CN102260152A - 一种姜烯酚提取物的制备方法及其医药用途 - Google Patents

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齐炼文
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Abstract

本发明涉及天然药物领域，具体涉及一种6-姜烯酚提取物的制备方法及其医药用途。姜超临界流体萃取物或干姜提取物经含乙醇的酸水加热回流提取，回收乙醇，酸水液用乙酸乙酯萃取，减压回收乙酸乙酯得到萃取后浓缩物，浓缩物过硅胶色谱柱、用石油醚和乙酸乙酯梯度洗脱，收集洗脱液浓缩，即得，其中洗脱用的石油醚和乙酸乙酯分六个梯度洗脱，体积比依次为：50∶1、33∶1、25∶1、20∶1、17∶1、14∶1，收集14∶1的流分，浓缩即得。本发明的制备方法易于操作、成品质量好且产量高，只需转化后硅胶柱层析分离一遍即得姜烯酚类组合物，并且收率很高，可达60～65％，为工业化生产带来极大便利。

Description

一种姜烯酚提取物的制备方法及其医药用途
技术领域
本发明涉及天然药物领域，具体涉及一种6-姜烯酚提取物的制备方法及其医药用途。 
背景技术
姜来源于姜科姜属植物姜(Zingiber officinale Rosc.)的新鲜或干燥根茎。姜属于药食同源类中药，其临床应用相当广泛，国外对其关注程度亦较高。近年来，针对姜及其主要活性化学成分的化学和药理报道较为丰富。研究表明，姜酚类在姜中的含量很高，而姜烯酚类化合物为姜酚类的脱水产物，其含量较低。但是，在抗炎、抗氧化以及抗肿瘤等方面，姜烯酚类的活性作用均显著优于姜酚类化合物[Comparative antioxidant and anti-inflammatory effects of [6]-gingerol，[8]-gingerol，[10]-gingerol and[6]-shogaol.J Ethnopharmacol.2009 Oct 13；6-Shogaol，an active constituent of dietary ginger，induces autophagy by inhibiting the AKT/mTORpathway in human non-small cell lung cancer A549 cells.J Agric Food Chem.2009 Oct 28]。 
正因为姜烯酚类化合物在姜中的含量很低，从姜中大规模制备姜烯酚类化合物一直难以实现。这不仅制约了姜烯酚类化合物的活性研究，更给以姜烯酚类化合物为基础开展的姜类中药的药理和活性研究带来挑战。因此，姜烯酚类药物的制备对推进该类成分及姜类中药的药理活性研究具有重要的意义。 
发明人在前期研究中发明了一种从姜超临界萃取物中分离6-姜烯酚的方法，公开于CN101735030A中，先将姜的超临界萃取物于含乙醇的酸水中加热转化，再经硅胶柱色谱分离、制备HPLC精制。它在第一步硅胶分离时，通过洗脱剂石油醚、乙酸乙酯在体积比25～50∶1范围内，用三个不同梯度洗脱(例如：45∶1，33∶1和25∶1)，得到纯度约为80％的6-姜烯酚，收率仅为10～20％，因此必须经后续精制，包括用乙酸乙酯溶解6-姜烯酚粗品，过中压柱、用石油醚和乙酸乙酯洗脱，才得纯度约为90％的6-姜烯酚，此步骤收率约为35％。此方法步骤繁琐，得率很低，并且增加了成本。 
以姜超临界流体萃取物或干姜提取物为基础，应用转化前处理、色谱分离手段有序联用，研究一种大幅度提高姜烯酚类产量，快速、简单的制备姜烯酚类组合物的方法，并利用所得组合物研究其抗肿瘤活性，是本技术领域面临的主要问题。 
发明内容
本发明在前期研究的基础上，对提取方法做了进一步的优化，优化后的方法革除了精制 步骤，只需提取、萃取、经硅胶柱色谱分离即可得到含量大于90％的6-姜烯酚。 
本发明的提取方法包括：姜超临界流体萃取物或干姜提取物经含乙醇的酸水加热回流提取，回收乙醇，酸水液用乙酸乙酯萃取，减压回收乙酸乙酯得到萃取后浓缩物，浓缩物过硅胶色谱柱、用石油醚和乙酸乙酯梯度洗脱，收集洗脱液浓缩，即得，其中洗脱用的石油醚和乙酸乙酯分六个梯度洗脱，体积比依次为：50∶1、33∶1、25∶1、20∶1、17∶1、14∶1，收集14∶1的流分，浓缩即得。 
