CN102993015B - 一种丹酚酸a纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种丹酚酸A纯化方法，将含有丹酚酸A的洗脱液或提取液；调pH至2.5～4.5，离心，上清液经非极性或弱极性大孔树脂柱层析分离，用水洗脱后，用洗脱剂洗脱，高效液相检测丹酚酸A，收集含有丹酚酸A的洗脱液；将得到的洗脱液用葡聚糖凝胶LH-20或ODS-C18或聚酰胺层析柱分离，用洗脱剂洗脱，高效液相检测丹酚酸A，收集含有丹酚酸A的洗脱液；将得到的洗脱液调pH至2.0～4.0，经有机溶剂萃取，分离有机溶剂相；将得到的溶液用硅胶层析柱分离，用洗脱剂洗脱，高效液相检测丹酚酸A，收集含有丹酚酸A的洗脱液；将得到的洗脱液，减压回收洗脱剂，再加水溶解，微波真空干燥，得进一步纯化的丹酚酸A。

Description

一种丹酚酸A纯化方法

技术领域

本发明涉及一种丹酚酸A纯化方法。

技术背景

丹参制剂是我国心脑血管疾病的基本治疗药物，因疗效确切，丹参已成为我国用量最大、销售额最高、制剂生产厂最多，临床剂型最全的中药之一。丹参有效化学成分主要有两大类：脂溶性丹参酮类化合物和水溶性酚酸类化合物。研究表明：丹酚酸类在抗肝脏损伤、抗动脉粥样硬化及细胞凋亡以及改善记忆功能障碍等方面有着显著的活性。其中又以丹酚酸A(SaivianolicacidA)抗氧化活性最强。

丹酚酸A结构如下：

但是，丹酚酸A的天然含量极低(约为丹参药材的0.01-0.06％)，使得原药材成本过高，分离纯化难度过大，严重制约着药物的开发和研究，成为其产业化的瓶颈。现有技术中，也一直努力尝试找到一种适于实际生产应用的提取制备丹酚酸A的生产工艺。例如，中国专利CN101041620A公开了采用水温浸、离心、树脂层析、萃取、浓缩干燥制备丹酚酸A的方法，但其最终提取物得率为3‰，产率低，生产成本高。又如，中国专利CN101121658A公开了水提取、高温高压反应、树脂层析、萃取、真空干燥或冷冻干燥制备丹酚酸A的方法。而中国专利CN101480423A公开了用乙醇/水洗脱大孔树脂所得的丹酚酸A溶液，干燥(优选减压干燥或真空干燥)，得到丹酚酸A提取物最高含量为91.26％的方法。但上述现有技术转化过程无法控制，转化副产物多，主产物丹酚酸A的产率较低。并且对丹酚酸A的破坏很大，成本极高，所得的提取物有机溶剂残留严重，极不易保存与使用。

综上所述，上述现有技术均存在实际生产过程中无法克服的缺陷。

发明内容

为克服上述缺陷，本发明提供了一种进一步纯化丹酚酸A并不破坏丹酚酸A的纯化方法。

本发明提供的丹酚酸A纯化方法，其中将含有丹酚酸A的洗脱液或提取液；采用如下步骤进一步纯化：

步骤一将所述洗脱液或提取液减压浓缩至每1ml含丹酚酸A1-10mg，调pH至2.5～4.5，离心，上清液经非极性或弱极性大孔树脂柱层析分离，所述丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1∶(35～70)，树脂柱径高比为1∶(4～30)，用水洗脱后，用洗脱剂洗脱，高效液相检测丹酚酸A，收集含有丹酚酸A的洗脱液；

步骤二将步骤一得到的洗脱液浓缩至每ml含1-10mg丹酚酸A的溶液，用葡聚糖凝胶LH-20或ODS-C18或聚酰胺层析柱分离，所述丹酚酸A上样量与层析柱比为1∶(5～25)，树脂柱径高比为1∶(4～25)，用洗脱剂洗脱，高效液相检测丹酚酸A，收集含有丹酚酸A的洗脱液，洗脱液减压回收并浓缩成水溶液；步骤三将步骤二得到的水溶液调pH至2.0～4.0，经有机溶剂萃取，分离有机溶剂相；

