CN103479723A - 丹参二萜醌有效部位及其逆流色谱制备方法和癌症治疗应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于中医药技术领域，涉及一种丹参二萜醌有效部位及其逆流色谱制备方法和癌症治疗应用。它解决了现有技术提取难度较大，品质难以控制，有效部位提取率不高等技术问题。制备方法包括：A、提取：以丹参为原料，采用超临界流体萃取法或溶剂提取法对丹参提取，得到丹参总二萜醌；B、分离：将上述丹参总二萜醌进行高速逆流色谱半制备分离，收集富含隐丹参酮的流分，减压回收逆流色谱溶剂，干燥，得到丹参二萜醌有效部位。其优点在于：丹参二萜醌有效部位生理活性强，含有多个在生物医药领域具有广阔应用前景的迈克尔反应受体分子。有效部位，多个成分之间具有“多组分、多靶点”的协同作用，能够一定程度上代表丹参药材的功效。

Description

丹参二萜醌有效部位及其逆流色谱制备方法和癌症治疗应用

技术领域

本发明属于中医药技术领域，涉及丹参，尤其是涉及一种丹参二萜醌有效部位及其逆流色谱制备方法和癌症治疗应用。 

背景技术

丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)的根及根茎，具有活血、化瘀、益气等功效。丹参性味平和，毒副作用小，为临床常用大宗中药。《神农本草经》记载：“丹参，味苦、微寒。主心腹邪气，肠鸣幽幽如走水，寒热积聚，破症除瘕，止烦满，益气”。丹参脂溶性成分的应用可追溯到南北朝时期。中医典籍记载，丹参用苦酒与猪脂提取，所得即为“赤羔”，主治疮疡痈肿。“赤羔”即为丹参总二萜醌类成分，该类成分以丹参酮ⅡA、隐丹参酮等为代表，临床主要用于心、脑血管疾病的治疗。近年来研究表明：丹参二萜醌对多种人源肿瘤细胞亦具有抑制作用，并且能诱导肿瘤细胞分化、凋亡，抑制肿瘤细胞侵袭、转移。丹参二萜醌多具有α、β、γ、δ不饱和酮结构单元，为一类结构新颖的迈克尔反应受体分子，在生物医药领域具有良好的应用前景。隐丹参酮是一种高效、特异的STAT3抑制剂(Cancer Research, 2009)。丹参二萜醌“多组分、多靶点”协同应对肝癌等复杂疾病，体现了中医药协同的特色与优势。 

目前，在丹参二氧化碳超临界流体萃取法上，文献“均匀设计法优化超临界CO₂超临界流体萃取丹参中丹参酮工艺的研究”（何雁；均匀设计法优化超临界CO₂超临界流体萃取丹参中丹参酮工艺的研究；中国中药杂志；2006年第31卷24期）公开了丹参二氧化碳超临界流体萃取的工艺，包括以萃取物中3种丹参酮 总成分的含量为指标，考察丹参超临界流体萃取的工艺条件。超临界流体萃取法对于丹参二萜醌类脂溶性成分的提取具有一定的优势，但文献将三种具体的丹参酮作为首选的考察指标，而非以总二萜醌为指标，可能会使总二萜醌的得率受到一定的影响，存在一定的技术缺陷。 

目前，在丹参二萜醌溶剂提取方面，文献“硅胶柱色谱结合高速逆流色谱法分离纯化丹参中丹参酮”（蓝天凤；硅胶柱色谱结合高速逆流色谱法分离纯化丹参中丹参酮；中草药；2011年第42卷3期）公开了丹参的提取方法，包括丹参粉碎成粗粉，用石油醚、甲醇渗漉提取，收集甲醇提取液，浓缩后等体积氯仿萃取，得到丹参酮粗提物。该提取方法能高效地提取出总丹参酮，虽然丹参总二萜醌极性较小，但石油醚渗漉时，仍会造成丹参二萜醌的损失；甲醇提取，毒性亦较大，不适宜工业化生产，存在一定的技术缺陷。 

