分水溶性极强，在加热条件下易被提取出来且后续纯化很难去除干净，虽然LS-18树脂能起到脱糖效果(CN102464581A)但不能除尽胶体状杂质。
胶体状杂质是从色谱行为上对植物中目前尚未给出明确化学表征的一类物质。该类物质在正相和反相TLC上均主要集中于原点，却又少量全程分布于正相和反相TLC上；在TLC上没有明确的斑点，在HPLC又无明确的UV吸收峰；在任何极性的洗脱液洗脱时，都有少量被洗脱。这一独特的行为使拟胶体状杂质去除成为丹酚酸类化合物分离纯化关键问题之一(杨帆，等.色谱,2009,27(3):379-381)。一方面这些胶体状杂质不明成分导致临床上丹参类注射剂不良反应居高不下，使丹参类注射剂成为中药不良反应发生的“重灾区”(侯莹,等.医药导报,2019,38(9):1107-1113.)；另一方面胶体状杂质能显著改变化合物的色谱行为，对化合物的分离纯化有极大的危害。
目前已报道的丹参素的制备工艺，或存在“胶体状”不明杂质，或存在纯度低、杂质含量高，或存在工艺复杂冗长、收率低、成本高的问题，均难以适用于工业化生产可供药用的丹参素。市场迫切需求工艺流程简单、低成本的高纯度可供药用的丹参素的工业化制备方法。
发明内容
针对现有高纯度丹参素钠制备技术中的不足，本发明提供了一种可适用于工业化生产的高纯度丹参素钠提取工艺。本发明的高纯度丹参素钠提取工艺操作简单、方便、低成本，可实现大批量、规模化地制备高纯度丹参素钠，完全满足工业化生产要求，且经济效益突出。
本发明提供了一种高纯度丹参素钠的提取工艺，包括：通过采用混合溶剂对中药材丹参进行渗漉提取，然后测定浓缩液中丹酚酸B的含量并加入碱进行反应，再经大孔吸附树脂纯化分离后，加入有机溶剂进行重结晶纯化，最后制得高纯度丹参素钠。
具体地，本发明的提取工艺，包括以下步骤：
(1)渗漉提取：取中药材丹参经预处理后，于混合溶剂中浸泡1～24h，然后进行渗漉提取，控制渗漉速度为1～4ml/min/Kg，提取液经减压浓缩后离心去除沉淀，得浓缩液；
(2)丹参总酚酸转化为丹参素：测定步骤(1)所得浓缩液中丹酚酸B的含量，以质量比丹酚酸B：碱＝0.5:1～5:1的比例加入碱，在氮气环境中温度50～110℃下加热反应0.5～3h，冷却、过滤，调节滤液pH值至1.0～5.0，离心得上清液；
(3)分离：测定步骤(2)所得上清液中丹参素的含量，采用大孔树脂作为树脂填料进行纯化洗脱得收集液，树脂填料的用量为丹参素质量的100～400倍；
(4)调节pH：将步骤(3)收集液在温度50～70℃减压浓缩至收集液总体积的1/10～1/200，过滤，继续浓缩至丹参素浓度为10～1000g/L，过滤，调节滤液pH至6.5～9.0；
(5)重结晶纯化：将步骤(4)所得浓缩液转移至洁净区，加入有机溶剂，经过滤浓缩重结晶，最后得得高纯度丹参素钠。
进一步地，本发明的提取工艺，包括以下步骤：
(1)渗漉提取：取中药材丹参去除杂质，使用粉碎机粉碎至10～50目，过筛2-3次，然后将丹参粉倒入渗漉桶中，室温条件下加入丹参药材质量的8～12倍混合溶剂浸泡1～24h，后进行渗漉提取，控制渗漉速度为1～4ml/min/Kg，采用混合溶剂室温条件下渗漉提取可有效去除脂溶性成分和水溶胶体状杂质和金属离子，所得提取液于低温(小于60℃)减压浓缩至无有机溶剂味，过滤，滤液继续浓缩至加入渗滤液总体积1/5～1/30，离心去除沉淀，得浓缩液；
(2)丹参总酚酸转化为丹参素：取步骤(1)得到浓缩液加入反应釜中，同时采用高效液相色谱仪(HPLC)测定浓缩液中丹酚酸B的含量，以质量比丹酚酸B：碱＝0.5:1～5:1的比例向反应釜中加入碱，在氮气环境中温度50～110℃下加热反应0.5～3h，冷却至室温，过滤，滤液用酸调节pH值至1.0～5.0，离心得上清液；
