CN102219685A - 一种丹参丹酚酸a的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种丹酚酸A的提取方法，其特征在于采用新的工艺方法得到丹酚酸A提取物，该方法丹酚酸A提取物以丹酚酸A计得率超过千分之五，节省了大量资源；本发明还公开了丹酚酸A的制备方法，采用中压液相制备方法，洗脱剂为两相，等度或梯度洗脱，得到相关物质丹酚酸F、丹酚酸C含量低于0.5％的高纯度丹酚酸A，该方法得到丹酚酸A质量更加均一、稳定。

Description

一种丹参丹酚酸A的制备方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种丹参丹酚酸A的制备方法。

背景技术

丹参是经典的活血化瘀的中药药味，其具有活血化瘀作用的化学成分主要为水溶性成分，丹参水溶性成分多具有酚酸性结构，即丹酚酸A、B、C、D、E等有效成分，丹参总酚酸中以丹酚酸B含量最高，因此，人们开发的重点集中于丹酚酸B，但是，丹参水溶性成分活性最好的是丹参酚酸A(杜冠华【基础医学与临床，2000，20(5)：10～14】、胡义扬【中药药理学报，1997，18(5)：478-480】)，可丹参丹酚酸A在丹参中含量很低，因为无法进行工业化生产而被人们忽略。本院申请的专利(申请号为200610145453.9、200710099618.8等)采用调pH值、高温反应的方法将丹参多酚酸或丹参丹酚酸B转化成丹酚酸A，该方法成功的将丹酚酸A的提取率从万分之五提高到千分之三左右(以丹酚酸A计)，使丹酚酸A具有成药研究的基础。

丹酚酸A将成为创制新药，得率再次提高和得到质量均一的丹酚酸A是科研工作的重点之一。

发明内容

基于上述原因，本院的科研人员通过多次研究，继续优化工艺方法发现，调pH值、高温反应后的反应液，在一定温度下离心不会导致沉淀裹挟丹酚酸A，大孔树脂纯化后，省去离心步骤，保持溶液的乙醇浓度，同样防止沉淀裹挟丹酚酸A，再经聚酰胺纯化等步骤，省略有机溶剂萃取的步骤(降低生产成本，减少环境污染)，得到丹酚酸A提取物，该提取物丹酚酸A含量大于96％，以丹酚酸A计得率大于千分之五，该方法在保证丹酚酸A纯度的基础上，得率再度提高，节省了大量资源，降低了生产成本。

将上述方法得到丹酚酸A提取物或现有技术得到的丹酚酸A提取物，经中压液相分离纯化，采用正相硅胶或反相硅胶，以二相溶剂为洗脱剂，采用等度或梯度洗脱方法，得到纯度大于98％的丹酚酸A，其中相关物质丹酚酸F和丹酚酸C含量均在0.5％范围内，多批次实验确定该方法得到的丹酚酸A纯度较高，杂质含量均一，属于质量稳定的产品。

本发明通过下述技术方案实现的。

一种丹酚酸A提取物的制备方法，丹参水提取或乙醇提取，提取液浓缩或回收乙醇浓缩，调pH值3.5-6.0，105℃-140℃加热1-6小时，得到反应液，反应液在20℃-50℃时离心，经非极性或弱极性大孔树脂柱层析分离，其中所述大孔树脂柱为HPD-100、HPD-100A、HPD-300、HPD-400、HPD-400A、HPD-450、D101、1300-I、1400或AB-8；先用水洗，弃去洗脱液，再用10-30％乙醇洗脱，弃去洗脱液，再用30-70％浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩至乙醇浓度为5％-50％；浓缩液用聚酰胺层析柱分离，先用30-70％乙醇溶液洗脱，弃去洗脱液，再用70-95％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩乙醇至尽，干燥，得到丹参丹酚酸A提取物。

一种丹酚酸A的制备方法，取上述实验方法得到丹酚酸A或现有技术制备方法得到的丹酚酸A提取物经中压制备液相分离；

洗脱柱填充剂为正相硅胶，洗脱溶剂二相，其中a溶剂为正己烷、石油醚、乙醚、三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸丁酯、丙酮或丁酮，b溶剂为甲醇、乙醇或乙腈，洗脱分离时b溶剂的体积百分比大于0小于等于50％；或者，a溶剂为正己烷、石油醚、乙醚、三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸丁酯、丙酮或丁酮，b溶剂为甲醇、乙醇或乙腈，a或b溶剂中加入其体积百分比为大于0小于等于10％的甲酸、乙酸或磷酸，洗脱分离时b溶剂体积百分比大于0小于等于50％；得到洗脱液，浓缩，干燥，得到丹酚酸A；

