CN105384784A - 青海栽培何首乌中三种抗氧化活性芪多酚类物质的筛选、分离制备方法 - Google Patents

青海栽培何首乌中三种抗氧化活性芪多酚类物质的筛选、分离制备方法 Download PDF

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Abstract

青海栽培何首乌中三种抗氧化活性芪多酚类物质的筛选、分离制备方法，包括以下步骤：将粉碎的何首乌的根部用酒精进行热回流提取，合并得提取液；提取液经减压蒸干至恒重，得何首乌提取物；何首乌提取物用去离子水溶解后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到四部分萃取物；萃取物用甲醇溶解后，采用在线抗氧化筛选法筛选出正丁醇萃取物中有三种抗氧化活性成分；正丁醇萃取物溶于水并上AB-8大孔树脂柱洗脱得到含有芪多酚类物质的洗脱液；洗脱液蒸干至恒重得芪多酚粗提物；芪多酚粗提物采用高速逆流色谱设备，在氯仿-正丁醇-甲醇-水体系中进行分离，即可分别得到反式白藜芦醇-3-0-葡萄糖苷、pieceid-2"-0-gallate和反式白藜芦醇。本发明简便、快速、有效、成本低廉。

Description

青海栽培何首乌中三种抗氧化活性芪多酚类物质的筛选、分离制备方法
一、技术领域
本发明属于中药植物化学领域，具体涉及青海栽培何首乌中三种抗氧化活性芪多酚类物质的筛选、分离制备方法。
二、背景技术
何首乌为蓼科植物何首乌(PoLygonummultifLorum)的干燥根及根茎,为常用中药。其性微温,味苦、甘、涩。生山谷灌丛、山坡林下、沟边石隙。产陕西南部、甘肃南部、华东、华中、华南、四川、云南及贵州。其块根入药，可安神、养血、活络，解毒(截疟)、消痈；有抗衰老,提高机体非特异性免疫功能；降血脂及抗动脉粥样硬化作用；心肌保护作用；保肝作用；神经保护作用,抗菌等作用。近年来,该属植物的药用价值逐渐引起研究者的重视，其中芪多酚类是该属的特征性化合物，具有较高的药用价值。
白藜芦醇类芪多酚是一种生物性很强的天然多酚类物质，是肿瘤的化学预防剂，可降低血液粘稠度，抑制血小板凝结和血管舒张，保持血液畅通，具有抗动脉粥样硬化和冠心病，缺血性心脏病，高血脂的防治作用。抑制肿瘤的作用此外还具有雌激素样作用，可用于治疗乳腺癌等疾病。
基于HPLC技术的高分辨筛选(high-resolutionscreening，HRS)是目前刚刚兴起的一种在线活性筛选技术，主要应用在抗氧化活性筛选中。其原理是：所进样品先经HPLC色谱柱分离，分离的成分先流经第一个检测器后，作为样品与第二个泵中作为流动相泵入的活性反应溶液(DPPH自由基溶液)在反应池中衍生；由于具有抗氧化作用的成分与DPPH自由基反应，从而使处于第二个检测器中在515nm处进行基线运行的信号下降最终导致倒峰的出现，后将第一个检测器和第二个检测器所记录的色谱图进行比对，即可筛选出提取物中的抗氧化成分。
高速逆流色谱(High-speedCountercurrentChromatography，简称HSCCC)是不使用固态支撑体或载体的液液分配色谱技术，具有应用范围广，适应性好；操作简便，回收率高；重现性好；分离效率高，分离量较大的优点，已被广泛应用于天然药物成分的分析鉴定及分离制备。与其它柱色谱相比较，它克服了固定相载体带来的样品吸附、损失、污染和峰形拖尾等缺点。
中国专利(101195712A)介绍了青海栽培何首乌天然黄色素的提取方法。有文献报道采用硅胶、SephadexLH2o及ODS多种柱色谱对青海栽培何首乌中的化合物进行分离，通过理化和波谱分析方法鉴定其结构，采用最低抑菌浓度(MIC)对青海栽培何首乌不同提取部位和单体化舍物进行抑茵活性筛选，分离得到l3个化舍物，分别为大黄素-6-甲醚(1)、大黄素(2)、6-羟基芦荟大黄素(3)、大黄素-8-β-D-葡萄糖苷(4)、大黄素-6-甲醚-8-β-D-葡萄糖苷(5)、白藜芦醇(6)、白藜芦醇苷(7)、白藜芦醇-3-O-β-D-(2""-O-肉桂酰)葡萄糖苷(8)、白藜芦醇-3-O-β-D-(2""-O-没食子酰)葡萄糖苷(9)、决明酮-8-O-β-D-葡萄糖苷(10)、6-hydroxymusizin-8-O-β-D-glucopyranoside(11)、β-谷甾醇(12)和胡萝卜苷(13)(戚欢阳,张朝凤.青海栽培何首乌化学成分及抑菌活性的研究.中国药学杂志,2005,40(11)；819-822)。