目前，在丹参二萜醌高速逆流色谱分离上，文献“高速逆流色谱分离制备丹参脂溶性成分”（屈焱；高速逆流色谱分离制备丹参脂溶性成分；化学工业与工程；2007年第24卷1期）公开了5种丹参酮单体的高速逆流色谱分离、纯化方法，包括以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水为溶剂体系，优化了逆流色谱的色谱条件及操作方法。虽然该方法所用的溶剂系统对分离丹参二萜醌具有一定的优势，但该方法主要目的是分离单体，为了得到高纯度的单体，会损失分离效率，故建立的方法，转速只有800r/min，一次进样量不超过150mg，流速只有4mL/min，且分离时间需要380min，存在一定的技术缺陷。 

文献“硅胶柱色谱结合高速逆流色谱法分离纯化丹参中丹参酮”（蓝天凤；硅胶柱色谱结合高速逆流色谱法分离纯化丹参中丹参酮；中草药；2011年第42卷3期）公开了6种丹参酮单体的高速逆流色谱分离方法，该方法虽然分离得到了6个高纯度的丹 参二萜醌单体，但纯化方法用到了硅胶柱层析，会造成一定的环境污染；另外该方法效率亦较低，流速为2mL/min，转速为850r/min，一次进样量只有80mg，存在一定的技术缺陷。 

文献“一种绿色环保的丹参酮ⅡA及隐丹参酮的高速逆流色谱纯化方法研究”（Min Zhang，Svetlana Ignatovab,Ping Huc,Qionglin Liangd,Yiming Wangd,Guoan Luo,Frank Wu June,Ian Sutherland；Development of a strategy and process parameters for a green process in counter-current chromatography:Purification of tanshinone IIA and cryptotanshinone from Salvia miltiorrhiza Bunge as a case study；Journal of Chromatography A；2011；1218:6031-6037）公开了一种丹参酮ⅡA及隐丹参酮的高速逆流色谱纯化方法，该方法能分离纯化得到两种高纯度的丹参酮单体，得率较高，但该方法必须分两步进行，即先用逆流色谱粗分离，再细分单体，较繁琐，且第一步粗分离中，用到了二氯甲烷，二氯甲烷工业化大生产会对生产人员产生一定的肝损伤，存在一定的技术缺陷。 

文献“通过高速逆流色谱从丹参中提取、半制备分离丹参酮”（Ailing Sun，Yongqing Zhang,Aifeng Li,Zhaoling Meng,Renmin Liu；Extraction and preparative purification of tanshinones from Salvia miltiorrhiza Bunge by high-speed counter-current chromatography；Journal of Chromatography B；2011；879:1899-1904）公开了七种丹参二萜醌单体的逆流色谱制备方法，该法能同时分离得到七种高纯度丹参二萜醌单体，由于该法主要目标仍然是分离、纯化丹参二萜醌单体，故其流速只能调到2mL/min，转速为900r/min，分离400mg丹参总二萜醌约需550min，效率较低，且隐丹参酮的得率只有6.6%，存在一定的技术缺陷。 

文献“隐丹参酮通过阻断STAT3二聚体的形成抑制D145人前 列腺癌细胞”（Dae-Seop Shin,Hye-Nan Kim,Ki Deok Shin,Young Ju Yoon,Seung-Jun Kim,Dong Cho Han,and Byoung-Mog Kwon；Cryptotanshinone Inhibits Constitutive Signal Transducer and Activator of Transcription3Function through Blocking the Dimerization in DU145Prostate Cancer Cells；Cancer Res；2009；69:(1):193-202）公开了隐丹参酮具有显著抑制人前列腺癌细胞增殖的作用，且证明隐丹参酮为高效STAT3抑制剂，但隐丹参酮单体的生物活性不能代表丹参二萜醌有效部位的活性。“多组分，多靶点”协同，是中医药的优势与特色。丹参二萜醌有效部位在多个二萜醌单体协同应对复杂疾病，如癌症方面，具有一定的优势，故从协同的角度讲，隐丹参酮单独应用，具有一定的缺陷。 