或者，洗脱柱填充剂为反相硅胶，洗脱溶剂为二相，其中a溶剂为水，b溶剂为甲醇、乙醇或乙腈，洗脱分离时b溶剂的体积百分比大于0小于等于50％，收集洗脱溶液，浓缩，干燥，得到丹酚酸A。

一、检测方法

实验方法：

色谱柱：C₁₈反相色谱柱，NUCLEODUR，250*4.6mm，ODS；

色谱条件与系统适用性实验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1.0ml/min；柱温35℃；检测波长286nm；理论板数按丹酚酸A计应不低于60000；以乙腈-0.2％醋酸水溶液为流动相，按下述梯度洗脱条件进行梯度洗脱，运行90分钟；

0-15分钟时，乙腈的比例由10％升至20％，0.2％醋酸水溶液的比例由90％降至80％；15-55分钟时，乙腈的比例由20％升至30％，0.2％醋酸水溶液的比例由80％降至70％；55-65分钟时，乙腈的比例由30％升至50％，0.2％醋酸水溶液的比例由70％降至50％；65-72分钟时，乙腈的比例由50％升至80％，0.2％醋酸水溶液的比例由50％降至20％；72-77分钟时，乙腈的比例80％，0.2％醋酸水溶液的比例20％；77-80分钟时，乙腈的比例由80％降至10％，0.2％醋酸水溶液的比例由20％升至90％；80-90分钟时，保持乙腈-0.2％醋酸水溶液以10∶90的比例进行洗脱；

对照品溶液的配制：精密称取丹酚酸A对照品到容量瓶中，加甲醇溶解摇匀，并稀释至刻度；

样品溶液的配制：取样品，加入甲醇溶解摇匀；或精密量取或称取制剂，加甲醇溶解摇匀，并稀释至刻度；

测定法：精密吸取对照品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图；精密吸取样品溶液，注入液相色谱仪，计算峰面积比。

上述方法测定本发明丹酚酸A提取物丹酚酸A含量大于96％。

上述方法测定本发明丹酚酸A纯度大于98％，相关物质丹酚酸F和丹酚酸C含量均在0.5％范围内。

二、不同方法得到丹酚酸A提取物得率实验

实验方案1：按照专利申请号为200610145453.9的实施例1得到丹酚酸A提取物；

实验方案2：按照本发明丹酚酸A提取物制备方法得到丹酚酸A提取物：，丹参水乙醇提取，提取液回收乙醇浓缩，调pH值4.0，120℃加热3小时，得到反应液，反应液在25℃时离心，经AB-8大孔树脂柱层析分离，先用水洗，弃去洗脱液，再用20％乙醇洗脱，弃去洗脱液，再用40％浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩至乙醇浓度为10％；浓缩液用聚酰胺层析柱分离，先用40％乙醇溶液洗脱，弃去洗脱液，再用80％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩乙醇至尽，干燥，得到丹参丹酚酸A提取物。

实验方法：按照上述实验方案得到丹酚酸A提取物，按照上述检测分析方法计算丹酚酸A的得量，计算得率。

实验结果：见表1。

表1不同方法得率比较结果

注：上述实验是在实验方案2多次实验基础上进行的论证实验。

实验结论：上述比较实验表明，新的工艺方法得率比对比方法得率进一步提高，充分说明本发明方法具有科学意义。

三、不同方法得到的丹酚酸A质量比较

实验方案1：按照专利申请号为200610145453.9的实施例2得到丹酚酸A；

实验方案2：按照本发明丹酚酸A制备方法得到丹酚酸A：取本发明丹酚酸A提取物经中压制备液相分离；洗脱柱填充剂为正相硅胶，洗脱溶剂为二相，其中a溶剂为乙酸乙酯，b溶剂为甲醇，b溶剂中加入其体积百分比为2.5％的甲酸，洗脱分离时b溶剂体积百分比2％-4％梯度洗脱，运行90分钟；得到洗脱液，浓缩，干燥，得到丹酚酸A。

实验方法：按照上述实验方案得到丹酚酸A，按照上述检测分析方法得到丹酚酸A含量及丹酚酸C、丹酚酸F含量。

实验结果：见表2。

表2不同方法得到丹酚酸A含量比较

注：上述实验是在实验方案2多次实验基础上进行的论证实验；按照本发明丹酚酸A的制备方法进行多批次实验，丹酚酸A含量均保持在98％以上，相关物质丹酚酸F和丹酚酸C含量均不超过0.5％，说明本发明的制备方法得到质量更加均一的丹酚酸A。

