CN101574410A - 一种牡丹叶有效组分及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从牡丹叶中分离得到牡丹叶有效组分，主要包含有没食子酸和没食子酸乙酯，其中没食子酸的含量为35－70％，没食子酸乙酯的含量为15－30％。本发明还提供了采用大孔树脂纯化的方法制备得到牡丹叶有效组分，并提供了该有效组分的药物制剂。动物实验结果表明，该有效组分能有效防治心脑血管疾病，尤其具有防治冠心病及脑缺血性疾病的作用。
Description
技术领域
本发明属于中药新药研发领域。涉及一种从牡丹叶中分离得到有效组分，并提供其制备方法、制剂和医药用途。
背景技术
近年来，随着我国人口老年化及人们工作、生活、饮食结构及环境等变化，冠心病心绞痛、心肌梗塞、脑血栓，猝死等心脑血管疾病的发生率也逐年增多，并成为当今人类死亡率最高的三大疾病之一。因此，开发疗效好、毒副作用小的治疗药物具有较好的市场前景，同时也成为医药领域的研究热点。
牡丹皮为毛莨科芍药属植物牡丹(Paenoina Suffruticosa Andr.)的根皮，为我国传统中药，有清热凉血，活血化淤等功效。其药理作用广泛，包括抗心肌缺血、抗血栓、抗动脉粥样硬化、降血糖、抗肿瘤、镇痛、保肝等(文献1：马玉玲，刘建勋，孙卫，尚晓泓，李连达.牡丹皮对犬心肌缺血及心脏血流动力学影响的研究[J].山西医药杂志.1984年04期；文献2：龙世林，陈雅.牡丹皮药理作用及临床研究进展.2007年第16卷第3期)。但由于牡丹皮采收周期较长、不可再生。为了充分、有效利用牡丹资源，可选择牡丹叶作为药用部位。牡丹叶为毛茛科芍药属植物牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)的叶，收载于2002年版的山东省中药材标准，主要含量有酚酸类、鞣质、黄酮等。因牡丹叶资源丰富，可再生，故具有较好的开发前景。目前对牡丹叶的研究报道较少。
发明内容
本发明要解决的技术问题是研发一种牡丹叶有效组分，用于防治心脑血管疾病。该有效组分中主要成分清楚，产品质量易于控制，重现性好，疗效稳定。
本发明还提供了牡丹叶有效组分的主要成分及其主要成分之间是否具有协同作用。
同时，本发明还提供了用于防治心脑血管疾病的牡丹叶有效组分的制备方法，及以牡丹叶有效组分作为活性成分的中药制剂。
为解决上述技术问题，本发明研究制定了如下技术方案。
一种牡丹叶有效组分，其特征在于主要包含没食子酸和没食子酸乙酯，其中没食子酸的含量为35-70％，没食子酸乙酯的含量为15-30％。
较优选牡丹叶有效组分，其特征在于没食子酸的含量在40-70％，没食子酸乙酯的含量为15-30％。
更优选牡丹叶有效组分，其特征在于没食子酸的含量在50-70％，没食子酸乙酯的含量为20-30％。
最优选牡丹叶有效组分，其特征在于没食子酸的含量在60-70％，没食子酸乙酯的含量为25-30％。
一种牡丹叶有效组分的制备方法，包括如下步骤：
(1)取牡丹叶，用水和/或低级醇提取，得提取液；
(2)将步骤(1)提取液直接上大孔吸附树脂柱，或者，将步骤(1)提取液浓缩后上大孔吸附树脂柱；
(3)依次用0-50％低级醇进行梯度洗脱；
(4)收集富含没食子酸及没食子酸乙酯的洗脱液，浓缩；
(5)用水和/或低级醇对富含没食子酸及没食子酸乙酯的浓缩液进行溶解，干燥，得牡丹叶有效组分，其中没食子酸含量为35-70％，没食子酸乙酯的含量为15-30％。