经检索专利文献，中国专利文献公开了一种本发明涉及丹参有效部位标准提取物丹参酚酮、其制备方法以及包含所述丹参提取物的药物组合物及其在制备防治心脑缺血性疾病的药物中的应用[申请号：200610113897.4]。丹参酚酮的制备方法主要包括以下步骤:用二氧化碳超临界提取技术提取丹参酮类化合物,再用水煎煮提取水溶性丹酚酸类并以乙酸乙酯纯化,然后将获得的两种固体粉末按提取率及含量折算后进行混合。该方法使丹参酚酮同时富含丹参脂溶及水溶两类主要心脑血管活性成分且相对比例适当、丹参酚类和丹参酮类活性成分的转移率及其在制剂中的含量大幅度提高,从而可确保丹参酚酮可作为丹参的标准提取物,该标准提取物能代表丹参主要功效和作用并能保证其高的作用强度和更好的临床疗效。然而，上述方案仍然存在着提取难度较大，品质难以控制，有效部位提取率不高，生理活性较低，且提取物质量难以保障等技术问题。 

发明内容

本发明的目的是针对上述问题，提供一种工艺操作简单，生产成本低，适于工业化大生产的丹参二萜醌有效部位逆流色谱制备方法。 

本发明的另一目的是提供一种易于分离、纯化得到性质稳定、质量可控、生理活性强，含有多个在生物医药领域具有广阔应用前景的迈克尔反应受体分子，多个成分之间具有“多组分、多靶点”的协同作用的丹参二萜醌有效部位。 

本发明再有一目的是提供一种质量可控、剂量小、使用方便、对癌症具有明显抑制作用的丹参二萜醌有效部位作为治疗癌症药物的应用。 

为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：本丹参二萜醌有效部位逆流色谱制备方法，其特征在于，本制备方法包括下述步骤： 

A、提取：以丹参为原料，采用超临界流体萃取法或溶剂提取法对丹参提取，得到丹参总二萜醌； 

B、分离：将上述丹参总二萜醌进行高速逆流色谱半制备分离，收集富含隐丹参酮的流分，减压回收逆流色谱溶剂，干燥，得到丹参二萜醌有效部位。 

在上述的丹参二萜醌有效部位逆流色谱制备方法中，在上述的步骤A中，所述的丹参为中药丹参的根和/或根茎，且所述的丹参经打粉、过筛后，备用。丹参为大宗药材，价廉易得。 

在上述的丹参二萜醌有效部位逆流色谱制备方法中，所述的超临界流体萃取法溶媒为二氧化碳，夹带剂为无水乙醇，夹带剂体积分数为8～15%。二氧化碳超临界流体萃取法对丹参总二萜醌具有较高的提取效率，夹带剂的加入，使得极性较大的二萜醌亦有较高的提取得率；该方法提取温度较低，不会对热敏性成分造成破坏。 

在上述的丹参二萜醌有效部位逆流色谱制备方法中，所述的 超临界流体萃取法，丹参经打粉后过10目筛，用二氧化碳超临界流体萃取，萃取压力为25MPa，萃取温度为55℃，萃取2h，每小时加500mL无水乙醇作为夹带剂，分离釜温度为35℃。 

在上述的丹参二萜醌有效部位逆流色谱制备方法中，所述的溶剂提取法选用重量为丹参重量6～10倍量且质量浓度为95%的乙醇溶液，在常温下渗漉提取，提取液浓缩，加水混悬，用等体积的有机萃取溶剂萃取。 

在上述的丹参二萜醌有效部位逆流色谱制备方法中，所述的有机萃取溶剂包括石油醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯中的任意一种。溶剂提取法在常温下操作，能避免热敏性丹参二萜醌的损失；所述提取溶剂优先选用95%乙醇，该溶剂能将脂溶性的丹参二萜醌高效率地提取出来，且能避免其它水溶性杂质影响后续逆流色谱的分离；所述萃取溶剂包括石油醚，二氯甲烷，氯仿，乙酸乙酯；优先选用二氯甲烷，二氯甲烷对丹参总二萜醌具有较好的溶解能力，且能避免其它杂质被萃取出来，影响后续逆流色谱的分离。 