步骤四将步骤三得到的溶液减压回收有机溶剂，制成每1ml含丹酚酸A500～10000mg的萃取液，用硅胶层析柱分离，用洗脱剂洗脱，高效液相检测丹酚酸A，收集含有丹酚酸A的洗脱液；

步骤五将步骤四得到的洗脱液，减压回收洗脱剂，再加水溶解，微波真空干燥，所述微波真空干燥温度：20-100℃，回差温度1-5℃，真空度-0.07Mpa以上，微波功率1-100KW，干燥10-200分钟，得进一步纯化的丹酚酸A。

优选的，其中步骤一中所述大孔树脂柱为HPD-80、HPD-100、HPD-100B、HPD-200A、HPD-300、HPD-450、HPD-722、HPD-826、ADS-5、ADS-8、ADS-21、D101或AB-8。

优选的，其中步骤一中所述洗脱剂分别为水及不同比例的水与乙醇，并且先用水与10～40％乙醇洗脱，除去杂质，再用20～60％乙醇洗脱。

优选的，其中步骤二中的所述洗脱剂分别为水及不同比例的水与乙醇，并且先用水、20～60％乙醇溶液洗脱除杂，再用40～9％乙醇溶液洗脱。

优选的，其中步骤三中所述的有机溶剂为叔丁基甲基醚、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯或甲酸乙酯。

优选的，其中步骤四中所述洗脱剂为石油醚、正戊烷、正庚烷、乙酸乙酯、乙酸甲酯、甲酸乙酯、叔丁基甲基醚组成的两相溶剂。

优选的，其中步骤一中所述丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1∶(45～55)，树脂柱径高比为1∶(8～18)。

更优选的，其中步骤一中所述丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1∶50，树脂柱径高比为1∶10。

优选的，其中步骤二中所述丹酚酸A上样量与层析柱比为1∶(8～18)，树脂柱径高比为1∶(6～20)。

更优选的，其中步骤二中所述丹酚酸A上样量与层析柱比为1∶10，树脂柱径高比为1∶8。

优选的，其中步骤一和步骤三中使用的pH调节剂为磷酸、盐酸、硫酸或醋酸。

本发明通过反复实验比较，首先确定了对丹酚酸A产率产生重要影响的因素pH值的范围。

再者，本发明分别选择了弱极性和非极性大孔吸附树脂进行粗分离，再选择聚酰胺等层析柱分离、有机溶剂萃取、硅胶分离，并对不同洗脱液进行测定，去除杂质部分后，将丹酚酸A含量从10％左右提高到80％，至90％，至93％，至96％。

进一步，在显著提高转化率的同时，本发明通过适于实际产业应用的纯化步骤，尤其是通过一系列的分离、洗脱处理等步骤后，没有采用传统的减压干燥或真空干燥，而是采用微波真空干燥，从而彻底克服了以往干燥温度过高，干燥时间过长，冷冻干燥时间过长，成本极高且冷冻干燥所得的提取物过度蓬松，不易保存与使用以及对丹酚酸A的破坏大的缺陷。

并且，由于本发明要解决的是如何进一步纯化丹酚酸A并不破坏丹酚酸A的纯化方法。因此，本发明的纯化原料并不局限于某一特定方法获得的含有丹酚酸A的洗脱液或提取液。例如可以采用背景技术中CN101041620A公开的“将丹参饮片或粉碎的丹参采用水或浓度10-95％的乙醇作为提取溶剂，采用温浸、回流法提取，采用过滤、自然沉淀或离心方法初步除去固体杂质”得到的提取液：也可以采用CN101121658A中公开的“向丹参饮片或粉碎的丹参中加入适量的溶剂作为溶媒，经过提取后，进行固液分离”得到的提取液；还可以是CN101480423A中公开的“向丹参饮片或初粉中加入适量的提取溶剂进行回流提取或渗漉；过滤”得到的提取液。当然，也包括采用常规方法获得的洗脱液。总之，本发明中使用的含有丹酚酸A的洗脱液或提取液原料可以是本技术人员熟知的任意常规方法提取获得的洗脱液或提取液。在此基础上，再进一步采用本发明提供的进一步纯化丹酚酸A的工艺方法，能极大的提高丹酚酸A的产率。

