CN102532077A - 一种快速制备色谱分离制备丹酚酸b的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种快速制备色谱分离制备丹酚酸B的方法，是一种从丹参药材中分离纯化得到纯度大于98.0％的丹酚酸B的制备方法。药材经提取、有机溶剂萃取之后得到乙酸乙酯浸膏，采用快速制备色谱仪，C₁₈键合相为填料的中低压色谱柱，以甲醇-水为洗脱体系，自动收集洗脱液。洗脱液经有机溶剂萃取，减压浓缩真空干燥，最后得到纯度>98.0%的丹酚酸B。本发明所述方法与现有技术相比，操作简便，成本低，重复性好，效率高，所得产品纯度高，可用于丹酚酸B的规模化生产。

Description

一种快速制备色谱分离制备丹酚酸B的方法

技术领域

本发明涉及一种从丹参药材中分离纯化得到纯度大于98.0％的丹酚酸B的制备方法。

技术背景

丹参为唇形科植物Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎，具有祛淤止痛、活血通经、清心除烦之功效。丹参主要含两类有效成分：一为脂溶性的二萜类化合物，二为水溶性的多聚酚酸类成分。实验研究证明，丹参水溶性成分具有多方面的药理活性，具有很强的抗氧化活性。丹酚酸B为丹参中重要的水溶性有效成分之一，约占总酚酸的70％，在2010版中国药典中，已将丹酚酸B作为丹参片的指标成分。丹酚酸B由三分子丹参素与一分子咖啡酸缩合而成，研究表明其有强烈的抗氧化和清除氧自由基的活性，对肾功能不全和肝损伤均有一定保护作用。分离制备丹参水溶性活性成分对进一步揭示丹参药效的物质基础和开发新的天然药物具有十分重要的意义。而丹酚酸B在水溶液中的稳定性与pH值、温度有很大关系，给中药制剂的生产和储存带来较大的困难。

目前丹酚酸B的分离纯化方法主要有：(1)柱层析法，但操作比较复杂，效率不高，而且需要不同填料结合使用；(2)制备型高效液相色谱法，对设备和试剂要求高，成本较高，难以规模化生产；(3)高速逆流色谱法，需要进行大量实验选择合适的溶剂系统。

快速制备色谱是在传统柱色谱的基础上发展起来的快速分离系统，采用自动输液系统和更小粒径的填料，通过连接检测器进行实时监测，并可自动收集馏分。该色谱仪可使用分析纯试剂做流动相，降低了成本，可承受较高流速，通过调节流动相的比例实现对物质的快速、有效分离，并且重复性好。

丹酚酸B的结构式如下：

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种分离时间短、分离效果好、产品纯度高(纯度＞98.0％)的丹酚酸B分离制备方法。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

发明提供了一种快速制备色谱分离制备丹酚酸B的方法：丹参药材先用含乙醇水溶液超声提取，减压浓缩，经有机溶剂萃取得到浸膏，以浸膏为原料，以快速制备色谱为分离手段，以甲醇-水为洗脱体系，具体步骤为：

(1)药材处理：丹参药材以1∶10～20的料液比(m/v)，用体积分数30％～80％的乙醇-水溶液，超声提取0.5～2h，过滤，滤渣同法再提取1次，合并两次的提取液，滤过，合并滤液，滤液60℃以下减压浓缩至为原体积的1/2～1/4，过滤，滤液用乙醚萃取，乙醚用量与浓缩液体积比为0.5～1，水层加酸调节pH为3～4，过滤获得水层清液，水层清液以乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层减压浓缩至干，得到乙酸乙酯浸膏；

(2)样品处理：乙酸乙酯浸膏加体积分数10％～70％的甲醇-水溶解，得浓度为30～60mg·mL^-1的样品溶液，离心，取上清，得到样品溶液；

(3)色谱柱预处理：快速制备液相色谱选择制备型中低压液相色谱柱，以洗脱体系溶液平衡色谱柱；洗脱体系为甲醇-水溶液，其中甲醇在甲醇-水溶液中的体积浓度为25％～50％；