在上述的丹参二萜醌有效部位逆流色谱制备方法中，所述的逆流色谱溶剂包括正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水；或者所述的逆流色谱溶剂包括石油醚、乙酸乙酯、甲醇、水；其中上述逆流色谱溶剂的下相为流动相，采用反相色谱模式。能够分离丹参二萜醌的逆流色谱溶剂系统有多种，本发明采用的溶剂系统，上相及下相在转速较高，如1500r/min时，不会乳化，对高效分离非常有利；丹参二萜醌极性较小，所选溶剂系统的上相对丹参二萜醌具有较强的保留性能，故能提高分离效能；所述溶剂系统，除甲醇外，毒性均较小，且价廉，能降低生产成本。逆流色谱法流分洗脱出管路较集中，故本发明在有红色流分洗脱出管路时，立即开始收集流分，4mL收集一个流分；进样量较大时，紫外检测器检识存在一定的误差，故经薄层及液相色谱检识摸索，富含隐丹 参酮的流分主要集中在6～11管。 

在上述的丹参二萜醌有效部位逆流色谱制备方法中，所述的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的体积比为12:8:13:7；所述的石油醚、乙酸乙酯、甲醇、水的体积比为12:8:13:7。 

根据上述丹参二萜醌有效部位逆流色谱制备方法制得的丹参二萜醌有效部位，其特征在于，所述的丹参二萜醌有效部位的隐丹参酮面积归一化法含量为65～75%，余量为其他丹参二萜醌类成分。 

根据上述丹参二萜醌有效部位逆流色谱制备方法制得的丹参二萜醌有效部位作为治疗癌症药物的应用。更具体地说，丹参二萜醌有效部位对人肝癌、人肺癌、人胃癌、人结肠癌、人骨髓瘤、人乳腺癌等十三种人源肿瘤细胞株，具有一定的抑制作用。以CCK-8法，对高速逆流色谱法分离纯化得到的丹参二萜醌有效部位，进行了抑制人源肿瘤细胞株增殖活性的筛选，结果显示，本发明制备的丹参二萜醌有效部位对人肝癌、人肺癌、人胃癌、人结肠癌、人骨髓瘤、人乳腺癌，九种人源肿瘤细胞株具有一定的抑制作用，半数抑制浓度IC₅₀约为：4.37～29.0μg/mL。上述细胞株可采用市售产品，如可采用美国模式培养物集存库ATCC(American type culture collection)的各种细胞株。 

与现有的技术相比，本丹参二萜醌有效部位及其逆流色谱制备方法和癌症治疗应用的优点在于：丹参二萜醌有效部位生理活性强，含有多个在生物医药领域具有广阔应用前景的迈克尔反应受体分子。有效部位，多个成分之间具有“多组分、多靶点”的协同作用，能够一定程度上代表丹参药材的功效，并且具有质量可控、剂量小、使用方便等优点，有别于传统中药“粗、大、黑”的落后的应用形式。首次利用半制备型高速逆流色谱法，分离、纯化得到了富含隐丹参酮的有效部位。使用的溶剂廉价易得，且毒性较低。高速逆流色谱与硅胶柱层析、大孔吸附树脂等分离、 纯化方法相比，更适合进行工业化生产，属于绿色节能，环境友好型纯化方法。本发明丹参二萜醌有效部位的制备方法操作简单，生产成本低，适于工业化大生产。 

附图说明

图1为丹参总二萜醌超高效液相色谱图。 

图2为隐丹参酮、丹参酮IIA混标超高效液相色谱图。 

图3为丹参二萜醌有效部位超高效液相色谱图。 

图4为隐丹参酮对照品超高效液相色谱图。 

具体实施方式

实施例1： 

本丹参二萜醌有效部位逆流色谱制备方法包括下述步骤：A、提取：以丹参为原料，采用超临界流体萃取法对丹参提取，得到丹参总二萜醌；B、分离：将上述丹参总二萜醌进行高速逆流色谱半制备分离，收集富含隐丹参酮的流分，减压回收逆流色谱溶剂，干燥，得到丹参二萜醌有效部位。 