综上所述，本发明提供了一种非常适合产业应用且生产成本较低的新的制备丹酚酸A的工艺方法。

具体实施方式

实施例1

将含有丹酚酸A的洗脱液或提取液用20％磷酸调pH值至2.5，离心，上清液减压浓缩至每1ml含丹酚酸A3mg，经HPD-100大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1∶50，树脂柱径高比为1∶10，分别用3倍柱体积水、5倍柱体积25％乙醇洗脱，除去杂质，再用4倍柱体积40％乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的40％乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；水溶液浓缩至每ml含5mg丹酚酸A的溶液，通过聚酰胺层析柱分离，丹酚酸A上样量与聚酰胺比为1∶10，树脂柱径高比为1∶8，分别用3倍柱体积水、12倍柱体积40％乙醇溶液洗脱除杂，再用8倍柱体积60％乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的60％乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至每1ml含丹酚酸A15mg水溶液；水溶液用20％磷酸调pH至2.5，用水溶液3倍量的叔丁基甲基醚，分3次萃取，分离有机层，减压回收叔丁基甲基醚，制成每1ml含丹酚酸A0.5g的萃取液，加入1～3倍量硅胶，搅拌，挥干；把搅拌样硅胶加到已装好的15倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1∶10，以正戊烷-叔丁基甲基醚为洗脱剂，梯度洗脱，分别用正戊烷-叔丁基甲基醚(4∶6)洗脱10倍柱体积，正戊烷-叔丁基甲基醚(6∶4)洗脱10倍柱体积，减压回收洗脱剂，再加10倍量水溶解，用微波真空干燥，干燥温度80℃，回差温度3℃，真空度-0.05Mpa以上，微波功率60KW，干燥150分钟，得丹酚酸A，测得含量为96.62％。

实施例2

将含有丹酚酸A的洗脱液或提取液用15％盐酸调pH值至2.5，离心，上清液减压浓缩至每1ml含丹酚酸A5mg，经HPD-100大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1∶45，树脂柱径高比为1∶8，分别用3.5倍柱体积水、4倍柱体积25％乙醇洗脱，除去杂质，再用5倍柱体积45％乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的45％乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；水溶液浓缩至每ml含5mg丹酚酸A的溶液，通过聚酰胺层析柱分离，丹酚酸A上样量与聚酰胺比为1∶9，树脂柱径高比为1∶7，分别用4倍柱体积水、10倍柱体积40％乙醇溶液洗脱除杂，再用8倍柱体积65％乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的65％乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至每1ml含丹酚酸A12mg水溶液；水溶液用15％盐酸调pH至2.6，用4倍量的叔丁基甲基醚，分4次萃取，分离有机层，减压回收叔丁基甲基醚，制成每1ml含丹酚酸A0.8g的萃取液，加入2～3倍量硅胶，搅拌，挥干；把搅拌样硅胶加到已装好的13倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1∶8，以正庚烷-乙酸乙酯为洗脱剂，梯度洗脱，分别用正庚烷-乙酸乙酯(4∶6)洗脱8倍柱体积，正庚烷-乙酸乙酯(7∶3)洗脱8倍柱体积，减压回收洗脱剂，再加8倍量水溶解，用微波真空干燥，干燥温度70℃，回差温度5℃，真空度-0.06Mpa以上，微波功率80KW，干燥120分钟，得丹酚酸A，测得含量为95.79％。