(3)分离：采用高效液相色谱仪测定步骤(2)得到上清液中丹参素的含量，采用大孔树脂作为树脂填料，树脂填料的用量为丹参素质量的100～400倍，所述树脂柱的径高比为1:6～1:9；在进行纯化时，先以1～4BV的去离子水洗脱(流速：0.2～4BV/h)，除去水溶性杂质；再以3～8BV的去离子水洗脱(流速：0.2～4BV/h)，收集该部分得收集液；
(4)调节pH：将步骤(3)收集液在温度50～70℃减压浓缩至收集液总体积的1/10～1/200，过滤，高效液相色谱仪测定丹参素的浓度，继续浓缩至丹参素浓度为10～1000g/L，过滤，滤液用碱调节pH至6.5～9.0；
(5)重结晶纯化：将步骤(4)已调节好pH值浓缩液转移至洁净区，加入0.5～10倍体积有机溶剂，常温静置10～36h，过滤，滤液减压浓缩至1/2～1/100体积，加入0.5～10倍体积有机溶剂重结晶，常温静置10～36h得结晶，过滤，干燥获得高纯度丹参素钠。
进一步的，所述步骤(1)中的混合溶剂选自水、甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃、丙酮、二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷、氯仿、乙醚、甲苯中的一种或几种，以任意比例混合即可。
进一步的，所述混合溶剂选自水、甲醇、乙醇、乙腈、四氢呋喃、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚中的任意两种，以1％～99％比例混合。
进一步的，所述混合溶剂为水与甲醇、乙醇、乙腈、四氢呋喃或丙酮以10％～80％比例混合。
进一步的，所述步骤(2)中的碱为NaOH、KOH、Na2CO3或K2CO3；所述的酸为盐酸、乙酸或硫酸。
进一步的，所述步骤(3)中的大孔树脂为HP20、D101、AB-8、HPD100、LS-8或ADS-8型大孔吸附树脂。
进一步的，所述大孔树脂为HP20、D101或AB-8型大孔吸附树脂。
进一步的，所述大孔树脂为HP20型大孔吸附树脂。
进一步的，所述步骤(5)中的有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、四氢呋喃、丙酮、二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺，二甲基亚砜、乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷、氯仿、乙醚或甲苯。
进一步的，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、四氢呋喃、丙酮、二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺，乙酸乙酯、二氯甲烷或乙醚。
进一步的，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯或乙醚。
进一步的，所述步骤(1)中的渗漉提取：中药材丹参粉碎机粉碎至10～40目，室温条件下加入8～11倍混合溶剂浸泡，控制渗漉速度为1.5～3.5ml/min/Kg，滤液继续浓缩至加入渗滤液总体积1/10～1/20。
进一步的，所述渗漉提取：中药材丹参粉碎机粉碎至20目，室温条件下加入10倍混合溶剂浸泡，控制渗漉速度为2ml/min/Kg，滤液继续浓缩至加入渗滤液总体积1/15。
进一步的，所述步骤(3)中的分离：树脂填料的用量为丹参素质量的150～350倍，所述树脂柱的径高比为1:7～1:8；在进行纯化时，先以1～3BV的去离子水洗脱(流速：0.2～2BV/h)，除去水溶性杂质；再以4～7BV的去离子水洗脱(流速：0.2～2BV/h)，收集该部分得收集液。
