CN107298642B - 一种6-姜烯酚的提取纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种6‑姜烯酚的提取纯化方法，以生姜、干姜为原料，将所述原料切碎/（或粉碎后）采用70%乙醇，40‑55℃水浴浸提；过滤药渣后，提取液经减压蒸馏得浓缩液；浓缩液分别经石油醚萃取去除杂质、乙酸乙酯萃取6‑姜烯酚成分；上述萃取液除去溶剂后，乙酸乙酯萃取部分经硅胶柱层析，石油醚：乙酸乙酯（6:1~2:1）梯度洗脱，分离收集R_f=0.38（石油醚:乙酸乙酯=3:1）的组分，得分离6‑姜烯酚粗品。6‑姜烯酚粗品进一步经薄层制备层析分离得6‑姜烯酚纯品，纯品经¹HNMR和¹³CNMR表征。该方法操作简单，材料成本低廉，节约时间，纯度好。所得6‑姜烯酚产品可用作含姜、姜烯酚的医药制剂、药理研究、化妆品、日化品等的质量控制的标准品。

Description

一种6-姜烯酚的提取纯化方法

技术领域

本发明属于天然药物、中草药中活性成分提取及纯化领域。本发明从生姜中提取和纯化6-姜烯酚。

背景技术

姜是姜科植物姜的鲜嫩茎。生姜药食两用，能解表散热，温中止呕。在《本草纲目》中有记载，生姜能够治疗“疟疾寒热(脾胃聚痰，发为寒热)、寒热痰嗽、霍乱转筋，入腹欲死、胸胁满痛(心胸、胁下，硬痛胀满)、大便不通、湿热发黄、满口烂疮、牙齿疼痛、中药毒、刀斧伤、闪扭手足、跌打损伤、腋下狐臭、赤白癜风、两耳冻疮、诸毒痔漏，久不结痂”。(赵文竹,张瑞雪,于志鹏,等.生姜的化学成分及生物活性研究进展[J].食品工业科技,2016,(11):383-389.)。生姜提取物广泛应用于制药、化妆品、日化品中。6-姜烯酚是生姜中的活性成分之一，分子结构如式Ⅰ。它具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等生物学活性。[周萍，彭咏波，李萍，6-姜烯酚抗肿瘤机制研究进展，中南药学，2012，10(7)：536-537；Na JY，Song K，Lee JW，KimS，Kwon J，Pretreatment of 6-shogaol attenuates oxidative stress andinflammation in middle cerebral artery occlusion-induced mice，EUROPEANJOURNAL OF PHARMACOLOGY，2016，788:241-247。]

现有技术中，6-姜烯酚的提取纯化方法主要有以下几种：

(1)将姜超临界流体萃取物(6-姜烯酚的含量约为2.5％)与含乙醇的酸水液混合后加热回流，再分离、精制。酸水反应处理后提取物中6-姜烯酚的含量可达20％。[李萍；彭咏波；马江；齐炼文；刘慧；成小兰；一种6-姜烯酚的制备方法，申请号：CN200910232593.3。]

(2)姜超临界流体萃取物或干姜提取物经含乙醇的酸水加热回流提取，回收乙醇，酸水液用乙酸乙酯萃取，减压回收乙酸乙酯得到萃取后浓缩物，浓缩物过硅胶色谱柱、用石油醚和乙酸乙酯梯度洗脱，收集洗脱液浓缩，即得。硅胶柱层析分离得到的姜烯酚类组合物，含量可达60～65％。[齐炼文；李萍；马江，一种姜烯酚提取物的制备方法及其医药用途，申请号：CN201110148248.9]。

(3)从天堂椒中提取分离6-姜烯酚的方法。原料天堂椒粉碎，采用亚临界萃取，得油浸膏；将油浸膏采用乙醇溶解，然后采用溶剂萃取，浓缩至浸膏；采用柱分离，根据薄层斑点，收集含有6-姜烯酚的洗脱液，浓缩，放置结晶。所获粗品进一步重结晶，干燥后即得6-姜烯酚。[肖红；王晓莹；张瑜；肖金霞；郭文华；一种天堂椒的用途及从天堂椒中提取分离6-姜烯酚的方法，CN201611104828.7].

(4)以生姜95％乙醇提取物用石油醚脱脂,乙酸乙酯萃取,乙酸乙酯相过D4020型大孔吸附树脂,依次用25％、50％、75％乙醇溶液洗脱得组分FrA和FrB。FrB以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(12：10：15：10,v/v/v/v)为溶剂系统,经高速逆流色谱HSCCC-D1200分离得到组分6-姜烯酚。[乔庆亮，生姜中酚类化合物的分离制备研究，硕士学位论文，浙江工商大学,杭州市，2011。]

(5)干姜样品的乙酸乙酯提取物，经硅胶柱层析分离得到6-姜烯酚粗品，再经高速逆流色谱分离，得到纯度较好的6-姜烯酚，纯度可以以¹HNMR表征结构。[徐美霞，王晓，刘建华，耿岩玲，王岱杰，刘峰，高速逆流色谱结合硅胶柱色谱法分离制备干姜中的6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚，2013,26(2)：61-65.]