传统植物化学研究方法分离制备抗氧化活性物质，首先要进行离线筛选，然后将活性部位进行硅胶和凝胶层析制备分离纯化，需要耗费很长时间，且需要大量的有机溶剂和需要多步分离，回收率较低，成本较高。因此，寻找更有效的方法从植物中分离纯化抗氧化活性物质是非常必要的。
三、发明内容
本发明目的在于提供一种青海栽培何首乌中三种抗氧化活性芪多酚类物质的筛选、分离制备方法，采用在线抗氧化活性筛选结合高速逆流色谱从青海栽培何首乌中成功制备分离出反式白藜芦醇-3-O-葡萄糖苷、pieceid-2″-O-gallate和反式白藜芦醇三种具有抗氧化活性的芪多酚单体化合物，以解决现有技术中的问题。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
青海栽培何首乌中三种抗氧化活性芪多酚类物质的筛选、分离制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)选取青海栽培何首乌的根部将其粉碎，采用质量浓度为45％-75％的酒精在50-80℃下进行热回流提取，提取2-4次、每次2-4h，合并得到提取液；
(2)将所述提取液在温度为50-70℃、压力为0.05-0.08MPa的条件下经减压蒸干至恒重，即得青海栽培何首乌提取物；
(3)将所述青海栽培何首乌提取物先用去离子水溶解，再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3-5次，得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取液和残余水液四部分；四份萃取液在温度为50-70℃、压力为0.06-0.08MPa的条件下经减压蒸干至恒重，即得四份萃取物；
(4)将步骤(3)所述四份萃取物甲醇溶解后，采用在线抗氧化筛选的方法，所进样品先经HPLC色谱柱分离，分离的成分先流经第一个检测器后，作为样品与第二个泵中作为流动相泵入的活性反应溶液(DPPH自由基溶液)在反应池中衍生；第二个检测器在515nm处检测倒峰，后将第一个检测器和第二个检测器所记录的色谱图进行比对，结果发现正丁醇部分存在明显的三个抗氧化活性成分。
(5)将所述正丁醇萃取物溶于其质量20-30倍的水中，并上AB-8大孔树脂柱，用2-4倍柱床体积、质量浓度为30-40％乙醇水溶液洗脱，得到含有三种抗氧化活性芪多酚类物质的洗脱液；
(6)所述含有三种抗氧化活性芪多酚类物质的洗脱液在温度为55-65℃、压力为0.06-0.08MPa的条件下蒸干至恒重，即得芪多酚粗提物；
(7)所述芪多酚粗提物采用高速逆流色谱设备，在氯仿-正丁醇-甲醇-水体系中以转速为800-1000r/min、流速为1.0-2.0mL/min、温度为25-35℃的条件对其进行分离，即可分别得到纯度≥98.1％的反式白藜芦醇-3-O-葡萄糖苷、纯度≥94.9％的pieceid-2″-O-gallate、纯度≥98.8％的反式白藜芦醇。
优选的，所述步骤(4)中高效液相色谱检测方法是指流动相A为甲醇，流动相B体积浓度为0.1％的乙酸水溶液；流速为0.6-1.2mL/min，流动相条件为：35％A-43％A、65％B-57％B等度洗脱，第一个检测器检测波长为270nm，第二个检测器检测波长为510nm。