进一步的，所述分离：树脂填料的用量为丹参素质量的250倍，所述树脂柱的径高比为1:7；在进行纯化时，先以2.5BV的去离子水洗脱(流速：1BV/h)，除去水溶性杂质；再以6BV的去离子水洗脱(流速：1BV/h)，收集该部分得收集液。
进一步的，所述步骤(5)中的重结晶纯化：加入1～9倍体积有机溶剂，常温静置12～24h，过滤，滤液减压浓缩至1/2～1/60体积，加入1～9倍体积有机溶剂重结晶，常温静置12～24h得结晶。
进一步的，所述重结晶纯化：加入2倍体积有机溶剂，常温静置24h，过滤，滤液减压浓缩至浓度为100g/L，加入4倍体积有机溶剂重结晶，常温静置24h得结晶。
与现有技术相比本发明的有益效果：
本发明的高纯度丹参素钠提取工艺操作简单、方便、低成本，所制备的高纯度丹参素钠对肌肉组织无刺激、安全性高。本发明可实现大批量、规模化地制备高纯度丹参素钠，完全满足工业化生产要求，且经济效益突出。
附图说明
图1是含量99.45％的丹参素钠的HPLC分析色谱图；
图2是丹参素钠给药组肌肉组织病理切片HE染色图，×100。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中所用试剂及原料均可通过市售获得。
实施例1
(1)渗漉提取：取中药材丹参50Kg去除杂质，使用粉碎机粉碎至10目，过筛3次，然后将丹参粉倒入渗漉桶中，室温条件下加入600L乙醇:水(60:40)混合溶液浸泡1h，后进行渗漉提取，控制渗漉速度为2ml/min/Kg。所得提取液过滤，滤液于50℃减压浓缩至总体积30L，离心去除沉淀；
(2)丹参总酚酸转化为丹参素：取步骤(1)得到浓缩液加入反应釜中，同时采用高效液相色谱仪测定浓缩液中丹酚酸B的含量为1.9Kg，向反应釜中加入氢氧化钾1Kg，在氮气环境中温度100℃下加热反应1h，冷却至室温，过滤，滤液用盐酸调节pH值至3.0；
(3)分离：采用高效液相色谱仪测定步骤(2)得到上清液中丹参素的含量为1.1Kg，采用D101型大孔树脂作为树脂填料，树脂填料的用量为丹参素质量的200L，所述树脂柱的径高比为1:9。在进行纯化时，先以400L去离子水洗脱(流速：170L/h)，除去水溶性杂质；再以1200L去离子水洗脱(流速：170L/h)，收集该部分。
(4)调节pH：将步骤(3)收集液在温度60℃减压浓缩至总体积20L，过滤，高效液相色谱仪测定丹参素的浓度为50g/L，过滤，滤液用碳酸钠调节pH至7.0；
(5)重结晶纯化：将步骤(4)已调节好pH值浓缩液转移至洁净区，加入20L乙醇，常温静置24h，过滤，滤液减压浓缩至2L，加入8L乙醇重结晶，常温静置24h，析出结晶，过滤，干燥获得高纯度丹参素钠，称重0.89Kg，经测定纯度为99.36％。
实施例2
(1)渗漉提取：取中药材丹参100Kg去除杂质，使用粉碎机粉碎至20目，过筛3次，然后将丹参粉倒入渗漉桶中，室温条件下加入200L甲醇:水(70:30)混合溶液浸泡4h，后进行渗漉提取，控制渗漉速度为2ml/min/Kg。所得提取液过滤，滤液于50℃减压浓缩至总体积100L，离心去除沉淀；
(2)丹参总酚酸转化为丹参素：取步骤(1)得到浓缩液加入反应釜中，同时采用高效液相色谱仪测定浓缩液中丹酚酸B的含量为6Kg，向反应釜中加入氢氧化钠10Kg，在氮气环境中温度100℃下加热反应1h，冷却至室温，过滤，滤液用稀盐酸调节pH值至1.0；