制备实施例

实施例1

一种丹酚酸A提取物的制备方法，丹参水提取，提取液浓缩，调pH值3.5，105℃加热6小时，得到反应液，反应液在20℃时离心，经HPD-100大孔树脂柱层析分离；先用水洗，弃去洗脱液，再用10％乙醇洗脱，弃去洗脱液，再用30％浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩至乙醇浓度为5％；浓缩液用聚酰胺层析柱分离，先用30％乙醇溶液洗脱，弃去洗脱液，再用70％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩乙醇至尽，干燥，得到丹参丹酚酸A提取物。

实施例2

一种丹酚酸A提取物的制备方法，丹参水提取，提取液浓缩，调pH值6.0，140℃加热1小时，得到反应液，反应液在50℃时离心，经HPD-100A大孔树脂柱层析分离；先用水洗，弃去洗脱液，再用30％乙醇洗脱，弃去洗脱液，再用70％浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩至乙醇浓度为50％；浓缩液用聚酰胺层析柱分离，先用70％乙醇溶液洗脱，弃去洗脱液，再用95％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩乙醇至尽，干燥，得到丹参丹酚酸A提取物。

实施例3

一种丹酚酸A提取物的制备方法，丹参水提取，提取液浓缩，调pH值4.5，120℃加热3小时，得到反应液，反应液在30℃时离心，经HPD-300大孔树脂柱层析分离，先用水洗，弃去洗脱液，再用20％乙醇洗脱，弃去洗脱液，再用50％浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩至乙醇浓度为10％；浓缩液用聚酰胺层析柱分离，先用40％乙醇溶液洗脱，弃去洗脱液，再用75％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩乙醇至尽，干燥，得到丹参丹酚酸A提取物。

实施例4

一种丹酚酸A提取物的制备方法，丹参乙醇提取，回收乙醇浓缩，调pH值5.5，130℃加热1.5小时，得到反应液，反应液在25℃时离心，经HPD-400大孔树脂柱层析分离；先用水洗，弃去洗脱液，再用25％乙醇洗脱，弃去洗脱液，再用65％浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩至乙醇浓度为45％；浓缩液用聚酰胺层析柱分离，先用65％乙醇溶液洗脱，弃去洗脱液，再用90％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩乙醇至尽，干燥，得到丹参丹酚酸A提取物。

实施例5

一种丹酚酸A提取物的制备方法，丹参乙醇提取，回收乙醇浓缩，调pH值5.0，135℃加热2小时，得到反应液，反应液在45℃时离心，经HPD-400A大孔树脂柱层析分离；先用水洗，弃去洗脱液，再用15％乙醇洗脱，弃去洗脱液，再用40％浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩至乙醇浓度为35％；浓缩液用聚酰胺层析柱分离，先用35％乙醇溶液洗脱，弃去洗脱液，再用80％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩乙醇至尽，干燥，得到丹参丹酚酸A提取物。

实施例6

一种丹酚酸A提取物的制备方法，丹参水提取，提取液浓缩，调pH值4.0，125℃加热3.5小时，得到反应液，反应液在50℃时离心，经D101大孔树脂柱层析分离，先用水洗，弃去洗脱液，再用15％乙醇洗脱，弃去洗脱液，再用45％浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩至乙醇浓度为25％；浓缩液用聚酰胺层析柱分离，先用40％乙醇溶液洗脱，弃去洗脱液，再用75％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩乙醇至尽，干燥，得到丹参丹酚酸A提取物。

实施例7

一种丹酚酸A提取物的制备方法，丹参水提取，提取液浓缩，调pH值5.0，135℃加热1小时，得到反应液，反应液在25℃时离心，经1300-I大孔树脂柱层析分离；先用水洗，弃去洗脱液，再用25％乙醇沈脱，弃去洗脱液，再用40％浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩至乙醇浓度为10％；浓缩液用聚酰胺层析柱分离，先用60％乙醇溶液洗脱，弃去洗脱液，再用90％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩乙醇至尽，干燥，得到丹参丹酚酸A提取物。

实施例8

一种丹酚酸A提取物的制备方法，丹参乙醇提取，提取液回收乙醇浓缩，调pH值4.5，130℃加热3小时，得到反应液，反应液在45℃时离心，经1400大孔树脂柱层析分离，先用水洗，弃去洗脱液，再用20％乙醇洗脱，弃去洗脱液，再用45％浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩至乙醇浓度为40％；浓缩液用聚酰胺层析柱分离，先用60％乙醇溶液洗脱，弃去洗脱液，再用90％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩乙醇至尽，干燥，得到丹参丹酚酸A提取物。