优选的，所述步骤(7)中氯仿-正丁醇-甲醇-水体系的比例为：3-6:1:2-5:1-2。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明采用DPPH-HPLC在线抗氧化筛选方法筛选青海栽培何首乌中抗氧化成分，而该法具有所用试剂量少、高通量检测、自动化程度高、检测时间短、灵敏度和特异性较高等特点，适宜筛选青海栽培何首乌中抗氧化成分，从而有利于青海栽培何首乌中的抗氧化活性成分的进一步分析纯化。
2、本发明采用高速逆流色谱(HSCCC)分离技术分离纯化青海栽培何首乌中的抗氧化活性成分，与传统柱色谱分离技术相比，不但有效地缩短了分离时间，而且减少了工艺过程中的有机溶剂消耗和能耗。
3、本发明将在线抗氧化筛选与HSCCC分离技术相结合，该方法简单、快速、有效地筛选、分离纯化样品中的抗氧化活性成分。
4、本发明一次分离可以同时得到的三种高纯度芪多酚类单体化合物、性质稳定，纯度高(可达到94％以上)，可应用于医药、标准物质、保健食品等领域。
5、本发明重现性好、有机试剂消耗量小、成本低廉，适合工业化生产。
四、附图说明
图1为青海栽培何首乌提取物高效液相色谱图。
图2为青海栽培何首乌提取物高速逆流色谱图。
图中：I反式白藜芦醇-3-O-葡萄糖苷、IIpieceid-2"-O-gallate、III反式白藜芦醇。
五、具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：
青海栽培何首乌中三种抗氧化活性芪多酚类物质的筛选、分离制备方法，包括以下步骤：
(1)选取青海栽培何首乌的根部将其粉碎，采用质量浓度为75％的酒精在80℃下进行热回流提取，提取3次、每次3h，合并得到提取液；
(2)将所述提取液在温度为70℃、压力为0.07MPa的条件下经减压蒸干至恒重，即得青海栽培何首乌提取物；
(3)将所述青海栽培何首乌提取物先用去离子水溶解，再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取5次，得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取液和残余水液四部分；四份萃取液在温度为60℃、压力为0.08MPa的条件下经减压蒸干至恒重，即得四份萃取物；
(4)将步骤(3)所述四份萃取物用甲醇溶解后，采用在线抗氧化筛选的方法，所进样品先经HPLC色谱柱分离，分离的成分先流经第一个检测器后，作为样品与第二个泵中作为流动相泵入的活性反应溶液(DPPH自由基溶液)在反应池中衍生；第二个检测器在515nm处检测倒峰，后将第一个检测器和第二个检测器所记录的色谱图进行比对，结果发现正丁醇部分存在明显的三个抗氧化活性成分。其中：流动相A为甲醇，流动相B体积浓度为0.1％的乙酸水溶液；流速为1.0mL/min，流动相条件为：40％A、60％B等度洗脱，第一个检测器检测波长为270nm，第二个检测器检测波长为510nm。
(5)将所述正丁醇萃取物溶于其质量30倍的水中，并上AB-8大孔树脂柱，用3倍柱床体积、质量浓度为40％乙醇水溶液洗脱，得到含有三种抗氧化活性芪多酚类物质的洗脱液；
(6)所述含有三种抗氧化活性芪多酚类物质的洗脱液在温度为65℃、压力为0.07MPa的条件下蒸干至恒重，即得芪多酚粗提物；
(7)所述芪多酚粗提物采用高速逆流色谱设备，在氯仿-正丁醇-甲醇-水体系中以转速为900r/min、流速为2.0mL/min、温度为30℃的条件对其进行分离，即可分别得到纯度为98.1％的反式白藜芦醇-3-O-葡萄糖苷、纯度为95.5％的pieceid-2″-O-gallate、纯度为99.1％的反式白藜芦醇。其中：氯仿-正丁醇-甲醇-水体系的比例为：4:1:2:1。
反式白藜芦醇-3-O-葡萄糖苷、pieceid-2″-O-gallate和反式白藜芦醇的核磁共振解析如下：