丹参为中药丹参的根和/或根茎，且所述的丹参经打粉、过筛后，备用；具体而言为过10目筛。超临界流体萃取法溶媒为二氧化碳，夹带剂为无水乙醇，夹带剂体积分数为8～15%，且优选的夹带剂体积分数为10%。二氧化碳超临界流体萃取法对丹参总二萜醌具有较高的提取效率，夹带剂的加入，使得极性较大的二萜醌亦有较高的提取得率；该方法提取温度较低，不会对热敏性成分造成破坏。具体而言，超临界流体萃取法，丹参经打粉后过10目筛，用二氧化碳超临界流体萃取，萃取压力为25MPa，萃取温度为55℃，萃取2h，每小时加500mL无水乙醇作为夹带剂，分离釜温度为35℃。 

逆流色谱溶剂包括正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水；其中上述 逆流色谱溶剂的下相为流动相，采用反相色谱模式；并且正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的体积比为12:8:13:7。具体而言，丹参总二萜醌用上相及下相溶解，采用反相色谱模式，流动相上行法，进行逆流色谱半制备分离，通过薄层层析及液相色谱检识，收集富含隐丹参酮的流分，减压回收溶剂，干燥，得到丹参二萜醌有效部位。如：丹参总二萜醌用6mL上相及6mL下相溶解，一次进样量为500mg，样品用0.45μm微孔滤膜过滤，备用；固定相充满管路后，调流速至1200～1500r/min，直接进样，再用流动相开始洗脱，流动相流速为5～7mL/min；红色流分流出管路后，立即开始收集流分，4mL收集一个流分，取6～11管，合并流分，减压回收溶剂，干燥，即得到丹参二萜醌有效部位。 

显然，能够分离丹参二萜醌的逆流色谱溶剂系统有多种，本实施例采用的溶剂系统，上相及下相在转速较高，如1500r/min时，不会乳化，对高效分离非常有利；丹参二萜醌极性较小，所选溶剂系统的上相对丹参二萜醌具有较强的保留性能，故能提高分离效能；所述溶剂系统，除甲醇外，毒性均较小，且价廉，能降低生产成本。逆流色谱法流分洗脱出管路较集中，故本发明在有红色流分洗脱出管路时，立即开始收集流分，4mL收集一个流分；进样量较大时，紫外检测器检识存在一定的误差，故经薄层及液相色谱检识摸索，富含隐丹参酮的流分主要集中在6～11管。丹参二萜醌有效部位的隐丹参酮面积归一化法含量为65～75%，余量为其他丹参二萜醌类成分，故该有效部位是富含隐丹参酮的丹参二萜醌有效组分群。 

图1为丹参总二萜醌超高效液相色谱图。图2为隐丹参酮、丹参酮IIA混标超高效液相色谱图。其中，色谱条件：流动相，图1采用0.1%甲酸水，图2采用乙腈，梯度洗脱，0～19min，25～60%；图2中19～20min，60～25%；图2中流速：0.3mL/min，进样量1μL，检测波长，270nm。图3为丹参二萜醌有效部位超 高效液相色谱图。图4为隐丹参酮对照品超高效液相色谱图。色谱条件：流动相，图3采用0.1%甲酸水，图4采用乙腈，梯度洗脱，0～19min，25～60%；图4中19～20min，60～25%；图4中流速：0.3mL/min，进样量1μL，检测波长，270nm。 

详细制备过程如下： 

①取10kg干燥的丹参饮片，打粉，过10目筛，投入装置中，进行二氧化碳超临界流体萃取，萃取压力为25MPa，萃取温度为55℃，萃取2h，每小时加入500mL无水乙醇，分离釜温度为35℃，得到的提取液（主要为提取物的无水乙醇溶液），在50℃以下减压蒸干，得到约31.2g红色膏状物。 

