CN104861019B - 高速逆流色谱制备油茶籽壳中黄酮类化合物1、2的方法 - Google Patents

高速逆流色谱制备油茶籽壳中黄酮类化合物1、2的方法 Download PDF

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Abstract

一种高速逆流色谱制备油茶籽壳中黄酮类化合物1、2的方法，该方法以油茶籽壳为原料，粉碎后经乙醇提取，收集提取液，用D‑101大孔吸附树脂纯化后，以水：正丁醇：甲基叔丁基醚：乙腈：冰乙酸为6：3：1：1：0.001(体积比)作为高速逆流溶剂体系，对油茶籽壳提取物进行高速逆流色谱分离，制得2个黄酮类化合物。本方法简便，重现性好，可用于化合物大量制备，为进一步活性研究奠定了物质基础。

Description

高速逆流色谱制备油茶籽壳中黄酮类化合物1、2的方法
技术领域
本发明涉及一种黄酮类化合物的制备方法，具体涉及一种以高速逆流色谱法从油茶籽壳中分离制备黄酮类化合物1、2的方法。
背景技术
油茶(Camellia oleifera)属山茶科山茶属，种子可榨油供食用，茶籽壳即为外种皮，种皮含较多色素呈棕黑色，且较坚硬，占茶果重的30.6％-34.0％。油茶树是我国主要的木本油料树种之一，每年产油150万吨，茶籽壳为茶籽榨油后的副产物，是茶籽榨油前除去的种皮，其利用率却相对较低。研究表明，茶籽壳中富含茶皂素、黄酮、多糖、多酚、原花青素等成分，若能将茶籽壳加以有效利用，必将产生巨大的经济效益。
现代研究表明，黄酮类化合物具有抗氧化、抗癌、抗心脑血管疾病、抗炎、抗病毒、免疫调节等多种生理功能及药理作用，其提取物可用于食品、药品、化妆品等产品中。因此充分开发利用油茶籽壳中的黄酮类化合物具有十分重要的现实意义，不仅可解决废物污染环境的问题，还可提高油茶的经济效益。
高速逆流色谱法是一种新型的、连续高效的液液分配色谱技术，已在生物、医药、食品、材料等领域得到广泛的应用，尤其是在天然产物活性成分的分离纯化领域倍受重视，但以该高速逆流色谱法从油茶籽壳中分离制备黄酮类化合物的方法尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种高速逆流色谱制备油茶籽壳中黄酮类化合物1、2的方法。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种高速逆流色谱制备油茶籽壳中黄酮类化合物的方法1、2，该方法步骤如下：
A.油茶籽壳提取物的制备：取油茶籽壳粉，用为油茶籽壳粉6-12倍重量的50-70％质量浓度的乙醇提取，收集提取液，过滤，减压浓缩回收乙醇后通过装有D-101大孔吸附树脂的层析柱以2-3BV/h流速进行吸附，吸附后静置30min-60min，先用3-4BV的水以4-6BV/h的流速淋洗，然后用4-6BV质量浓度为10％的乙醇水溶液以2-4BV/h的流速洗脱，再用30％质量浓度的乙醇水溶液以2-4BV/h的流速洗脱至无色，收集30％质量浓度的乙醇洗脱液，浓缩后冷冻干燥，得油茶籽壳提取物；
上述油茶籽壳粉是取油茶籽壳，粉碎过10目筛得到。
上述步骤A中乙醇提取时的温度为50-60℃，提取次数为3次，每次提取时间为0.5-1h。
B.高速逆流色谱法分离：按体积比以水：正丁醇：甲基叔丁基醚：乙腈：冰乙酸为6：3：1：1：0.001作为两相溶剂体系，充分混合后静置过夜，两相分离后超声脱气，上相作固定相，下相作流动相；在流速2mL/min、主机转速850rpm/min，分离温度20℃，检测波长280nm，上样量300mg的条件下，将上述制得的油茶籽壳提取物进行HSCCC分离，根据峰形分段收集流出液，将收集的流出液旋转蒸发浓缩后冷冻干燥，得粉末状化合物1和化合物2，其结构分别如下：
本发明以油茶籽壳为原料，其油茶籽壳提取物经大孔吸附树脂纯化后，采用高速逆流色谱法分离得到2个高纯度的黄酮类化合物，经质谱和核磁共振鉴定其结构，分别为山奈酚-3-O-[β-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖-(1→6)-β-D-吡喃葡糖苷]、和山奈酚-3-O-[β-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-L-阿拉伯糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡糖苷]。本方法简便，重现性好，可用于化合物大量制备，为进一步活性研究奠定了物质基础。
附图说明
图1是油茶籽壳原料HPLC色谱图。
图2是HSCCC分离色谱图。
图3是化合物1HPLC检测图及UV图(254nm)。
图4是化合物2HPLC检测图及UV图(254nm)。
具体实施方式
实施例1油茶籽壳中黄酮类化合物的制备
本实施例中的油茶籽壳购于湖南省怀化市洪源农林开发有限公司。
1、高速逆流(HSCCC)上样原料(油茶籽壳提取物)的制备
取粉碎过10目筛的油茶籽壳粉200g，用为油茶籽壳粉6倍重量的70％质量浓度的乙醇在60℃下提取三次，第一次60min，后两次各30min，收集提取液，合并，过滤，55℃减压浓缩回收乙醇，得到的水层(提取液)通过装有300ml D-101大孔吸附树脂的层析柱以3BV/h的流速进行吸附，吸附后静置30min，先用900ml水以6BV/h的流速淋洗，然后用10％质量浓度的乙醇水溶洗脱900ml，流速3BV/h，再用30％质量浓度的乙醇水溶液洗脱900ml，流速3BV/h，收集30％质量浓度的乙醇洗脱液，浓缩后冷冻干燥，得油茶籽壳提取物，作为高速逆流上样原料。
2、HPLC检测方法
高效液相色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(5μm,4.6×250mm)，流动相A为0.1％的磷酸水溶液，B为乙腈。洗脱梯度为：90％的A和10％的B 35min之内变为68％的A和32％的B，维持此梯度10min。流速为1.0mL/min，DAD检测器，进样量为20μL，柱温:28℃。
取少量的上述制备的油茶籽壳提取物用甲醇溶解，过膜进样，HPLC谱图见图1，由图可见，油茶籽壳提取物中含有多个化学成分，含量相对较高的有两种化合物，是保留时间分别为17.561min化合物1和19.887min化合物2。两组分的紫外光谱显示，在280nm和350nm处有较大吸收，符合黄酮类化合物典型紫外吸收特征，初步确定为黄酮类化合物。
3、高速逆流色谱(HSCCC)分离
3.1溶剂系统的选择
通过对多个亲水性体系进行筛选，发现水-冰乙酸-正丁醇-甲基叔丁基甲醚-乙腈组成的体系K值较好。将该体系中不同溶剂按下表1中的比例配制，震摇后静置分层。移取3mL下相加入少量上述制备的油茶籽壳提取物样品，用HPLC测定样品中在下相中各目标峰的面积S萃前。再取等体积上相进行萃取，测定萃后下相中目标峰面积S萃后，按下式(1)计算出各组分的分配系数K。根据K值选择适合的溶剂体系作为HSCCC的固定相与流动相。最终实验采用溶剂体系2即以水-正丁醇-甲基叔丁基醚-乙腈-冰乙酸(6：3：1：1：0.001，V/V)作为溶剂体系上样操作。
式(1)：K＝(S萃前-S萃后)/S萃前
表1溶剂体系K值筛选表
3.2 HSCCC操作条件
高速逆流色谱柱：TBE-300A高速逆流色谱仪(上海同田生物技术有限公司)：配置有聚四氟乙烯柱，内径1.6mm，柱容积280mL，转速0-1000r/min，TBP-50A泵，TBD-2000UV检测器，LX-300恒温器。
按上述配置溶剂体系2000ml，充分混合，静置过夜，两相分离后超声脱气30min。上相作固定相，下相作流动相。考察了流动相流速、转速及上样量对分离效果的影响，最后选择流速2mL/min、主机转速850rpm/min，柱温箱20℃，波长280nm，在该条件下固定相的保留率为70％，上样量可达300mg，HSCCC分离图谱见图2，分别收集192-204min与214-230min的流出液，55℃旋转蒸发浓缩后冷冻干燥得5.67mg化合物1和7.14mg化合物2。
结合参见图3及图4，根据HPLC(分析条件同上)在254nm下的色谱图，采用峰面积归一法计算化合物纯度，化合物1纯度为99％，化合物2纯度为93％。
实施例2化合物的结构鉴定
采用质谱和核磁共振鉴定上述2个化合物的结构。
化合物1:淡黄色粉末，分子量756.21，分量式C33H40O20，根据1H和13C NMR数据，并结合文献，确定化合物为：山奈酚-3-O-[β-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖-(1→6)-β-D-吡喃葡糖苷]，其结构如下，NMR信号归属见表2。
表2化合物1核磁共振H谱与C谱归属表
化合物2：淡黄色粉末，分子量730.20，分量式C32H42O19，根据1H和13C NMR数据，并结合文献，确定化合物为：山奈酚-3-O-[β-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-L-阿拉伯糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡糖苷]，化合物结构如下，NMR信号归属见表3。
表3化合物2核磁共振H谱与C谱归属表