上述方法(1)和方法(2)的提取方法为超临界流体萃取；方法(1)的分离和纯化过程采用了酸水反应，方法(2)在方法(1)的基础上进一步用石油醚、乙酸乙酯萃取、硅胶柱层析。但这两种方法的产物的纯度分别是20％，和60-65％，非纯品，不适合用于药理实验，产品不适于作为标准品。

上述方法(3)在柱层析的基础上利用重结晶的方法纯化。因6-姜烯酚的熔点低，室温下易液化，重结晶的过程中难以析出固体，对后续过滤造成困扰，并且从理论上说产品在这一步骤中在母液中有一定的溶解度，因此损失大。上述方法(4)和方法(5)两种方法均经过了两步纯化。在制备中使用了高速逆流色谱，成本高，单次处理的样品量小。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种从生姜中提取纯化6-姜烯酚的方法，解决现有技术提取效率不高、成本高和纯度不高的问题。

解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种6-姜烯酚的提取纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)以生姜、干姜为原料，将所述原料粉碎并加入70％的乙醇中于40-55℃下浸泡提取10～23h；其中，所述原料与溶剂的质量体积比为1g:6～15mL；

2)步骤1)浸泡完成后，纱布过滤，滤液再用布氏漏斗抽滤，除去固体残渣；将浸提液转入烧瓶中，搭建好减压蒸馏装置，开始进行减压蒸馏，待所述馏出液的体积为所述溶剂的70％～80％时停止减压蒸馏，得浸提液的浓缩溶液，转移至分液漏斗中；

3)向步骤2)所得的浓缩液中，加入石油醚萃取，所用石油醚与浓缩液的的体积比为1:1～1:3；石油醚萃取后的下层溶液用乙酸乙酯萃取，所述乙酸乙酯与下层溶液的体积比为1:1～1:3；萃取3次，合并上相萃取液；经旋转蒸发仪蒸发除去溶剂得棕色油状物；

4)向步骤3)所得棕色油状物进行硅胶柱层析；硅胶用量与棕色油状物的质量比为15：1～40:1；以石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂为淋洗剂，其体积比为6:1～2:1，进行梯度洗脱；以石油醚+乙酸乙酯(3:1)为展开剂，对收集的柱后淋洗液进行薄层层析，收集R_f＝0.38的组分，得粗制品；

5)对步骤4)中所得粗制品以薄层制备色谱进一步纯化；

(1)制备薄层层析硅胶板：称取薄层层析硅胶放入研钵中，硅胶与样品的质量比为50:1～30:1；按照与硅胶质量比为3:1的比例加入5‰的羧甲基纤维素钠的水溶液，用研磨棒研磨均匀，直至没有气泡；将上述硅胶匀浆均匀平铺在洗净干燥的玻璃板上，自然晾干；于110℃下活化2小时，待冷却后取出；

(2)纯化：将粗制6-姜烯酚在石油醚+乙酸乙酯中进行薄层展开，粗制6-姜烯酚与步骤(1)所述薄层层析硅胶板的质量比为1:50～1:30；展开剂为石油醚：乙酸乙酯5:1～2:1。

进一步，所述步骤1)中所述生姜原料与水的质量体积比为1g:6～10mL；所述干姜原料与水的质量体积比为1g:10～15mL。

进一步，步骤4)柱层析分离中，硅胶用量与膏状物的质量比为20:1；以石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂为淋洗剂，依次进行梯度洗脱，石油醚:乙酸乙酯(体积比6:1)，用量与硅胶量比为5mL:1g；石油醚:乙酸乙酯(体积比5:1)，用量与硅胶量比为2.5mL:1g，石油醚:乙酸乙酯(4:1)，用量与硅胶量比为2.5mL:1g；石油醚:乙酸乙酯(3:1)，用量与硅胶量比为3mL:1g，石油醚:乙酸乙酯(2:1)，用量与硅胶量比为2.0mL:1g。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明采用柱层析后，以硅胶薄层制备的方法进一步纯化6-姜烯酚，方法简单，不需要仪器操作，单次处理样品量大，目标成分几乎不损失，回收率高，所需的薄层制备硅胶板可以自己制作或者商品板，价格低廉。该方法所得样品纯度极高，可以作为6-姜烯酚样品鉴别和含量测定中的标准品。