②所得到的丹参总二萜醌约500mg，精密称定，用6mL上相及6mL下相溶解，用0.45μm微孔滤膜过滤，备用；按正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水体积比为12︰8︰13︰7配制一定体积的溶剂，充分振摇，静置过夜，分取上相及下相，使用前超声脱气5min；将上相首先泵入逆流色谱仪，流速：15mL/min，转速300r/min；泵入约350mL上相后，将转速调至1300r/min，进样，开始用流动相洗脱，流速为6mL/min，待红色流分流出管路后，开始收集流分，4mL收集一管，取6～11管，合并流分，减压回收溶剂，干燥，即得到丹参二萜醌有效部位。按此方法，反复进行逆流色谱分离纯化，共得到约2.7g丹参二萜醌有效部位。 

取制备的丹参总二萜醌约12.5mg，精密称定，加甲醇溶解定容至25mL的容量瓶中，过0.22μm的微孔滤膜，备用；取隐丹参酮及丹参酮IIA的对照品适量，精密称定，配成10μg/mL隐丹参酮、50μg/mL丹参酮IIA的混合对照品溶液，备用；取制备的丹参二萜醌有效部位适量，加甲醇溶解，制成1mg/mL的供试液，过0.22μm的微孔滤膜，备用；取隐丹参酮适量，加甲醇溶解，制成1mg/mL的对照品溶液，备用；取上述对照品溶液及样品供试液，进行Waters Acquity UPLC/TUV超高效液相色谱分析，液相色谱 条件：流速：0.3mL/min，检测波长：270nm，洗脱体系：乙腈-0.1%甲酸水，洗脱条件：0～19min，25～60%乙腈，19～20min，60～25%乙腈，进样量1μL。 

丹参二萜醌有效部位逆流色谱制备方法制得的丹参二萜醌有效部位作为治疗癌症药物的应用。更具体地说，丹参二萜醌有效部位对人肝癌、人肺癌、人胃癌、人结肠癌、人骨髓瘤、人乳腺癌等十三种人源肿瘤细胞株，具有一定的抑制作用。以CCK-8法，对高速逆流色谱法分离纯化得到的丹参二萜醌有效部位，进行了抑制人源肿瘤细胞株增殖活性的筛选，结果显示，本发明制备的丹参二萜醌有效部位对人肝癌、人肺癌、人胃癌、人结肠癌、人骨髓瘤、人乳腺癌，九种人源肿瘤细胞株具有一定的抑制作用，半数抑制浓度IC₅₀约为：4.37～29.0μg/mL。上述细胞株可采用市售产品，如可采用美国模式培养物集存库ATCC(American type culture collection)的各种细胞株。 

丹参二萜醌有效部位体外抗肿瘤实验： 

取对数生长期的人源肿瘤细胞株，消化计数后，按6～9×10³个细胞/100μL/孔接种于96孔细胞培养板中，培养24h待细胞贴壁后，用不同浓度的丹参二萜醌有效部位处理，每孔设三个复孔。药物与肿瘤细胞孵育24h后，加CCK-8，37℃继续孵育1h后，终止培养，用移液枪轻轻吸掉培养液，加入DMSO（150μL/孔），振摇均匀后，用酶标仪在450nm处测定每个孔的光密度OD值，各平行孔的OD值取平均数，将各测试孔的OD值减去本底OD值。肿瘤细胞的抑制率： 

抑制率=（1-给药孔平均光密度值/对照组平均光密度值）×100%。根据抑制率计算药物对肿瘤细胞的半数抑制浓度（IC₅₀），IC₅₀用82798-IC50软件计算。实验重复3次，IC₅₀取mean±SD。 

分别对人肝癌、人肺癌、人胃癌、人结肠癌、人骨髓瘤、人乳腺癌，九种人源肿瘤细胞株进行试验，上述细胞株购自ATCC， 具体结果如表1所示。表1的结果显示，丹参二萜醌有效部位体外对九种人源肿瘤细胞株均具有一定的抑制作用。 