(4)进样：将步骤(2)获得的样品溶液进样，进样体积为1～5mL；

(5)洗脱：采用洗脱体系溶液洗脱色谱柱，流速控制在3～5mL·min^-1，收集洗脱液；洗脱体系为甲醇-水溶液，其中甲醇在甲醇-水溶液中的体积分数为25％～50％；

(6)丹酚酸B的获取：收集的洗脱液(加入氯化钠固体至)饱和后，乙酸乙酯萃取，经减压浓缩和干燥得到丹酚酸B固体。

优选步骤(1)所述的乙醚萃取次数为1～3次，优选3次，每次乙醚的用量与浓缩液的体积比为1∶0.5～1，优选等体积；水层采用0.1～1mol·L^-1盐酸溶液调pH为3～4；乙酸乙酯萃取次数为1～3次，优选3次，每次乙酸乙酯的用量与水层清液体积比为1∶0.5～1，优选等体积。

其中，步骤(3)是以5～10倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱。所采用的制备型中低压色谱柱可以为商品化或手工填充的中低压色谱柱，填料为C₁₈键合相填料；色谱柱填料平均粒径为30～60μm。

优选步骤(5)的洗脱过程采用在线紫外检测，自动收集洗脱液，紫外检测波长为254nm和286nm。

步骤(6)所得洗脱液用氯化钠饱和，所述乙酸乙酯萃取，次数优选为3次，合并乙酸乙酯层，经减压浓缩和真空干燥丹酚酸B；减压浓缩和真空干燥的温度为30℃～60℃，优选30℃～35℃。

可以采用以下优选方案进行制备：

(1)药材处理：丹参药材按1∶20的料液比(m/v)，以50％乙醇浸泡6h，超声提取1h，过滤，残渣按1∶20的料液比加入50％乙醇再超声提取1h，合并两次的提取液，滤过，合并滤液，浓缩至为原体积的1/4，过滤，滤液以乙醚萃取3次(1∶1，v/v)，水层加盐酸调节pH为3～4，过滤，滤液以乙酸乙酯萃取3次(1∶1，v/v)，合并乙酸乙酯层，减压浓缩至干，得到乙酸乙酯浸膏。

(2)样品处理：乙酸乙酯浸膏加25％的甲醇水溶解，得浓度为30～60mg·mL^-1的样品溶液，离心，取上清，得到样品溶液。

(3)色谱柱预处理：快速制备液相色谱选择制备型中低压液相色谱柱，以5～10倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱；洗脱体系为甲醇—水，其中甲醇在甲醇—水溶液中的体积分数为25％～40％。

(4)进样：将离心后的样品上清液进样，进样体积为1～3mL；

(5)洗脱：采用洗脱体系溶液洗脱色谱柱，流速控制在3～5mL·min^-1，在线紫外检测，设置参数仪器自动收集洗脱液。

(6)丹酚酸B的获取：收集的丹酚酸B洗脱液加入氯化钠固体至饱和，乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，经减压浓缩和真空干燥得到丹酚酸B。

药材提取温度小于40℃；所述制备型中低压色谱柱可以选用商品化或自己填充的制备柱，填料为C₁₈键合相填料；色谱柱填料平均粒径为30～60μm；紫外检测波长为254nm和286nm；收集的丹酚酸B洗脱液加入氯化钠固体至饱和，乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩至干；减压浓缩和真空干燥的温度为30℃～35℃。

与现有技术相比，本发明从丹参药材中分离纯化丹酚酸B具有以下优点和进步：

1.本发明以快速制备色谱为分离手段，优化样品提取、净化方法，使丹酚酸B得到快速、高效分离，可以获得纯度大于98.0％的丹酚酸B，可作为对照品用于丹参药材及含丹参制剂的质量控制，也可用于药理研究。