实施例9

一种丹酚酸A提取物的制备方法，丹参乙醇提取，提取液回收乙醇浓缩，调pH值5.5，110℃加热5.5小时，反应液在35℃时离心，经AB-8大孔树脂柱层析分离；先用水洗，弃去洗脱液，再用20％乙醇洗脱，弃去洗脱液，再用45％浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩至乙醇浓度为40％；浓缩液用聚酰胺层析柱分离，先用35％乙醇溶液洗脱，弃去洗脱液，再用95％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩乙醇至尽，干燥，得到丹参丹酚酸A提取物。

实施例10

取本发明丹酚酸A提取物经中压制备液相分离；洗脱柱填充剂为正相硅胶，洗脱溶剂为二相，其中a溶剂为正己烷，b溶剂为乙腈，洗脱分离时b溶剂的体积百分比3％；得到洗脱液，浓缩，干燥，得到丹酚酸A。

实施例11

取现有技术得到丹酚酸A提取物经中压制备液相分离；洗脱柱填充剂为正相硅胶，洗脱溶剂为二相，其中a溶剂为石油醚，b溶剂为甲醇，洗脱分离时b溶剂的体积百分比50％；得到洗脱液，浓缩，干燥，得到丹酚酸A。

实施例12

取本发明丹酚酸A提取物经中压制备液相分离；洗脱柱填充剂为正相硅胶，洗脱溶剂为二相，其中a溶剂为二氯甲烷，b溶剂为乙醇，洗脱分离时b溶剂的体积百分比1％-10％梯度洗脱，运行90分钟，得到洗脱液，浓缩，干燥，得到丹酚酸A。

实施例13

取现有技术丹酚酸A提取物经中压制备液相分离；洗脱柱填充剂为正相硅胶，洗脱溶剂为二相，其中a溶剂为乙酸乙酯，b溶剂为甲醇，洗脱分离时b溶剂的体积百分比20％-40％梯度洗脱，运行90分钟；或得到洗脱液，浓缩，干燥，得到丹酚酸A。

实施例14

取丹酚酸A提取物经中压制备液相分离；洗脱柱填充剂为正相硅胶，洗脱溶剂为二相，其中a溶剂为丙酮，b溶剂为乙腈，洗脱分离时b溶剂的体积百分比45％；得到洗脱液，浓缩，干燥，得到丹酚酸A。

实施例15

取丹酚酸A提取物经中压制备液相分离；洗脱柱填充剂为正相硅胶，洗脱溶剂为二相，a溶剂为三氯甲烷，b溶剂为甲醇，b溶剂中加入其体积百分比为0.5％的甲酸，洗脱分离时b溶剂体积百分比5％；得到洗脱液，浓缩，干燥，得到丹酚酸A。

实施例16

取丹酚酸A提取物经中压制备液相分离；洗脱柱填充剂为正相硅胶，洗脱溶剂为二相，a溶剂为乙醚，b溶剂为甲醇，a中加入其体积百分比10％的乙酸，洗脱分离时b溶剂体积百分比45％；得到洗脱液，浓缩，干燥，得到丹酚酸A。

实施例17

取丹酚酸A提取物经中压制备液相分离；洗脱柱填充剂为正相硅胶，洗脱溶剂为二相，a溶剂为三氯甲烷，b溶剂为乙醇，b溶剂中加入其体积百分比为大于3％的甲酸，洗脱分离时b溶剂体积百分比1％-5％梯度洗脱，运行90分钟；得到洗脱液，浓缩，干燥，得到丹酚酸A。

实施例18

取丹酚酸A提取物经中压制备液相分离；洗脱柱填充剂为正相硅胶，洗脱溶剂为二相，其中a溶剂为丁酮，b溶剂为乙腈，a溶剂中加入其体积百分比为大于4％的磷酸，洗脱分离时b溶剂体积百分0.5％-2％梯度洗脱，运行90分钟；得到洗脱液，浓缩，干燥，得到丹酚酸A；

实施例19

取丹酚酸A提取物经中压制备液相分离；洗脱柱填充剂为正相硅胶，洗脱溶剂为二相，其中a溶剂为二氯甲烷，b溶剂为甲醇，b溶剂中加入其体积百分比为2.5％的甲酸，洗脱分离时b溶剂体积百分比2％-4％梯度洗脱；得到洗脱液，浓缩，干燥，得到丹酚酸A。