Claims (3)

1.一种高速逆流色谱制备油茶籽壳中黄酮类化合物1、2的方法，其特征在于，该方法步骤如下：
A.油茶籽壳提取物的制备：取油茶籽壳粉，用为油茶籽壳粉6-12倍重量的50-70％质量浓度的乙醇提取，收集提取液，过滤，减压浓缩回收乙醇后通过装有D-101大孔吸附树脂的层析柱以2-3BV/h流速进行吸附，吸附后静置30min-60min，先用3-4BV的水以4-6BV/h流速淋洗，然后用4-6BV质量浓度为10％的乙醇水溶液以2-4BV/h的流速洗脱，再用30％质量浓度的乙醇水溶液以2-4BV/h的流速洗脱至无色，收集30％质量浓度的乙醇洗脱液，浓缩后冷冻干燥，得油茶籽壳提取物；
B.高速逆流色谱法分离：按体积比以水：正丁醇：甲基叔丁基醚：乙腈：冰乙酸为6：3：1：1：0.001作为两相溶剂体系，充分混合后静置过夜，两相分离后超声脱气，上相作固定相，下相作流动相；在流速2mL/min、主机转速850rpm/min，分离温度20℃，检测波长280nm，上样量300mg的条件下，将上述制得的油茶籽壳提取物进行HSCCC分离，根据峰形分段收集流出液，将收集的流出液旋转蒸发浓缩后冷冻干燥，得粉末状化合物1和化合物2，其结构分别如下：
，
2.如权利要求1所述的高速逆流色谱制备油茶籽壳中黄酮类化合物1、2的方法，其特征在于，所述步骤A中乙醇提取时的温度为50-60℃，提取次数为3次，每次提取时间为0.5-1h。
3.如权利要求1所述的高速逆流色谱制备油茶籽壳中黄酮类化合物1、2的方法，其特征在于，所述步骤A中油茶籽壳粉的粒度为10目。
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