反式白藜芦醇-3-O-葡萄糖苷：1H-NMR(CD3OD,400MHz):δ＝7.35(2H,d,J＝8.5Hz,H-2',H-6'),7.00(lH,d,J＝16.3Hz,H-8),6.84(lH,d,H-7),6.78(1H,s,H-2),6.76(2H,d,H-3',H-5'),6.61(1H,s,H-6),6.44(1H,s,H-4),4.88(1H,d,J＝7.1Hz,GlcH-1"),3.92(1H,dd,J＝1.5Hz,J＝12Hz,GlcH-6a"),3.70(1H,dd,J＝5.8Hz,GlcH-6b"),3.48-3.38(4H,m,GlcH-2",H-3",H-4",H-5").13C-NMR(400MHz,CD3OD):δ＝141.4(C-1),107.0(C-2),160.5(C-3),104.1(C-4),159.6(C-5),108.4(C-6),126.7(C-7),130.0(C-8),130.3(C-1'),128.9(C-2'),116.5(C-3'),158.5(C-4'),116.5(C-5'),128.9(C-6'),102.4(Glc-1),75.0(Glc-2),78.1(Glc-3),71.5(Glc-4),78.3(Glc-5)and62.6(Glc-6)。
pieceid-2"-O-gallate：1H-NMR(CD3OD,400MHz):δ＝7.39(2H,d,J＝8.5Hz,H-2',H-6'),7.16(2H,d,J＝8.5Hz,H-2”',H-6”'),7.03(lH,d,J＝16.3Hz,H-8),6.85(lH,d,H-7),6.82(2H,d,H-3',H-5'),6.70(1H,s,H-2),6.65(1H,s,H-6),6.38(1H,s,H-4),5.14(1H,d,J＝7.9Hz,GlcH-1"),4.02(1H,dd,J＝11.4Hz,GlcH-6a"),3.70(1H,m,GlcH-6b"),5.14-3.45(4H,m,GlcH-2",H-3",H-4".H-5").13C-NMR(400MHz,CD3OD):δ＝139.9(C-1),109.0(C-2),160.5(C-3),104.1(C-4),159.6(C-5),107.4(C-6),126.7(C-7),130.0(C-8),130.3(C-1'),128.9(C-2'),116.5(C-3'),158.5(C-4'),116.5(C-5'),128.9(C-6'),102.4(Glc-1),78.4(Glc-2),76.1(Glc-3),71.5(Glc-4),75.4(Glc-5),62.6(Glc-6),121.3(C-1”'),109.9(C-2”'),146.5(C-3”'),141.5(C-4”'),146.5(C-5”'),109.9(C-6”')and167.8(C-7”')。
反式白藜芦醇：1H-NMR(CD3OD,400MHz):δ＝7.33(2H,d,J＝8.5Hz,H-2',H-6'),6.96(lH,d,J＝16.3Hz,H-8),6.81(lH,d,H-7),6.75(2H,d,H-3',H-5'),6.45(2H,s,H-2,H-6),6.17(1H,s,H-4).13C-NMR(CD3OD,400MHz):δ＝141.3(C-1),105.7(C-2),159.6(C-3),102.6(C-4),158.3(C-5),105.7(C-6),126.9(C-7),129.4(C-8),130.4(C-1'),128.8(C-2'),116.5(C-3'),158.5(C-4'),116.5(C-5'),128.8(C-6')。
实施例二：
青海栽培何首乌中三种抗氧化活性芪多酚类物质的筛选、分离制备方法，包括以下步骤：
(1)选取青海栽培何首乌的根部将其粉碎，采用质量浓度为60％的酒精在70℃下进行热回流提取，提取4次、每次2h，合并得到提取液；
(2)将所述提取液在温度为70℃、压力为0.06MPa的条件下经减压蒸干至恒重，即得青海栽培何首乌提取物；
(3)将所述青海栽培何首乌提取物先用去离子水溶解，再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取液和残余水液四部分；四份萃取液在温度为70℃、压力为0.07MPa的条件下经减压蒸干至恒重，即得四份萃取物；