洗脱时每个梯度洗脱优选3～6个柱体积。 
加热回流所用的含乙醇的酸水，其中乙醇的浓度优选40％～80％v/v，盐酸的浓度优选0.2～0.8M。 
加热回流的温度优选70～100℃，回流时间优选2～4小时。 
其中姜超临界萃取物或干姜提取物与含乙醇的酸水的重量体积比优选不低于3∶80mg/ml。更优选1∶40～3∶80mg/ml。 
所述干姜提取物优选干姜的乙醇提取物。更优选用80％～90％v/v乙醇提取。 
通过外标定量法计算，原萃取物中6-姜烯酚的含量约为2.5％，当进行酸水反应处理后提取物中的6-姜烯酚的含量可达20％(外标法定量)，见图1。推测可能原料中部分6-姜酚转换成了6-姜烯酚。 
研究发现，在洗脱剂石油醚和乙酸乙酯优化体积比14∶1～50∶1范围内，利用体积比依次为：50∶1、33∶1、25∶1、20∶1、17∶1、14∶1的六个梯度依次洗脱，不同极性梯度所得6-姜烯酚含量不同，例如在17∶1段时，所得组合物中小极性杂质较多，所得6-姜烯酚纯度仅为50％w/w，而在洗脱至14∶1时，测得6-姜烯酚纯度较高，约为90％w/w，后再加极性至10∶1时，所得组合物大极性杂质较多，并且含量很低，纯度仅为40％w/w。发明人前期发明的一种从姜超临界萃取物中分离6-姜烯酚的方法，在洗脱剂石油醚和乙酸乙酯体积比25～50∶1范围内，利用三个梯度洗脱(例如45∶1，33∶1和25∶1)，虽然也能将6-姜烯酚洗脱出来，但是洗脱剂各梯度所洗脱的柱体积数很多(约16个柱体积)，并且由于极性增加缓慢，6-姜烯酚在柱内被吸附掺杂严重，使得纯度、收率都有很大的损失。 
因此，本发明优选用石油醚和乙酸乙酯分六个梯度洗脱，体积比依次为：50∶1、33∶1、25∶1、20∶1、17∶1、14∶1，最后收集14∶1的流分。 
试验还发现，当洗脱剂石油醚和乙酸乙酯在各个梯度时所洗脱的柱体积过多时(超过6个柱体积)，会使6-姜烯酚流出时间变长，并且纯度降低，所得组合物含6-姜烯酚仅为70％w/w，而且由于洗脱时间变长，6-姜烯酚于硅胶柱上吸附增加，收率降低(约45％)；各梯度所洗脱的柱体积过少时(低于3个柱体积)，会使6-姜烯酚与许多小极性杂质共流出，也影响其纯 度，所得组合物含6-姜烯酚仅为60％w/w。 
六个极性梯度段所洗脱的柱体积优选为3～6。并洗脱至14∶1段时，TLC检测，收集14∶1含6-姜烯酚段，通过外标定量法计算，得本发明的提取物中含6-姜烯酚90～93％，8-姜烯酚3～5％，见图2。 
本发明的制备方法易于操作、成品质量好且产量高，只需转化后硅胶柱层析分离一遍即得姜烯酚类组合物，并且收率很高，可达60～65％，为工业化生产带来极大便利。 
体外抗肿瘤药效学研究表明，本发明的姜烯酚类组合物对宫颈癌有显著的疗效。 
发明人以6-姜烯酚的含量作为指标，对比了6-姜烯酚单体以及含等量6-姜烯酚的本发明提取物在宫颈癌中的治疗活性。研究发现，在给定剂量范围内本发明提取物的活性要优于6-姜烯酚。说明转化分离后8-姜烯酚并不影响6-姜烯酚的活性，反而使得转化分离后本发明提取物的活性得到提高，试验方法和结果如下： 
姜烯酚类组合物的体外抗肿瘤作用 
取对数生长期的细胞，根据细胞的大小接种3～5×103个于96孔板上，待生长24小时后，弃上清，然后按以下分组给药：肿瘤细胞设不加药组和加药组(浓度1～25μM，以6-姜烯酚为指标)，每组设5或6个复孔，培养24小时，弃上清，加入100μl含0.5mg/ml的MTT(四氮唑盐)无血清培养液培养4小时，加入100μlDMSO(二甲亚砜)，放置于微型振荡仪上振荡10min，再至于酶标仪上570nm处检测OD值。 
加药组样品的用量以6-姜烯酚为指标，转化后本发明提取物(90％6-姜烯酚，5％8-姜烯酚)配置成含等量的6-姜烯酚。 
结果见表1 
表16-姜烯酚和本发明提取物的体外抗肿瘤IC50值 
 样品   6-姜烯酚   本发明提取物
 IC50(μM)   13.7   4.4
由表1可以看出，6-姜烯酚和转化分离后本发明提取物的IC50分别为13.7μM、4.4μM。提示转化分离后本发明提取物中8-姜烯酚并不影响6-姜烯酚的活性，反而与之发生协同作用，使其活性又进一步提高。
附图说明 
图1是酸水处理前后色谱图比较 