实施例3

将含有丹酚酸A的洗脱液或提取液用15％硝酸调pH值至2.8，离心，上清液减压浓缩至每1ml含丹酚酸A6mg，经HPD-100B大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1∶40，树脂柱径高比为1∶7，分别用4倍柱体积水、4倍柱体积25％乙醇洗脱，除去杂质，再用5倍柱体积40％乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的40％乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；水溶液浓缩至每ml含6mg丹酚酸A的溶液，通过聚酰胺层析柱分离，丹酚酸A上样量与聚酰胺比为1∶8，树脂柱径高比为1∶8，分别用4倍柱体积水、9倍柱体积40％乙醇溶液洗脱除杂，再用7倍柱体积65％乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的65％乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至每1ml含丹酚酸A10mg水溶液；水溶液用15％硝酸调pH至2.6，用4倍量的乙酸甲酯，分4次萃取，分离有机层，减压回收乙酸甲酯，制成每1ml含丹酚酸A0.7g的萃取液，加入3倍量硅胶，搅拌，挥干；把搅拌样硅胶加到已装好的10倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1∶7，以石油醚、甲酸乙酯为洗脱剂，梯度洗脱，分别用石油醚-甲酸乙酯(4∶6)洗脱8倍柱体积，石油醚-甲酸乙酯(6∶4)洗脱9倍柱体积，减压回收洗脱剂，再加8倍量水溶解，用微波真空干燥，干燥温度75℃，回差温度4℃，真空度-0.04Mpa以上，微波功率50KW，干燥160分钟，得丹酚酸A，测得含量为96.13％。

实施例4

将含有丹酚酸A的洗脱液或提取液用20％硫酸调pH值至2.6，离心，上清液减压浓缩至每1ml含丹酚酸A5mg，经HPD-826大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1∶40，树脂柱径高比为1∶7，分别用4倍柱体积水、4倍柱体积25％乙醇洗脱，除去杂质，再用5倍柱体积40％乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的40％乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；水溶液浓缩至每ml含6mg丹酚酸A的溶液，通过ODS层析柱分离，丹酚酸A上样量与ODS比为1∶10，树脂柱径高比为1∶15，分别用4倍柱体积水、7倍柱体积35％乙醇溶液洗脱除杂，再用6倍柱体积60％乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的60％乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至每1ml含丹酚酸A12mg水溶液；水溶液用20％硫酸调pH至2.8，用4倍量的乙酸丁酯，分4次萃取，分离有机层，减压回收乙酸丁酯，制成每1ml含丹酚酸A0.5g的萃取液，加入2.5倍量硅胶，搅拌，挥干；把搅拌样硅胶加到已装好的9倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1∶8，以正戊烷、乙酸甲酯为洗脱剂，梯度洗脱，分别用正戊烷-乙酸甲酯(4.5∶5.5)洗脱8倍柱体积，正戊烷-乙酸甲酯(6.5∶3.5)洗脱8倍柱体积，减压回收洗脱剂，再加10倍量水溶解，用微波真空干燥，干燥温度70℃，回差温度2℃，真空度-0.04Mpa以上，微波功率110KW)干燥200分钟，得丹酚酸A，测得含量为94.95％。

实施例5

将含有丹酚酸A的洗脱液或提取液用20％醋酸调pH值至2.6，离心，上清液减压浓缩至每1ml含丹酚酸A5mg，经HPD-826大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1∶35，树脂柱径高比为1∶8，分别用3倍柱体积水、4.5倍柱体积25％乙醇洗脱，除去杂质，再用6倍柱体积40％乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的40％乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；水溶液浓缩至每ml含8mg丹酚酸A的溶液，通过ODS层析柱分离，丹酚酸A上样量与ODS比为1∶12，树脂柱径高比为1∶18，分别用4倍柱体积水、8倍柱体积30％乙醇溶液洗脱除杂，再用5倍柱体积65％乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的65％乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至每1ml含丹酚酸A15mg水溶液；水溶液用20％醋酸调pH至2.7，用5倍量的乙酸乙酯，分5次萃取，分离有机层，减压回收乙酸乙酯，制成每1ml含丹酚酸A0.5g的萃取液，加入2倍量硅胶，搅拌，挥干；把搅拌样硅胶加到已装好的10倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1∶10，以正戊烷、乙酸甲酯为洗脱剂，梯度洗脱，分别用正戊烷-乙酸甲酯(4.5∶5.5)洗脱8倍柱体积，正戊烷-乙酸甲酯(6.5∶3.5)洗脱8倍柱体积，减压回收洗脱剂，再加12倍量水溶解，用微波真空干燥，干燥温度45℃，回差温度1℃，真空度-0.02Mpa以上，微波功率20KW，干燥150分钟，得丹酚酸A，测得含量为95.77％。