(3)分离：采用高效液相色谱仪测定步骤(2)得到上清液中丹参素的含量为5Kg，采用HP-20型大孔树脂作为树脂填料，树脂填料的用量1000L，所述树脂柱的径高比为1:7。在进行纯化时，先以1000L去离子水洗脱(流速：150L/h)，除去水溶性杂质；再以3000L去离子水洗脱(流速：150L/h)，收集该部分。
(4)调节pH：将步骤(3)收集液在温度60℃减压浓缩至总体积45L，过滤，高效液相色谱仪测定丹参素的浓度为100g/L，过滤，滤液用氢氧化钠调节pH至7.5；
(5)重结晶纯化：将步骤(4)已调节好pH值浓缩液转移至洁净区，加入90L甲醇，常温静置24h，过滤，滤液减压浓缩至10L，加入40L甲醇：丙酮：二氯甲烷(50:30：20)混合溶液重结晶，常温静置24h，析出结晶，过滤，干燥获得高纯度丹参素钠，称重3.5Kg，经测定纯度为99.67％。
实施例3
(1)渗漉提取：取中药材丹参250Kg去除杂质，使用粉碎机粉碎至20目，过筛3次，然后将丹参粉倒入渗漉桶中，室温条件下加入3000L丙酮:水(20:80)混合溶液浸泡8h，后进行渗漉提取，控制渗漉速度为2ml/min/Kg。所得提取液过滤，滤液于50℃减压浓缩至总体积150L，离心去除沉淀；
(2)丹参总酚酸转化为丹参素：取步骤(1)得到浓缩液加入反应釜中，同时采用高效液相色谱仪测定浓缩液中丹酚酸B的含量为9.4Kg，向反应釜中加入氢氧化钠9.4Kg，在氮气环境中温度100℃下加热反应1h，冷却至室温，过滤，滤液用盐酸调节pH值至2.0；
(3)分离：采用高效液相色谱仪测定步骤(2)得到上清液中丹参素的含量为6.8Kg，采用HP-20型大孔树脂作为树脂填料，树脂填料的用量为丹参素质量的1400L，所述树脂柱的径高比为1:9。在进行纯化时，先以2000L去离子水洗脱(流速：170L/h)，除去水溶性杂质；再以6000L去离子水洗脱(流速：170L/h)，收集该部分。
(4)调节pH：将步骤(3)收集液在温度60℃减压浓缩至总体积100L，过滤，高效液相色谱仪测定丹参素的浓度为60g/L，过滤，滤液用氢氧化钠调节pH至8.0；
(5)重结晶纯化：将步骤(4)已调节好pH值浓缩液转移至洁净区，加入100L丙酮，常温静置24h，过滤，滤液减压浓缩至20L，加入80L丙酮重结晶，常温静置24h，析出结晶，过滤，干燥获得高纯度丹参素钠，称重5.3Kg，经测定纯度为99.45％，纯度结果(如图1所示)。
实施例4
(1)渗漉提取：取中药材丹参500Kg去除杂质，使用粉碎机粉碎至30目，过筛3次，然后将丹参粉倒入渗漉桶中，室温条件下加入7000L甲醇：丙酮:水(40:40:20)混合溶液浸泡16h，后进行渗漉提取，控制渗漉速度为2ml/min/Kg。所得提取液过滤，滤液于50℃减压浓缩至总体积300L，离心去除沉淀；
(2)丹参总酚酸转化为丹参素：取步骤(1)得到浓缩液加入反应釜中，同时采用高效液相色谱仪测定浓缩液中丹酚酸B的含量为30Kg，向反应釜中加入氢氧化钠30Kg，在氮气环境中温度100℃下加热反应1h，冷却至室温，过滤，滤液用盐酸调节pH值至3.0；
(3)分离：采用高效液相色谱仪测定步骤(2)得到上清液中丹参素的含量为23.7Kg，采用AB-8型大孔树脂作为树脂填料，树脂填料的用量为丹参素质量的3000L，所述树脂柱的径高比为1:7。在进行纯化时，先以6000L去离子水洗脱(流速：150L/h)，除去水溶性杂质；再以12000L去离子水洗脱(流速：150L/h)，收集该部分。
(4)调节pH：将步骤(3)收集液在温度60℃减压浓缩至总体积200L，过滤，高效液相色谱仪测定丹参素的浓度为90g/L，过滤，滤液用氢氧化钠调节pH至8.5；
(5)重结晶纯化：将步骤(4)已调节好pH值浓缩液转移至洁净区，加入200L乙酸乙酯，常温静置24h，过滤，滤液减压浓缩至50L，加入150L乙醇重结晶，常温静置24h，析出结晶，过滤，干燥获得高纯度丹参素钠，称重10.4Kg，经测定纯度为99.15％。