图2是收集14∶1洗脱液的色谱图 
具体实施方式
本实施例中的姜超临界流体萃取物购于广州和博生物科技有限公司 
实施例1 
精确称取姜超临界流体萃取物约7.5g，将其与200ml 60％乙醇的酸水溶液(0.8M盐酸) 充分混匀，100℃加热回流2小时，待反应完全后，45℃回收乙醇，所得酸水液用80ml乙酸乙酯萃取两次，合并乙酸乙酯液，回收乙酸乙酯，浓缩得到以6-姜烯酚为主的姜烯酚类组合物约7.5g，提取物中6-姜烯酚的含量由原来的2.5％升高到20％(外标法定量)。以反应后产物7.5g为原料，200～300目柱层析硅胶10g拌样，200～300目柱层析硅胶150g分离，洗脱剂石油醚和乙酸乙酯分六个梯度洗脱，分别为50∶1、33∶1、25∶1、20∶1、17∶1、14∶1(体积比)，各个梯度分别洗脱6、3、3、5、6、6个柱体积，收集14∶1段，TLC检验，置旋转蒸发仪上蒸干，即得以6-姜烯酚为主的姜烯酚类组合物0.98g，收率65％，HPLC外标法测定该组合物中6-姜烯酚占90％，8-姜烯酚占5％。 
实施例2 
精确称取干姜药材粉末1g(购于山东)，用40ml 90％乙醇，80℃加热回流2h，过滤所得提取液，回收乙醇，浓缩得干姜提取物约99.2mg。精密称取干姜提取物0.75g，将其与20ml80％乙醇的酸水溶液(0.2M盐酸)充分混匀，100℃加热回流2小时，待反应完全后，45℃回收乙醇，所得酸水液用8ml乙酸乙酯萃取两次，合并乙酸乙酯液，回收乙酸乙酯，浓缩得到以6-姜烯酚为主的姜烯酚类组合物约0.75g，提取物中6-姜烯酚的含量由原来的1.67％升高到5.56％(外标法定量)。以反应后产物75g为原料，200～300目柱层析硅胶100g拌样，200～300目柱层析硅胶1500g分离，洗脱剂石油醚和乙酸乙酯分六个梯度洗脱，分别为50∶1、33∶1、25∶1、20∶1、17∶1、14∶1(体积比)，各个梯度分别洗脱5、5、4、6、5、5个柱体积，收集14∶1段，TLC检验，置旋转蒸发仪上蒸干，即得以6-姜烯酚为主的姜烯酚类组合物2.62g，收率63％，HPLC外标法测定该组合物中6-姜烯酚占92％，8-姜烯酚占4％。 
实施例3 
精确称取姜超临界流体萃取物约7.5g，将其与200ml 60％乙醇的酸水溶液(0.4M盐酸)充分混匀，100℃加热回流2小时，待反应完全后，45℃回收乙醇，所得酸水液用80ml乙酸乙酯萃取两次，合并乙酸乙酯液，回收乙酸乙酯，浓缩得到以6-姜烯酚为主的姜烯酚类组合物约7.5g，提取物中6-姜烯酚的含量由原来的2.5％升高到19％(外标法定量)。以反应后产物75g为原料，200～300目柱层析硅胶100g拌样，200～300目柱层析硅胶1500g分离，洗脱剂石油醚和乙酸乙酯分六个梯度洗脱，分别为50∶1、33∶1、25∶1、20∶1、17∶1、14∶1(体积比)，各个梯度分别洗脱6、3、4、6、6、5个柱体积，收集14∶1段，TLC检验，置旋转蒸发仪上蒸干，即得以6-姜烯酚为主的姜烯酚类组合物9g，收率60％，HPLC外标法测定该组合物中6-姜烯酚占93％，8-姜烯酚占3％。 

Claims (6)

1.一种6-姜烯酚提取物的制备方法，包括姜超临界流体萃取物或干姜提取物经含乙醇的酸水加热回流提取，回收乙醇，酸水液用乙酸乙酯萃取，减压回收乙酸乙酯得到萃取后浓缩物，浓缩物过硅胶色谱柱，用石油醚和乙酸乙酯梯度洗脱，收集洗脱液浓缩，即得，其特征是：石油醚和乙酸乙酯分六个梯度洗脱，体积比依次为：50∶1、33∶1、25∶1、20∶1、17∶1、14∶1，收集14∶1的流分，浓缩即得。
2.权利要求1的制备方法，其中每个梯度洗脱3～6个柱体积。
3.权利要求1的制备方法，其中含乙醇的酸水中乙醇的浓度为40％～80％v/v，盐酸的浓度为0.2～0.8M。
4.权利要求1的制备方法，其中加热回流的温度为70～100℃，回流时间为2～4小时。
5.权利要求1的制备方法，其中姜超临界萃取物或干姜提取物与含乙醇的酸水的重量体积比为1∶40～3∶80mg/ml。
6.权利要求1的制备方法，其中干姜提取物用以下方法制得：干姜用80％～90％v/v乙醇提取浓缩即得。
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