2.本发明采用紫外检测器实时检测，观察丹酚酸B与杂质的分离情况，并可设置参数实现仪器自动收集洗脱液。

3.本发明所述方法操作快速，可以在80min内完成分离，相对于传统柱层析技术，大大缩短分离纯化的时间，减少因为周期太长而可能引起的丹酚酸B的降解。

4.本发明所述洗脱液加氯化钠固体至饱和，以乙酸乙酯萃取，经减压浓缩和真空干燥得到丹酚酸B固体，可以避免丹酚酸B存在于水溶液中而发生降解，转移至乙酸乙酯中更稳定和更容易浓缩干燥。

5.本发明操作简单，重现性好，成本低，适用于规模化生产。

为了验证本法分离纯化丹酚酸B的效果，本发明还采用HPLC对丹酚酸B进行纯度分析，以面积归一化法计算丹酚酸B的纯度，并通过UV、IR、MS、¹H NMR和¹³C NMR进行结构鉴定。

附图说明

图1丹酚酸B的快速制备色谱图；

图2丹酚酸B的纯度测定HPLC图。

具体实施方案

实施例一

1.药材处理

取丹参饮片，粉碎，取15g按1∶20(m/v)比例加入体积分数50％乙醇，浸泡6h，超声1h，过滤，残渣按1∶20(m/v)比例加入体积分数50％乙醇再次提取1h，过滤。合并两次提取的滤液，减压浓缩至体积为原来的1/4，过滤，滤液以与乙醚体积比(1∶1)萃取3次，水层加1mol·L^-1HCl调节pH＝3，过滤，滤液按体积比(1∶1)用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩至干，得乙酸乙酯浸膏(0.65g)。

2.样品处理

取乙酸乙酯浸膏100mg，加体积分数25％的甲醇水溶解配制成浓度为30mg·mL^-1的溶液，离心10min(15000rpm)，取上清液。

3.色谱柱处理

快速制备液相色谱柱使用商品化色谱柱，填料平均粒径为51μm的C₁₈键合相填料，规格为(60mm×20mm，24g)，以约5倍柱体积洗脱溶液平衡色谱柱。洗脱溶液洗为甲醇-水溶液，其中甲醇在甲醇-水溶液中的体积分数为25％。

4.上样

取步骤3离心后的样品溶液上清，注入色谱柱中，进样体积为1mL。

5.洗脱

采用如步骤3的洗脱溶液进行洗脱，流速控制在5mL·min^-1，在线286nm紫外检测，仪器自动收集，5mL/管。图谱如图1所示。

6.丹酚酸B的获取：收集的丹酚酸B洗脱液加入氯化钠固体至饱和，乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，经减压浓缩和真空干燥，得丹酚酸B 11mg。

结果分析：

产物经测定，其结构数据为：ESI-MS：m/z：717.2[M-H]^-，1435.1[2M-H]^-，UV(MeOH)λ^max nm：256，288，310。IR KBr)ν_max cm^-1：3200-3500，1732，1609，1529，1451，1299，1182，1116，811。¹HNMR和¹³C NMR数据见表1。HPLC测定其纯度为98.62％(面积归一化法计算)，如图2所示。

表1.丹酚酸B的NMR数据(DMSO-d₆，400MHz，δ)

实施例二

1.药材处理

取丹参饮片，粉碎，取15g按1∶20(m/v)比例加入体积分数50％乙醇，浸泡6h，超声1h，过滤，残渣按1∶20的料液比加入体积分数50％乙醇再次提取，过滤。合并两次提取的滤液，减压浓缩至体积为原来的1/4，过滤，滤液以与乙醚体积比(1∶1)萃取3次，水层加1mol·L^-1HCl调节至pH＝4，过滤，滤液按体积比(1∶1)乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩至干，得乙酸乙酯浸膏(0.62g)。