实施例5
(1)渗漉提取：取中药材丹参500Kg去除杂质，使用粉碎机粉碎至30目，过筛3次，然后将丹参粉倒入渗漉桶中，室温条件下加入6000L乙醇：乙酸乙酯:水(60:10:30)混合溶液混合溶液浸泡24h，后进行渗漉提取，控制渗漉速度为2ml/min/Kg。所得提取液过滤，滤液于50℃减压浓缩至总体积400L，离心去除沉淀；
(2)丹参总酚酸转化为丹参素：取步骤(1)得到浓缩液加入反应釜中，同时采用高效液相色谱仪测定浓缩液中丹酚酸B的含量为21Kg，向反应釜中加入氢氧化钠25Kg，在氮气环境中温度100℃下加热反应1h，冷却至室温，过滤，滤液用盐酸调节pH值至3.0；
(3)分离：采用高效液相色谱仪测定步骤(2)得到上清液中丹参素的含量为22.7Kg，采用LS-18型大孔树脂作为树脂填料，树脂填料的用量为丹参素质量的3000L，所述树脂柱的径高比为1:6。在进行纯化时，先以3000L去离子水洗脱(流速：200L/h)，除去水溶性杂质；再以12000L去离子水洗脱(流速：200L/h)，收集该部分。
(4)调节pH：将步骤(3)收集液在温度60℃减压浓缩至总体积200L，过滤，高效液相色谱仪测定丹参素的浓度为100g/L，过滤，滤液用氢氧化钠调节pH至8.0；
(5)重结晶纯化：将步骤(4)已调节好pH值浓缩液转移至洁净区，加入200L二氯甲烷，常温静置24h，过滤，滤液减压浓缩至100L，加入400L丙酮重结晶，常温静置24h，析出结晶，过滤，干燥获得高纯度丹参素钠，称重9.2Kg，经测定纯度为99.27％。
实施例6
(1)渗漉提取：取中药材丹参500Kg去除杂质，使用粉碎机粉碎至10目，过筛3次，然后将丹参粉倒入渗漉桶中，室温条件下加入6000L正丁醇：丙酮：水(60:30：10)混合溶液浸泡16h，后进行渗漉提取，控制渗漉速度为2ml/min/Kg。所得提取液过滤，滤液于50℃减压浓缩至总体积200L，离心去除沉淀；
(2)丹参总酚酸转化为丹参素：取步骤(1)得到浓缩液加入反应釜中，同时采用高效液相色谱仪测定浓缩液中丹酚酸B的含量为21.2Kg，向反应釜中加入氢氧化钠21.2Kg，在氮气环境中温度100℃下加热反应1h，冷却至室温，过滤，滤液用盐酸调节pH值至2.0；
(3)分离：采用高效液相色谱仪测定步骤(2)得到上清液中丹参素的含量为19.3Kg，采用HPD-100型大孔树脂作为树脂填料，树脂填料的用量为丹参素质量的2500L，所述树脂柱的径高比为1:9。在进行纯化时，先以2500L去离子水洗脱(流速：300L/h)，除去水溶性杂质；再以10000L去离子水洗脱(流速：300L/h)，收集该部分。
(4)调节pH：将步骤(3)收集液在温度60℃减压浓缩至总体积200L，过滤，高效液相色谱仪测定丹参素的浓度为90g/L，过滤，滤液用氢氧化钠调节pH至8.0；
(5)重结晶纯化：将步骤(4)已调节好pH值浓缩液转移至洁净区，加入300L乙醇，常温静置24h，过滤，滤液减压浓缩至60L，加入240L丙酮重结晶，常温静置24h，析出结晶，过滤，干燥获得高纯度丹参素钠，称重15.7Kg，经测定纯度为99.63％。
应用实施例
下面通过实验例进一步说明本发明所制备的高纯度丹参素钠对肌肉无刺激性，安全性高。
取新西兰兔子4只(雌雄各半，体重2.3Kg-2.5Kg)，动物采用同体侧自身对照法，左侧股四头肌做为受试物给药侧，给予5mg/ml丹参素钠水溶液；左侧股四头肌作为对照侧，给予5％葡萄糖注射液。肌肉注射给药，1次/日，共3次，给药量1ml/只。于每次给药前和给药后24h、48h肉眼观察家兔股四头肌注射部位，观察期结束后处死动物，剖取股四头肌，纵向切开，观察注射部位肌肉的刺激反应。并将剖取的注射部位肌肉做病理切片，做组织病理检查。