2、本发明在6-姜烯酚粗品进一步精制纯化的过程中，采用薄层色谱制备的方法，比传统的重结晶方法损失小，收率高；所得6-姜烯酚产品可用作含姜、姜烯酚的医药制剂、药理研究、化妆品、日化品等的质量控制的标准品。与采用高速逆流色谱的纯化方法相比，该发明制备6-姜烯酚纯品不需要使用仪器，单次分离量高，节约了人力、物力成本；与制备HPLC精制纯化的方法相比，操作简单，材料成本低廉，节约时间，纯度好。与其它提取纯化方法比，该发明在纯化过程中，几乎不损失目标成分，收率高。

附图说明

图1是本发明6-姜烯酚的提取方法流程图；

图2是本发明实施例中6-姜烯酚的¹HNMR图谱；

图3是本发明实施例中6-姜烯酚的¹³CNMR图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。

参见图1，一种6-姜烯酚的提取纯化方法，以生姜、干姜为原料，将所述原料粉碎采用70％乙醇，40-55℃水浴浸提。过滤药渣后，提取液经减压蒸馏得浓缩液。浓缩液分别经石油醚萃取去除杂质、乙酸乙酯萃取6-姜烯酚成分。上述萃取液除去溶剂后，乙酸乙酯萃取部分经硅胶柱层析，石油醚：乙酸乙酯(6:1～2:1)梯度洗脱，分离收集R_f＝0.38(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)的组分，得硅胶柱层析分离6-姜烯酚粗品。6-姜烯酚粗品进一步经薄层制备层析分离得6-姜烯酚纯品，纯品经¹HNMR和¹³CNMR表征。

具体实施例步骤如下：

1、溶剂浸提法提取生姜中的有效成分

取无损伤、无霉变、无腐烂的新鲜生姜洗净，削去表皮，切成薄片，剁成姜末，备用。

称取新鲜生姜末1350.0g，加入13500mL70％乙醇，55℃水浴浸提6-15h，抽滤，得黄色提取液13000mL。在t＝55℃下减压蒸馏，将上述黄色提取液中的多数溶剂蒸出。

2、有效成分初步萃取分离

以石油醚(60-90℃)对上述生姜粗提液进行萃取，重复三次，将萃取之后石油醚层合并，得到5000mL淡黄色液体。在t＝20℃下采用真空蒸发，将上述淡黄色液体中的多数溶剂蒸出，浓缩至约4mL移入西林瓶中，为黄色澄清透明状液体。在西林瓶中加入无水MgSO4固体(3.5g)，密封，静止1天，过滤，用石油醚洗涤三次，将滤液合并。真空蒸发除去溶剂，真空干燥，称重，得到3.2317g淡黄色油状物，为石油醚萃取液。

3、乙酸乙酯萃取

对上述石油醚萃取后的下层液以乙酸乙酯进行萃取，重复萃取三次，将萃取之后的乙酸乙酯层合并，得到6000mL金黄色液体。在30℃下真空蒸发蒸出溶剂，浓缩至约5mL移入西林瓶中，得到棕色溶液。在西林瓶中加入无水MgSO₄固体(3.0g)，密封，静置1天，过滤，以乙酸乙酯洗涤三次，将滤液溶剂真空蒸发后，称重，得到4.8724g深棕色液体，为乙酸乙酯萃取液。

4、硅胶柱层析分离6-姜烯酚

称取70.0g柱层析硅胶，加入适量洗脱剂(石油醚:乙酸乙酯为6:1)，使二者混合均匀，装柱。乙酸乙酯萃取液以石油醚:乙酸乙酯为6:1溶解样品上样。分别以石油醚:乙酸乙酯(6:1)(300mL)、石油醚:乙酸乙酯(5:1)(280mL)、石油醚:乙酸乙酯(4:1)(100mL)、石油醚:乙酸乙酯(3:1)(120mL)进行洗脱。以薄层色谱(TLC)检测洗脱液中的有效成分，合并含组分R_f＝0.38(以石油醚:乙酸乙酯(5:1)展开)洗脱液。以旋转蒸发仪真空蒸发，得到粗制6-姜烯酚79.7mg。

5、6-姜烯酚的薄层色谱法精制

薄层层析硅胶板的制备：称取10.0g薄层层析硅胶放入研钵中，以1:3的比例加入30mL 5‰的羧甲基纤维素钠水溶液，用研磨棒研磨均匀，直至没有气泡；用药匙将适量上述硅胶匀浆均匀平铺在洗净干燥的玻璃板上，自然晾干。于110℃下活化2小时，待冷却后取出。