2.样品处理

取乙酸乙酯浸膏120mg，加体积分数25％的甲醇水溶解配制成浓度为60mg·mL^-1的溶液，离心10min(15000rpm)。取上清液。

3.色谱柱处理

快速制备液相色谱柱使用手工填充的色谱柱柱，填料平均粒径为32μm的C₁₈键合相填料，规格为(60mm×20mm，24g)，以约10倍柱体积洗脱溶液平衡色谱柱。洗脱溶液洗为甲醇-水溶液，其中甲醇在甲醇-水溶液中的体积分数为30％。

4.上样

取离心后的样品溶液上清，注入色谱柱中，进样体积为2mL。

5.洗脱

采用如步骤3的洗脱溶液进行洗脱，流速控制在5mL·min^-1，在线286nm紫外检测，仪器自动收集，5mL/管。

6.丹酚酸B的获取：收集的丹酚酸B洗脱液加入氯化钠固体至饱和，乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，经减压浓缩和真空干燥得丹酚酸B 40mg。HPLC测定其纯度为98.32％。

Claims (9)

1.一种快速制备色谱分离制备丹酚酸B的方法，其特征在于：丹参药材先用含乙醇的水溶液提取，经有机溶剂萃取得到浸膏，以浸膏为原料，以快速制备色谱为分离手段，以甲醇-水为洗脱体系，最终制得丹酚酸B；具体步骤为：

(1)药材处理：丹参药材以1∶10～20的料液比(m/v)，用体积分数30％～80％的乙醇-水溶液，超声提取0.5～2h，过滤，滤液60℃以下减压浓缩至为原体积的1/2～1/4，过滤，滤液用乙醚萃取，乙醚用量与浓缩液体积比为0.5～1；水层加酸调节pH为3～4，过滤获得水层清液，水层清液以乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层减压浓缩至干，得到乙酸乙酯浸膏；

(2)样品处理：乙酸乙酯浸膏加体积分数10％～70％的甲醇-水溶解，得浓度为30～60mg·mL^-1的样品溶液，离心，取上清液，得到样品溶液；

(3)色谱柱预处理：快速制备色谱选择制备型中低压液相色谱柱，以洗脱体系溶液平衡色谱柱；洗脱体系溶液为甲醇-水溶液，其中甲醇在甲醇-水溶液中的体积分数为25％～50％；

(4)进样：将步骤(2)获得的样品溶液进样，进样体积为1～5mL；

(5)洗脱：采用洗脱体系溶液洗脱，流速控制在3～5mL·min^-1，收集洗脱液；洗脱体系溶液为甲醇-水溶液，其中甲醇在甲醇-水溶液中的体积分数为25％～50％；

(6)丹酚酸B的获取：收集的洗脱液经饱和后，用乙酸乙酯萃取，经浓缩和干燥得到丹酚酸B。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)所述的提取温度小于60℃。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)所述超声提取0.5～2h后，过滤的残渣按料液比1∶10～20的比例加入体积分数30％～80％乙醇再次提取0.5～2h，合并两次的提取液，滤过，合并滤液，浓缩；过滤，滤液以乙醚萃取，弃去，水层调pH为3～4后，过滤，滤液再以乙酸乙酯萃取；步骤(1)调节水层为酸性采用盐酸溶液，浓度为0.1～1mol·L^-1。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)所述的乙醚萃取次数为1～3次，每次乙醚的用量与浓缩液的体积比为1∶0.5～1。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)所述的乙酸乙酯萃取次数为1～3次，每次乙酸乙酯的用量与水层清液体积比为1∶0.5～1。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)是以5～10倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)所述制备型中低压色谱柱选用商品化或自己填充的中低压色谱柱，填料为C18键合相填料；色谱柱填料平均粒径为30～60μm。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(6)收集的洗脱液加入氯化钠固体至饱和，用乙酸乙酯提取，合并乙酸乙酯层，经减压浓缩和真空干燥得丹酚酸B，减压浓缩和真空干燥的温度为30℃～60℃。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(5)所述的洗脱过程采用在线紫外检测，自动收集洗脱液，紫外检测波长为254nm和286nm。

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