结果显示(如图2所示)：所有动物股四头肌于给药前后均未见明显异常；给药期间与观察期结束均未见其他明显肌肉刺激症状；组织病理学检查所有受试动物阴性对照侧及受试侧均未见明显异常。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述的实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可以做出种种的等同的变型或替换，这些等同变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (14)

1.一种高纯度丹参素钠的提取工艺，包括：通过采用混合溶剂对中药材丹参进行渗漉提取，然后测定浓缩液中丹酚酸B的含量并加入碱进行反应，再经大孔吸附树脂纯化分离后，加入有机溶剂进行重结晶纯化，最后制得高纯度丹参素钠。
2.根据权利要求1所述的一种高纯度丹参素钠的提取工艺，包括以下步骤：
(1)渗漉提取：取中药材丹参经预处理后，于混合溶剂中浸泡1～24h，然后进行渗漉提取，控制渗漉速度为1～4ml/min/Kg，提取液经减压浓缩后离心去除沉淀，得浓缩液；
(2)丹参总酚酸转化为丹参素：测定步骤(1)所得浓缩液中丹酚酸B的含量，以质量比丹酚酸B：碱＝0.5:1～5:1的比例加入碱，在氮气环境中温度50～110℃下加热反应0.5～3h，冷却、过滤，调节滤液pH值至1.0～5.0，离心得上清液；
(3)分离：测定步骤(2)所得上清液中丹参素的含量，采用大孔树脂作为树脂填料进行纯化洗脱得收集液，树脂填料的用量为丹参素质量的100～400倍；
(4)调节pH：将步骤(3)收集液在温度50～70℃减压浓缩至收集液总体积的1/10～1/200，过滤，继续浓缩至丹参素浓度为10～1000g/L，过滤，调节滤液pH至6.5～9.0；
(5)重结晶纯化：将步骤(4)所得浓缩液转移至洁净区，加入有机溶剂，经过滤浓缩重结晶，最后得得高纯度丹参素钠。
3.根据权利要求1所述的一种高纯度丹参素钠的提取工艺，包括以下步骤：
(1)渗漉提取：取中药材丹参去除杂质，粉碎至10～50目，过筛2-3次，然后将丹参粉倒入渗漉桶中，室温条件下加入丹参药材质量的8～12倍混合溶剂浸泡1～24h，后进行渗漉提取，控制渗漉速度为1～4ml/min/Kg，所得提取液于小于60℃减压浓缩至无有机溶剂味，过滤，滤液继续浓缩至加入渗滤液总体积1/5～1/30，离心去除沉淀，得浓缩液；
(2)丹参总酚酸转化为丹参素：取步骤(1)得到浓缩液加入反应釜中，同时测定浓缩液中丹酚酸B的含量，以质量比丹酚酸B：碱＝0.5:1～5:1的比例向反应釜中加入碱，在氮气环境中温度50～110℃下加热反应0.5～3h，冷却至室温，过滤，滤液用酸调节pH值至1.0～5.0，离心得上清液；
(3)分离：测定步骤(2)所得上清液中丹参素的含量，采用大孔树脂作为树脂填料，树脂填料的用量为丹参素质量的100～400倍，所述树脂柱的径高比为1:6～1:9；在进行纯化时，先以1～4BV的去离子水洗脱，流速：0.2～4BV/h，除去水溶性杂质；再以3～8BV的去离子水洗脱，流速：0.2～4BV/h，收集该部分得收集液；
(4)调节pH：将步骤(3)收集液在温度50～70℃减压浓缩至收集液总体积的1/10～1/200，过滤，测定丹参素的浓度，继续浓缩至丹参素浓度为10～1000g/L，过滤，滤液用碱调节pH至6.5～9.0；