(4)将步骤(3)所述四份萃取物用甲醇溶解后，采用在线抗氧化筛选的方法，所进样品先经HPLC色谱柱分离，分离的成分先流经第一个检测器后，作为样品与第二个泵中作为流动相泵入的活性反应溶液(DPPH自由基溶液)在反应池中衍生；第二个检测器在515nm处检测倒峰，后将第一个检测器和第二个检测器所记录的色谱图进行比对，结果发现正丁醇部分存在明显的三个抗氧化活性成分。其中：流动相A为甲醇，流动相B体积浓度为0.1％的乙酸水溶液；流速为0.8mL/min，流动相条件为：35％A、65％B等度洗脱，第一个检测器检测波长为270nm，第二个检测器检测波长为510nm。
(5)将所述正丁醇萃取物溶于其质量20倍的水中，并上AB-8大孔树脂柱，用3倍柱床体积、质量浓度为35％乙醇水溶液洗脱，得到含有三种抗氧化活性芪多酚类物质的洗脱液；
(6)所述含有三种抗氧化活性芪多酚类物质的洗脱液在温度为60℃、压力为0.07MPa的条件下蒸干至恒重，即得芪多酚粗提物；
(7)所述芪多酚粗提物采用高速逆流色谱设备，在氯仿-正丁醇-甲醇-水体系中以转速为850r/min、流速为1.8mL/min、温度为35℃的条件对其进行分离，即可分别得到纯度为98.9％的反式白藜芦醇-3-O-葡萄糖苷、纯度为94.9％的pieceid-2″-O-gallate、纯度为99.4％的反式白藜芦醇。其中氯仿-正丁醇-甲醇-水体系的比例为：5:1:3:1。
实施例三：
青海栽培何首乌中三种抗氧化活性芪多酚类物质的筛选、分离制备方法，包括以下步骤：
(1)选取青海栽培何首乌的根部将其粉碎，采用质量浓度为50％的酒精在60℃下进行热回流提取，提取2次、每次4h，合并得到提取液；
(2)将所述提取液在温度为60℃、压力为0.08MPa的条件下经减压蒸干至恒重，即得青海栽培何首乌提取物；
(3)将所述青海栽培何首乌提取物先用去离子水溶解，再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取4次，得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取液和残余水液四部分；四份萃取液在温度为70℃、压力为0.06MPa的条件下经减压蒸干至恒重，即得四份萃取物；
(4)将步骤(3)所述四份萃取物用甲醇溶解后，采用在线抗氧化筛选的方法，所进样品先经HPLC色谱柱分离，分离的成分先流经第一个检测器后，作为样品与第二个泵中作为流动相泵入的活性反应溶液(DPPH自由基溶液)在反应池中衍生；第二个检测器在515nm处检测倒峰，后将第一个检测器和第二个检测器所记录的色谱图进行比对，结果发现正丁醇部分存在明显的三个抗氧化活性成分。其中：流动相A为甲醇，流动相B体积浓度为0.1％的乙酸水溶液；流速为1.2mL/min，流动相条件为：42％A、68％B等度洗脱，第一个检测器检测波长为270nm，第二个检测器检测波长为510nm。
(5)将所述正丁醇萃取物溶于其质量25倍的水中，并上AB-8大孔树脂柱，用3倍柱床体积、质量浓度为30％乙醇水溶液洗脱，得到含有三种抗氧化活性芪多酚类物质的洗脱液；
(6)所述含有三种抗氧化活性芪多酚类物质的洗脱液在温度为65℃、压力为0.07MPa的条件下蒸干至恒重，即得芪多酚粗提物；
(7)所述芪多酚粗提物采用高速逆流色谱设备，在氯仿-正丁醇-甲醇-水体系中以转速为950r/min、流速为1.5mL/min、温度为25℃的条件对其进行分离，即可分别得到纯度为98.5％的反式白藜芦醇-3-O-葡萄糖苷、纯度为97.2％的pieceid-2″-O-gallate、纯度为99.4％的反式白藜芦醇。其中氯仿-正丁醇-甲醇-水体系的比例为：6:1:2:1。
实施例四：
青海栽培何首乌中三种抗氧化活性芪多酚类物质的筛选、分离制备方法，包括以下步骤：