实施例6

将含有丹酚酸A的洗脱液或提取液用10％氢氧化钠调pH至5.6，加入0.5％CuCl₂作为催化剂，在133℃温度加热转化4.5小时，转化液用10％盐酸调pH值至2.7，离心，上清液减压浓缩至每1ml含丹酚酸A5mg，经HPD-D101大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1∶40，树脂柱径高比为1∶9，分别用4倍柱体积水、4倍柱体积22％乙醇洗脱，除去杂质，再用6倍柱体积43％乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的43％乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；水溶液浓缩至每ml含10mg丹酚酸A的溶液，通过ODS层析柱分离，丹酚酸A上样量与葡聚糖凝胶LH-20比为1∶15，树脂柱径高比为1∶20，分别用4倍柱体积水、8倍柱体积30％乙醇溶液洗脱除杂，再用5倍柱体积60％乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的60％乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至每1ml含丹酚酸A12mg水溶液；水溶液用10％盐酸调pH至2.8，用5倍量的乙酸甲酯，分5次萃取，分离有机层，减压回收乙酸甲酯，制成每1ml含丹酚酸A0.5g的萃取液，加入3倍量硅胶，搅拌，挥干；把搅拌样硅胶加到已装好的12倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1∶10，以正戊烷、乙酸甲酯为洗脱剂，梯度洗脱，分别用正戊烷-乙酸甲酯(4∶6)洗脱6倍柱体积，正戊烷-乙酸甲酯(6∶4)洗脱7倍柱体积，减压回收洗脱剂，再加10倍量水溶解，用微波真空干燥，干燥温度25℃，回差温度13℃，真空度-0.03Mpa以上，微波功率30KW，干燥140分钟，得丹酚酸A，测得含量为95.28％。

实施例7

将含有丹酚酸A的洗脱液或提取液用15％硫酸调pH值至3.0，离心，上清液减压浓缩至每1ml含丹酚酸A5mg，经AB-8大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1∶36，树脂柱径高比为1∶9，分别用3倍柱体积水、4倍柱体积25％乙醇洗脱，除去杂质，再用5倍柱体积45％乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的45％乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；水溶液浓缩至每1ml含6mg丹酚酸A的溶液，通过聚酰胺层析柱分离，丹酚酸A上样量与聚酰胺比为1∶10，树脂柱径高比为1∶10，分别用4倍柱体积水、8倍柱体积45％乙醇溶液洗脱除杂，再用8倍柱体积65％乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的65％乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至每1ml含丹酚酸A10mg水溶液；水溶液用15％硫酸调pH至2.7，用4倍量的叔丁基甲基醚，分4次萃取，分离有机层，减压回收叔丁基甲基醚，制成每1ml含丹酚酸A0.6g的萃取液，加入3倍量硅胶，搅拌，挥干；把搅拌样硅胶加到已装好的10倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1∶8，以正戊烷、乙酸乙酯为洗脱剂，梯度洗脱，分别用正戊烷-乙酸乙酯(4∶6)洗脱8倍柱体积，正戊烷-乙酸乙酯(6∶4)洗脱8倍柱体积，减压回收洗脱剂，再加8倍量水溶解，用微波真空干燥，干燥温度45℃，回差温度4℃，真空度-0.05Mpa以上，微波功率35KW)干燥130分钟，得丹酚酸A，测得含量为95.47％。