(5)重结晶纯化：将步骤(4)已调节好pH值浓缩液转移至洁净区，加入0.5～10倍体积有机溶剂，常温静置10～36h，过滤，滤液减压浓缩至1/2～1/100体积，加入0.5～10倍体积有机溶剂重结晶，常温静置10～36h得结晶，过滤，干燥获得高纯度丹参素钠。
4.根据权利要求1-3任一项所述的一种高纯度丹参素钠的提取工艺，其特征在于：所述步骤(1)中的混合溶剂选自水、甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃、丙酮、二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷、氯仿、乙醚、甲苯中的一种或几种，以任意比例混合即可。
5.根据权利要求4所述的一种高纯度丹参素钠的提取工艺，其特征在于：所述混合溶剂选自水、甲醇、乙醇、乙腈、四氢呋喃、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚中的任意两种，以1％～99％比例混合。
6.根据权利要求1-3任一项所述的一种高纯度丹参素钠的提取工艺，其特征在于：所述步骤(2)中的碱为NaOH、KOH、Na2CO3或K2CO3。
7.根据权利要求3所述的一种高纯度丹参素钠的提取工艺，其特征在于：所述步骤(2)中的酸为盐酸、乙酸或硫酸。
8.根据权利要求1-3任一项所述的一种高纯度丹参素钠的提取工艺，其特征在于：所述步骤(3)中的大孔树脂为HP20、D101、AB-8、HPD100、LS-8或ADS-8型大孔树脂。
9.根据权利要求7所述的一种高纯度丹参素钠的提取工艺，其特征在于：所述大孔树脂为HP20、D101或AB-8型大孔吸附树脂。
10.根据权利要求1-3任一项所述的一种高纯度丹参素钠的提取工艺，其特征在于：所述步骤(5)中的有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、四氢呋喃、丙酮、二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺，二甲基亚砜、乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷、氯仿、乙醚或甲苯。
11.根据权利要求9所述的一种高纯度丹参素钠的提取工艺，其特征在于：所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、四氢呋喃、丙酮、二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺，乙酸乙酯、二氯甲烷或乙醚。
12.根据权利要求1-3任一项所述的一种高纯度丹参素钠的提取工艺，其特征在于：所述步骤(1)中的渗漉提取：中药材丹参粉碎至10～40目，室温条件下加入8～11倍混合溶剂浸泡，控制渗漉速度为1.5～3.5ml/min/Kg，滤液继续浓缩至加入渗滤液总体积1/10～1/20。
13.根据权利要求1-3任一项所述的一种高纯度丹参素钠的提取工艺，其特征在于：所述步骤(3)中的分离：树脂填料的用量为丹参素质量的150～350倍，所述树脂柱的径高比为1:7～1:8；在进行纯化时，先以1～3BV的去离子水洗脱，流速：0.2～2BV/h,，除去水溶性杂质；再以4～7BV的去离子水洗脱，流速：0.2～2BV/h，收集该部分得收集液。
14.根据权利要求1-3任一项所述的一种高纯度丹参素钠的提取工艺，其特征在于：所述步骤(5)中的重结晶纯化：加入1～9倍体积有机溶剂，常温静置12～24h，过滤，滤液减压浓缩至1/2～1/60体积，加入1～9倍体积有机溶剂重结晶，常温静置12～24h得结晶。
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