实施例20

取丹酚酸A提取物经中压制备液相分离；洗脱柱填充剂为反相硅胶，洗脱溶剂为二相，其中a溶剂为水，b溶剂为甲醇，洗脱分离时b溶剂的体积百分比0.5％，收集洗脱溶液，浓缩，干燥，得到丹酚酸A。

实施例21

取丹酚酸A提取物经中压制备液相分离；洗脱柱填充剂为反相硅胶，洗脱溶剂为二相，其中a溶剂为水，b溶剂为乙醇，洗脱分离时b溶剂的体积百分比50％，收集洗脱溶液，浓缩，干燥，得到丹酚酸A。

实施例22

取丹酚酸A提取物经中压制备液相分离；洗脱柱填充剂为反相硅胶，洗脱溶剂为二相，其中a溶剂为水，b溶剂为乙腈，洗脱分离时b溶剂的体积百分比30％，收集洗脱溶液，浓缩，干燥，得到丹酚酸A。

实施例23

取丹酚酸A提取物经中压制备液相分离；洗脱柱填充剂为反相硅胶，洗脱溶剂为二相，其中a溶剂为水，b溶剂为甲醇，洗脱分离时b溶剂的体积百分比2％-25％梯度洗脱，运行90分钟，收集洗脱溶液，浓缩，干燥，得到丹酚酸A。

实施例24

取丹酚酸A提取物经中压制备液相分离；洗脱柱填充剂为反相硅胶，洗脱溶剂为二相，其中a溶剂为水，b溶剂为乙腈，洗脱分离时b溶剂的体积百分比10％-45％梯度洗脱，运行90分钟，收集洗脱溶液，浓缩，干燥，得到丹酚酸A。

实施例25

取丹酚酸A提取物经中压制备液相分离；洗脱柱填充剂为反相硅胶，洗脱溶剂为二相，其中a溶剂为水，b溶剂为乙醇，洗脱分离时b溶剂的体积百分比30％-40％梯度洗脱，运行90分钟，收集洗脱溶液，浓缩，干燥，得到丹酚酸A。

实施例26

取丹酚酸A提取物经中压制备液相分离；洗脱柱填充剂为反相硅胶，洗脱溶剂为二相，其中a溶剂为水，b溶剂为甲醇，洗脱分离时b溶剂的体积百分比5％-25％梯度洗脱，运行90分钟，收集洗脱溶液，浓缩，干燥，得到丹酚酸A。

注：本发明所要求保护的具体技术方案，不限于上述实施例所表达的技术方案的具体组合。

Claims (2)

1.一种丹酚酸A提取物的制备方法，其特征在于：丹参水提取或乙醇提取，提取液浓缩或回收乙醇浓缩，调pH值3.5-6.0，105℃-140℃加热1-6小时，得到反应液，反应液在20℃-50℃时离心，经非极性或弱极性大孔树脂柱层析分离，其中所述大孔树脂柱为HPD-100、HPD-100A、HPD-300、HPD-400、HPD-400A、HPD-450、D101、1300-I、1400或AB-8；先用水洗，弃去洗脱液，再用10-30％乙醇洗脱，弃去洗脱液，再用30％-70％浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩至乙醇浓度为5％-50％；浓缩液用聚酰胺层析柱分离，先用30％-70％乙醇溶液洗脱，弃去洗脱液，再用70％-95％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩乙醇至尽，干燥，得到丹参丹酚酸A提取物。

2.一种丹酚酸A的制备方法，其特征在于：取丹酚酸A提取物经中压制备液相分离；

洗脱柱填充剂为正相硅胶，洗脱溶剂为二相，其中a溶剂为正己烷、石油醚、乙醚、三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸丁酯、丙酮或丁酮，b溶剂为甲醇、乙醇或乙腈，洗脱分离时b溶剂的体积百分比大于0小于等于50％；或者，a溶剂为正己烷、石油醚、乙醚、三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸丁酯、丙酮或丁酮，b溶剂为甲醇、乙醇或乙腈，a或b溶剂中加入其体积百分比为大于0小于等于10％的甲酸、乙酸或磷酸，洗脱分离时b溶剂体积百分比大于0小于等于50％；得到洗脱液，浓缩，干燥，得到丹酚酸A；

或者，洗脱柱填充剂为反相硅胶，洗脱溶剂为二相，其中a溶剂为水，b溶剂为甲醇、乙醇或乙腈，洗脱分离时b溶剂的体积百分比大于0小于等于50％，收集洗脱溶液，浓缩，干燥，得到丹酚酸A。