实施例8

将含有丹酚酸A的洗脱液或提取液用10％盐酸调pH值至2.8，离心，上清液减压浓缩至每1ml含丹酚酸A5mg，经HPD-300大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1∶45，树脂柱径高比为1∶10，分别用5倍柱体积水、6倍柱体积20％乙醇洗脱，除去杂质，再用5倍柱体积45％乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的45％乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；水溶液浓缩至每1ml含8mg丹酚酸A的溶液，通过聚酰胺层析柱分离，丹酚酸A上样量与聚酰胺比为1∶12，树脂柱径高比为1∶8，分别用3倍柱体积水、6倍柱体积45％乙醇溶液洗脱除杂，再用8倍柱体积55％乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的55％乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至每1ml含丹酚酸A10mg水溶液；水溶液用15％盐酸调pH至2.9，用5倍量的叔丁基甲基醚，分5次萃取，分离有机层，减压回收叔丁基甲基醚，制成每1ml含丹酚酸A0.6g的萃取液，加入2.5倍量硅胶，搅拌，挥干；把搅拌样硅胶加到已装好的12倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1∶8，以正戊烷、叔丁基甲基醚为洗脱剂，梯度洗脱，分别用正戊烷-叔丁基甲基醚(4∶6)洗脱8倍柱体积，正戊烷-叔丁基甲基醚(6∶4)洗脱8倍柱体积，减压回收洗脱剂，再加9倍量水溶解，用微波真空干燥，干燥温度85℃，回差温度5℃，真空度-0.07Mpa以上，微波功率60KW，干燥120分钟，得丹酚酸A，测得含量为95.62％。

实验例1：丹酚酸A的大孔吸附树脂纯化

取实施例1中含丹酚酸A的提取液13份，置预处理好的各型号大孔树脂100g中，摇床动态吸附8小时后，装柱，依次用水洗洗脱3个柱体积、20％乙醇洗脱5个柱体积、70％乙醇洗脱5个柱体积，收集70％乙醇含丹酚酸A洗脱液部分，进行丹酚酸A含量测定，洗脱液蒸干计算干膏量，结果见表1。

表1.大孔树脂型号的确认

结果表明：以上13种大孔树脂对丹酚酸A的吸附效果良好，且用不同浓度的乙醇梯度洗脱可以很好的去除杂质，得到含量大于75％的丹酚酸A洗脱液。

实验例2：丹酚酸A的柱层析纯化

取上述丹酚酸A一次柱色谱溶液3份，置预处理好的各型号树脂100g中，摇床动态吸附8小时后，装柱，依次用水洗洗脱3个柱体积、20％乙醇洗脱5个柱体积、70％乙醇洗脱5个柱体积，收集70％乙醇洗脱液进行丹酚酸A含量测定，部分洗脱液蒸干计算干膏量，结果见表2。

表2.树脂型号的确认

结果表明：以上3种树脂对丹酚酸A的吸附效果良好，且用不同浓度的乙醇梯度洗脱可以很好的去除杂质，得到含量约为90％的丹酚酸A洗脱液。

实验例3：丹酚酸A的萃取纯化

将上述70％乙醇洗脱液减压回收乙醇，调pH值2.0～4.0，再用正丁醇、叔丁基甲基醚、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲酸乙酯、乙醇提取5次，分离有机溶剂相，回收溶剂，干燥，得丹酚酸A提取物，测定丹酚酸A含量，结果见表3。

表3.萃取用有机溶剂的确认

表3结果表明：正丁醇由于极性大，丹酚酸A提取物量最多，但其丹酚酸含量没得到明显提高，乙醚由于极性偏小，水溶性杂质少，丹酚酸A含量高，但得到的丹酚酸A提取物量少，其他提取溶剂叔丁基甲基醚、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲酸乙酯得到的丹酚酸A提取物量较大，丹酚酸A含量均得到提高。

实验例4：丹酚酸A的硅胶柱层析纯化

取上述丹酚酸A二次柱色谱洗脱液12份，每份含丹酚酸A10g，用叔丁基甲基醚萃取后，分离有机层，加入20g的硅胶，搅拌，挥干；把搅拌样硅胶加到已装好的100g干硅胶柱上，分别以石油醚、正戊烷、正庚烷、乙酸乙酯、乙酸甲酯、甲酸乙酯、叔丁基甲基醚组成的两相溶剂为洗脱剂，HPLC或薄层色谱检测，收集丹酚酸A洗脱液，进行丹酚酸A含量测定，部分洗脱液蒸干计算干膏量，结果见表4。

表4.洗脱剂的确认

结果表明：丹酚酸A用正相硅胶柱色谱时，采用石油醚、正戊烷、正庚烷、乙酸乙酯、乙酸甲酯、甲酸乙酯、叔丁基甲基醚组成的两相溶剂为洗脱剂，梯度洗脱，可以很好的去除杂质，得到高纯度的丹酚酸A洗脱液。