(1)选取青海栽培何首乌的根部将其粉碎，采用质量浓度为45％的酒精在75℃下进行热回流提取，提取3次、每次3h，合并得到提取液；
(2)将所述提取液在温度为70℃、压力为0.06MPa的条件下经减压蒸干至恒重，即得青海栽培何首乌提取物；
(3)将所述青海栽培何首乌提取物先用去离子水溶解，再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取4次，得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取液和残余水液四部分；四份萃取液在温度为65℃、压力为0.07MPa的条件下经减压蒸干至恒重，即得四份萃取物；
(4)将步骤(3)所述四份萃取物用甲醇溶解后，采用在线抗氧化筛选的方法，所进样品先经HPLC色谱柱分离，分离的成分先流经第一个检测器后，作为样品与第二个泵中作为流动相泵入的活性反应溶液(DPPH自由基溶液)在反应池中衍生；第二个检测器在515nm处检测倒峰，后将第一个检测器和第二个检测器所记录的色谱图进行比对，结果发现正丁醇部分存在明显的三个抗氧化活性成分。其中：流动相A为甲醇，流动相B体积浓度为0.1％的乙酸水溶液；流速为1.0mL/min，流动相条件为：38％A、62％B等度洗脱，第一个检测器检测波长为270nm，第二个检测器检测波长为510nm。
(5)将所述正丁醇萃取物溶于其质量28倍的水中，并上AB-8大孔树脂柱，用4倍柱床体积、质量浓度为35％乙醇水溶液洗脱，得到含有三种抗氧化活性芪多酚类物质的洗脱液；
(6)所述含有三种抗氧化活性芪多酚类物质的洗脱液在温度为65℃、压力为0.06MPa的条件下蒸干至恒重，即得芪多酚粗提物；
(7)：所述芪多酚粗提物采用高速逆流色谱设备，在氯仿-正丁醇-甲醇-水体系中以转速为800r/min、流速为2.0mL/min、温度为30℃的条件对其进行分离，即可分别得到纯度为98.7％的反式白藜芦醇-3-O-葡萄糖苷、纯度为97.9％的pieceid-2″-O-gallate、纯度为99.5％的反式白藜芦醇。其中氯仿-正丁醇-甲醇-水体系的比例为：4:1:4:2。
实施例五：
青海栽培何首乌中三种抗氧化活性芪多酚类物质的筛选、分离制备方法，包括以下步骤：
(1)选取青海栽培何首乌的根部将其粉碎，采用质量浓度为55％的酒精在55℃下进行热回流提取，提取2次、每次3h，合并得到提取液；
(2)将所述提取液在温度为0℃、压力为0.07MPa的条件下经减压蒸干至恒重，即得青海栽培何首乌提取物；
(3)将所述青海栽培何首乌提取物先用去离子水溶解，再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取4次，得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取液和残余水液四部分；四份萃取液在温度为60℃、压力为0.07MPa的条件下经减压蒸干至恒重，即得四份萃取物；
(4)将步骤(3)所述四份萃取物用甲醇溶解后，采用在线抗氧化筛选的方法，所进样品先经HPLC色谱柱分离，分离的成分先流经第一个检测器后，作为样品与第二个泵中作为流动相泵入的活性反应溶液(DPPH自由基溶液)在反应池中衍生；第二个检测器在515nm处检测倒峰，后将第一个检测器和第二个检测器所记录的色谱图进行比对，结果发现正丁醇部分存在明显的三个抗氧化活性成分。其中：流动相A为甲醇，流动相B体积浓度为0.1％的乙酸水溶液；流速为1.0mL/min，流动相条件为：43％A、57％B等度洗脱，第一个检测器检测波长为270nm，第二个检测器检测波长为510nm。
(5)将所述正丁醇萃取物溶于其质量25倍的水中，并上AB-8大孔树脂柱，用2倍柱床体积、质量浓度为40％乙醇水溶液洗脱，得到含有三种抗氧化活性芪多酚类物质的洗脱液；
(6)所述含有三种抗氧化活性芪多酚类物质的洗脱液在温度为65℃、压力为0.06MPa的条件下蒸干至恒重，即得芪多酚粗提物；