表1：丹参二萜醌有效部位对人源肿瘤细胞株的半数抑制浓度IC₅₀值(mean±SD,n=3) 

本发明制备得到的丹参二萜醌有效部位可与市售或者常用的载体结合，用于制备治疗或协同治疗癌症的药物。所述药物可以为粉针剂、脂肪乳剂、注射剂、片剂、胶囊剂等形式。 

本发明丹参二萜醌有效部位，当在治疗上进行施用（给药）时，可提供不同的效果。通常，可将本发明制备的丹参二萜醌有效部位配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中，pH通常约5～8，较佳的pH约为6～8，pH可根据所选辅料、基质及治疗疾病病症的不同而有所变化。配制好的药物可以通过常规途径给药，其中包括（但并不限于）：肌肉、腹膜内、皮下、皮内或局部给药。所用载体介质包括（但并不限于）：生理盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明丹参二萜醌有效部位可以被制成针剂形式， 例如用生理盐水或含有葡萄糖和其它辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊剂之类的药物，也可通过常规方法进行制备。药物如针剂溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。药物活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天1μg/kg体重～2000mg/kg体重。此外，本发明制备的丹参二萜醌有效部位还可以与其它抗肿瘤药物协同使用。 

当本发明丹参二萜醌有效部位被用做药物时，可将治疗有效剂量的丹参二萜醌有效部位施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少10μg/kg体重，而且在大多数情况下不超过50mg/kg体重，较佳的给药剂量约为10μg/kg体重～30mg/kg体重。具体剂量还应考虑给药方式、病人健康状况等因素，这些属熟练医师技能范畴以内。 

实施例2： 

本实施例中，取实施例1制备的丹参总二萜醌，约500mg，精密称定，用6mL上相及6mL下相溶解，用0.45μm微孔滤膜过滤，备用；按石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水体积比为12︰8︰13︰7配制一定体积的溶剂，充分振摇，静置过夜，分取上相及下相，使用前超声脱气5min备用；将上相首先泵入逆流色谱仪，流速：15mL/min，转速300r/min；泵入约350mL上相后，将转速调至1300r/min，进样，开始用流动相洗脱，流速为6mL/min，待红色流分流出管路后，开始收集流分，4mL收集一管，取6～11管，合并流分，减压回收溶剂，干燥，即得到丹参二萜醌有效部位，按此方法纯化得到丹参二萜醌有效部位得率及成分与实施例1得到的有效部位无差异。其余均与实施例1类同，本文不做赘述。 

实施例3： 

本实施例中，采用溶剂提取法对丹参提取，得到丹参总二萜醌。溶剂提取法，提取溶剂为水、醇中的一种或两种。溶剂提取法选用重量为丹参重量6～10倍量且质量浓度为95%的乙醇溶液， 在常温下渗漉提取，提取液浓缩，加水混悬，用等体积的有机萃取溶剂萃取。有机萃取溶剂包括石油醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯中的任意一种。溶剂提取法在常温下操作，能避免热敏性丹参二萜醌的损失；所述提取溶剂优先选用95%乙醇，该溶剂能将脂溶性的丹参二萜醌高效率地提取出来，且能避免其它水溶性杂质影响后续逆流色谱的分离；所述萃取溶剂包括石油醚，二氯甲烷，氯仿，乙酸乙酯；优先选用二氯甲烷，二氯甲烷对丹参总二萜醌具有较好的溶解能力，且能避免其它杂质被萃取出来，影响后续逆流色谱的分离。 

更具体地，取10kg干燥的丹参饮片，打粉，过10目筛，投入渗漉桶，用10倍量95%的乙醇进行渗漉提取，收集渗漉液，减压回收溶剂至无醇味，得到约672g稠浸膏，浸膏加1L水混悬，用等体积的二氯甲烷萃取，合并二氯甲烷萃取物，减压回收溶剂，蒸干，得到约148g红色浸膏。 