实验例5：丹酚酸A干燥方法研究

取上述柱色谱洗脱液4份，每份含丹酚酸A100g，浓缩至无稠膏状，加10倍量水溶解后分别采用真空干燥、冷冻真空干燥、喷雾干燥、微波真空干燥得打丹酚酸A提取物，对该提取物进行检测，结果见表5。

表5.丹酚酸A干燥方法检测结果

结果表明：采用冷冻真空干燥时间过长，成本过高，且有机溶剂残留严重；真空干燥时间略长，喷雾干燥时间短但瞬间温度较高；微波真空干燥干燥温度低，时间短，所得丹酚酸A各项指标良好。

Claims (9)

1.一种丹酚酸A纯化方法，其特征在于：将含有丹酚酸A的洗脱液或提取液；采用如下步骤进一步纯化：

步骤一将所述洗脱液或提取液减压浓缩至每 1mL含丹酚酸Al-10mg，调pH至2.5～4.5，离心，上清液经非极性或弱极性大孔树脂柱层析分离，所述丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1∶(35～70)，树脂柱径高比为1∶(4～30)，用水洗脱后，用洗脱剂洗脱，高效液相检测丹酚酸A，收集含有丹酚酸A的洗脱液；

步骤二将步骤一得到的洗脱液浓缩至每 mL含1-10mg丹酚酸A的溶液，用葡聚糖凝胶LH-20或ODS-C18或聚酰胺层析柱分离，所述丹酚酸A上样量与层析柱比为1∶(5～25)，树脂柱径高比为1∶(4～25)，用洗脱剂洗脱，高效液相检测丹酚酸A，收集含有丹酚酸A的洗脱液，洗脱液减压回收并浓缩成水溶液；

步骤三将步骤二得到的水溶液调pH至2.0～4.0，经有机溶剂萃取，分离有机溶剂相，所述的有机溶剂为叔丁基甲基醚、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯或甲酸乙酯；

步骤四将步骤三得到的溶液减压回收有机溶剂，制成每 1mL含丹酚酸A500～10000mg的萃取液，用硅胶层析柱分离，用洗脱剂洗脱，高效液相检测丹酚酸A，收集含有丹酚酸A的洗脱液，其中所述洗脱剂为石油醚、正戊烷、正庚烷、乙酸甲酯、甲酸乙酯、叔丁基甲基醚组成的两相溶剂；

步骤五将步骤四得到的洗脱液，减压回收洗脱剂，再加水溶解，微波真空干燥，所述微波真空干燥温度：20-100℃，回差温度1-5℃，真空度-0. 07MPa以上，微波功率1-100kW，干燥10-200分钟，得进一步纯化的丹酚酸A。

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其中步骤一中所述大孔树脂柱为HPD-80、HPD-100、HPD-100B、HPD-200A、HPD-300、HPD-450、HPD-722、HPD-826、ADS-5、ADS-8、ADS-21、D101或AB-8。

3.根据权利要求1所述的纯化方法，其中步骤一中所述洗脱剂分别为水及不同比例的水与乙醇，并且先用水与10～40％乙醇洗脱，除去杂质，再用20～60％乙醇洗脱。

4.根据权利要求1所述的纯化方法，其中步骤二中的所述洗脱剂分别为水及不同比例的水与乙醇，并且先用水、20～60％乙醇溶液洗脱除杂，再用40～9％乙醇溶液洗脱。

5.根据权利要求1所述的纯化方法，其中步骤一中所述丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1∶(45～55)，树脂柱径高比为1∶(8～18)。

6.根据权利要求5所述的纯化方法，其中步骤一中所述丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1∶50，树脂柱径高比为1∶10。

7.根据权利要求1所述的纯化方法，其中步骤二中所述丹酚酸A上样量与层析柱比为1∶(8～18)，树脂柱径高比为1∶(6～20)。

8.根据权利要求7所述的纯化方法，其中步骤二中所述丹酚酸A上样量与层析柱比为1∶10，树脂柱径高比为1∶8。

9.根据权利要求1所述的纯化方法，其中步骤一和步骤三中使用的pH调节剂为磷酸、盐酸、硫酸或醋酸。