(7)所述芪多酚粗提物采用高速逆流色谱设备，在氯仿-正丁醇-甲醇-水体系中以转速为880r/min、流速为1.0mL/min、温度为30℃的条件对其进行分离，即可分别得到纯度为98.1％的反式白藜芦醇-3-O-葡萄糖苷、纯度为98.3％的pieceid-2″-O-gallate、纯度为99.4％的反式白藜芦醇。中氯仿-正丁醇-甲醇-水体系的比例为：5:1:3:1。
尽管已经示出和描述了发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同方案限定。

Claims (5)

1.青海栽培何首乌中三种抗氧化活性芪多酚类物质的筛选、分离制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)选取青海栽培何首乌的根部将其粉碎，采用质量浓度为45％-75％的酒精在50-80℃下进行热回流提取，提取2-4次、每次2-4h，合并得到提取液；
(2)将所述提取液在温度为50-70℃、压力为0.05-0.08MPa的条件下经减压蒸干至恒重，即得青海栽培何首乌提取物；
(3)将所述青海栽培何首乌提取物先用去离子水溶解，再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3-5次，得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取液和残余水液四部分；四份萃取液在温度为50-70℃、压力为0.06-0.08MPa的条件下经减压蒸干至恒重，即得四份萃取物；
(4)将步骤(3)所述四份萃取物甲醇溶解后，采用在线抗氧化筛选的方法，所进样品先经HPLC色谱柱分离，分离的成分先流经第一个检测器后，作为样品与第二个泵中作为流动相泵入的活性反应溶液(DPPH自由基溶液)在反应池中衍生；第二个检测器在515nm处检测倒峰，后将第一个检测器和第二个检测器所记录的色谱图进行比对，结果发现正丁醇部分存在明显的三个抗氧化活性成分。
(5)将所述正丁醇萃取物溶于其质量20-30倍的水中，并上AB-8大孔树脂柱，用2-4倍柱床体积、质量浓度为30-40％乙醇水溶液洗脱，得到含有三种抗氧化活性芪多酚类物质的洗脱液；
(6)所述含有三种抗氧化活性芪多酚类物质的洗脱液在温度为55-65℃、压力为0.06-0.08MPa的条件下蒸干至恒重，即得芪多酚粗提物；
(7)所述芪多酚粗提物采用高速逆流色谱设备，在氯仿-正丁醇-甲醇-水体系中以转速为800-1000r/min、流速为1.0-2.0mL/min、温度为25-35℃的条件对其进行分离，即可分别得到纯度≥98.1％的反式白藜芦醇-3-O-葡萄糖苷、纯度≥94.9％的pieceid-2″-O-gallate、纯度≥98.8％的反式白藜芦醇。
2.如权利要求1所述的青海栽培何首乌中三种抗氧化活性芪多酚类物质的筛选、分离制备方法，其特征在于,所述步骤(4)中高效液相色谱检测方法是指流动相A为甲醇，流动相B体积浓度为0.1％的乙酸水溶液；流速为0.6-1.2mL/min，流动相条件为：35％A-43％A、65％B-57％B等度洗脱，第一个检测器检测波长为270nm，第二个检测器检测波长为510nm。
3.如权利要求1所述的青海栽培何首乌中三种抗氧化活性芪多酚类物质的筛选、分离制备方法，其特征在于,所述步骤(7)中氯仿-正丁醇-甲醇-水体系的比例为：3-6:1:2-5:1-2。
4.如权利要求1所述的青海栽培何首乌中三种抗氧化活性芪多酚类物质的筛选、分离制备方法，其特征在于,所述步骤(7)中氯仿-正丁醇-甲醇-水体系中以转速为950r/min、流速为1.5mL/min、温度为25℃进行分离。
5.如权利要求1所述的青海栽培何首乌中三种抗氧化活性芪多酚类物质的筛选、分离制备方法，其特征在于,所述步骤(7)中氯仿-正丁醇-甲醇-水体系的比例为：4:1:2:1。
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