将粗制6-姜烯酚在石油醚+乙酸乙酯中进行薄层展开。将R_f＝0.38的硅胶带刮下，置于100mL锥形瓶中。以乙酸乙酯提取活性成分(15mL×3)，合并提取液，过滤。滤液以旋转蒸发仪真空蒸发，得黄色油状液体，干燥，称重70.3mg。¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ:6.82(d,J＝8.0Hz,1H),6.80(dd,J＝15.9,6.7Hz,1H),6.68(d,J＝2.0Hz,1H),6.66(dd,J＝2.0,8.0Hz,1H),6.04(d,J＝15.9Hz,1H),3.87(s,3H),3.20(t,J＝7.5Hz,2H),2.58(t,J＝7.5Hz,2H),2.24(m,2H),1.20-1.35(m,6H),0.88(t,J＝6.9Hz,3H).¹³C NMR(600MHz,CDCl₃)δ:194.26,146.34,145.76,143.92,132.63,129.99,120.78,114.26,110.84,55.85,40.52,34.06,31.31,29.31,27.18,22.64,14.09。

由此可见，本发明在6-姜烯酚粗品进一步精制纯化的过程中，采用薄层色谱制备的方法，最终6-姜烯酚的收率为52.1mg/kg，与文献([肖红；王晓莹；张瑜；肖金霞；郭文华；一种天堂椒的用途及从天堂椒中提取分离6-姜烯酚的方法，CN201611104828.7])中报道的生姜中6-姜烯酚的含量约为0.005％相近(与生姜的栽培、产地等因素相关)，说明该法收率高。产品的纯度高，图2中¹HNMR图显示，除了扫描NMR图谱时人为加入的氘代氯仿溶剂产生的化学位移7.26ppm峰外，未见其它含H原子的杂质所产生的峰，图3中¹³CNMR谱进一步证实了该产品纯度好。产品6-姜烯酚纯度满足研究药理活性、生姜提取物质量控制的标准品的要求。

该方法比高速逆流色谱、制备HPLC精制纯化的方法相比，操作简单，材料成本低廉，节约时间。所得6-姜烯酚产品可用作含姜、姜烯酚的医药制剂、药理研究、化妆品、日化品等的质量控制的标准品。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (2)

1.一种6-姜烯酚的提取纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）以生姜、干姜为原料，将所述原料粉碎并加入70%的乙醇中于40-55℃下浸泡提取10~23h；其中，所述原料与溶剂的质量体积比为1g:6~15mL；

2）步骤1）浸泡完成后，纱布过滤，滤液再用布氏漏斗抽滤，除去固体残渣；将浸提液转入烧瓶中，搭建好减压蒸馏装置，开始进行减压蒸馏，待所述馏出液的体积为所述溶剂的70%~80%时停止减压蒸馏，得浸提液的浓缩溶液，转移至分液漏斗中；

3）向步骤2）所得的浓缩液中，加入石油醚萃取，所用石油醚与浓缩液的的体积比为1:1~1:3；石油醚萃取后的下层溶液用乙酸乙酯萃取，所述乙酸乙酯与下层溶液的体积比为1:1~1:3；萃取3次，合并上相萃取液；经旋转蒸发仪蒸发除去溶剂得棕色油状物；

4）向步骤3）所得棕色油状物进行硅胶柱层析；硅胶用量与棕色油状物的质量比为15：1~40:1；以石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂为淋洗剂，其体积比为6:1~2:1，进行梯度洗脱；以体积比为3：1的石油醚和乙酸乙酯为展开剂，对收集的柱后淋洗液进行薄层层析，收集Rf=0.38的组分，得粗制品；所述柱层析分离中，硅胶用量与膏状物的质量比为20:1；以石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂为淋洗剂，依次进行梯度洗脱，体积比为6:1的石油醚和乙酸乙酯，其用量与硅胶量比为5mL:1g；体积比为5:1的石油醚和乙酸乙酯，其用量与硅胶量比为2.5mL:1g，体积比为4:1的石油醚和乙酸乙酯，其用量与硅胶量比为2.5mL:1g；体积比为3:1的石油醚和乙酸乙酯，其用量与硅胶量比为3mL:1g，体积比为2:1的石油醚和乙酸乙酯，其用量与硅胶量比为2.0mL:1g；

5）对步骤4）中所得粗制品以薄层制备色谱进一步纯化；

（1）制备薄层层析硅胶板：称取薄层层析硅胶放入研钵中，硅胶与样品的质量比为50:1~30:1；按照与硅胶质量比为3:1的比例加入5‰的羧甲基纤维素钠的水溶液，用研磨棒研磨均匀，直至没有气泡；将所得硅胶匀浆均匀平铺在洗净干燥的玻璃板上，自然晾干；于110℃下活化2小时，待冷却后取出；

（2）纯化：将粗制6-姜烯酚在石油醚+乙酸乙酯中进行薄层展开，粗制6-姜烯酚与步骤（1）所述薄层层析硅胶板的质量比为1:50~1:30；展开剂为石油醚：乙酸乙酯5:1~2:1。

2.根据权利要求1所述6-姜烯酚的提取纯化方法，其特征在于，步骤5）中所述展开剂为石油醚：乙酸乙酯3:1；展开距离10cm~25cm。

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