取制备得到的丹参总二萜醌，精密称定500mg，用6mL上相及6mL下相溶解，用0.45μm微孔滤膜过滤，备用；按正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水的体积比12︰8︰13︰7配制一定体积的溶剂，充分振摇，静置过夜，分取上相及下相，使用前超声5min；将上相首先泵入逆流色谱仪，流速：15mL/min，转速300r/min；泵入约350mL后，将转速调至1300r/min，进样，开始用流动相洗脱，流速为6mL/min，待红色流分流出管路后，立即开始收集流分，4mL收集一管，取6～11管，合并流分，减压回收溶剂，干燥，即得到丹参二萜醌有效部位。 

本实施例的其余与实施例1或2类同，本文不做赘述。 

实施例4： 

本实施例中，逆流色谱溶剂包括石油醚、乙酸乙酯、甲醇、水，其中石油醚、乙酸乙酯、甲醇、水的体积比为12:8:13:7。其余均与实施例1或2或3类同，本文不做赘述。 

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。 

尽管本文较多地使用了术语，但并不排除使用其它术语的可能性。使用这些术语仅仅是为了更方便地描述和解释本发明的本质；把它们解释成任何一种附加的限制都是与本发明精神相违背的。 

Claims (10)

1.一种丹参二萜醌有效部位逆流色谱制备方法，其特征在于，本制备方法包括下述步骤：

A、提取：以丹参为原料，采用超临界流体萃取法或溶剂提取法对丹参提取，得到丹参总二萜醌；

B、分离：将上述丹参总二萜醌进行高速逆流色谱半制备分离，收集富含隐丹参酮的流分，减压回收逆流色谱溶剂，干燥，得到丹参二萜醌有效部位。

2.根据权利要求1所述的丹参二萜醌有效部位逆流色谱制备方法，其特征在于，在上述的步骤A中，所述的丹参为中药丹参的根和/或根茎，且所述的丹参经打粉、过筛后，备用。

3.根据权利要求2所述的丹参二萜醌有效部位逆流色谱制备方法，其特征在于，所述的超临界流体萃取法溶媒为二氧化碳，夹带剂为无水乙醇，夹带剂体积分数为8～15%。

4.根据权利要求3所述的丹参二萜醌有效部位逆流色谱制备方法，其特征在于，所述的超临界流体萃取法，丹参经打粉后过10目筛，用二氧化碳超临界流体萃取，萃取压力为25MPa，萃取温度为55℃，萃取2h，每小时加500mL无水乙醇作为夹带剂，分离釜温度为35℃。

5.根据权利要求2所述的丹参二萜醌有效部位逆流色谱制备方法，其特征在于，所述的溶剂提取法选用重量为丹参重量6～10倍量且质量浓度为95%的乙醇溶液，在常温下渗漉提取，提取液浓缩，加水混悬，用等体积的有机萃取溶剂萃取。

6.根据权利要求5所述的丹参二萜醌有效部位逆流色谱制备方法，其特征在于，所述的有机萃取溶剂包括石油醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯中的任意一种。

7.根据权利要求1或2或3或4或5或6所述的丹参二萜醌有效部位逆流色谱制备方法，其特征在于，所述的逆流色谱溶剂包括正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水；或者所述的逆流色谱溶剂包括石油醚、乙酸乙酯、甲醇、水；其中上述逆流色谱溶剂的下相为流动相，采用反相色谱模式。

8.根据权利要求7所述的丹参二萜醌有效部位逆流色谱制备方法，其特征在于，所述的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的体积比为12:8:13:7；所述的石油醚、乙酸乙酯、甲醇、水的体积比为12:8:13:7。

9.根据权利要求1-8中任意一项所述的丹参二萜醌有效部位逆流色谱制备方法制得的丹参二萜醌有效部位，其特征在于，所述的丹参二萜醌有效部位的隐丹参酮面积归一化法含量为65～75%，余量为其他丹参二萜醌类成分。

10.根据权利要求1-8中任意一项所述的丹参二萜醌有效部位逆流色谱制备方法制得的丹参二萜醌有效部位作为治疗癌症药物的应用。

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