所述牡丹叶有效组分的制备方法中，提取或者梯度洗脱或者溶解时，所用低级醇是指碳数为C1-C5的直链或支链低级醇，所述低级醇优选为甲醇、乙醇、丙醇和/或正丁醇；水和低级醇是V/V混合，例如在100毫升水中加入一定毫升数的低级醇；再如梯度洗脱时，在100毫升水中逐渐增加低级醇的毫升数。步骤(1)提取中，优选水和低级醇混合比例为0-95％(例如，95％是按100毫升水中含低级醇95毫升计)；用回流、浸渍、渗漉或水煎方法提取。步骤(2)中大孔树脂为聚苯乙烯型、聚丙烯酸酯型或聚甲基丙烯酸酯型中的任意一种或几种为骨架材料的树脂。步骤(3)所述梯度洗脱是先用浓度为低于5％低级醇洗脱除去杂质，再用浓度为X的低级醇洗脱，收集富集没食子酸和没食子酸乙酯的洗脱液，浓缩，其中5％≤X≤50％。步骤(5)中所用低级醇的浓度为0-100％；选用减压、真空、冷冻或喷雾方法中的任意一种方法对富含没食子酸和没食子酸乙酯的溶液进行干燥，得牡丹叶有效组分。
上述制备方法中优选制备方法：提取或者梯度洗脱时，所用低级醇选自甲醇、乙醇、丙醇或正丁醇中的任意一种或它们的混合物；所述大孔树脂选自NKA-II、DA201或S-8；提取所用溶剂是30-90％乙醇；梯度洗脱是先用0-5％乙醇除去杂质，再用10％-30％乙醇洗脱；溶解所用溶剂是50-100％乙醇。
较优选的制备方法，其中提取所用溶剂是55-80％乙醇；梯度洗脱是先用0-5％乙醇除去杂质，再用10％-20％乙醇洗脱；溶解所用溶剂是60-100％乙醇。
通过优选制备方法得到优选牡丹叶有效组分，其中没食子酸的含量在40-70％，没食子酸乙酯的含量为15-30％；更优选牡丹叶有效组分，其中没食子酸的含量在50-70％，没食子酸乙酯的含量为20-30％；最优选牡丹叶有效组分，其中没食子酸的含量在60-70％，没食子酸乙酯的含量为25-30％。
本发明所用材料为毛茛科(Ranuncnlaceae)芍药属(Paeoniaceae)植物牡丹(Paeoniasuffruticosa Andr.)的新鲜或干燥叶，优选用干燥的牡丹叶。也可选用牡丹的其它部分，包括茎、根、皮、花等。
一种防治心脑血管疾病的药物组合物，是将前述任一种牡丹叶有效组分与药学上可接受的载体混合制成的药用制剂。所述药学上可接受载体包括常规制剂辅料，如淀粉、蔗糖、乳糖、糖粉、葡萄糖、甘露醇、木糖醇、聚乙二醇、异丙醇、土温-80、甘油、丙二醇、微晶纤维素钠、糊精、环糊精、氯化钠、维生素C、半胱氨酸、柠檬酸、硫代硫酸钠、亚硫酸钠、硬脂酸盐和明胶等常规辅料。也包括对本发明药效没有明显影响的抗氧化剂、氨基酸、维生素、碳水化合物或植物提取物。所述药用制剂为口服制剂，包括胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、口服液、片剂或滴丸等；或者为注射剂，包括冻干粉针剂和注射液等；或者为局部给药制剂，包括霜剂、软膏剂、贴剂、喷雾剂、皮下植入剂等。制剂的后期制备工艺均属制药领域的常规技术，本发明对此不作限定。
上述任一种牡丹叶有效组分及其药物制剂在制备防治心脑血管疾病中的应用，特别是在制备防治冠心病及脑缺血性疾病等药物中的应用。药效实验结果表明，牡丹叶有效组分中没食子酸和没食子酸乙酯具有协同作用，其防治心脑血管疾病的效果要好于没食子酸单独的作用效果。
本发明人采用了垂体后叶素所致的大鼠急性心肌缺血模型、心脏冠状动脉结扎所致的大鼠和Beagle犬急性心肌缺血模型等，以心电图表现、心肌缺血程度和范围、心肌缺血面积及心肌酶等作为观测指标，结果表明牡丹叶有效组分可明显改善缺血时心电图T波抬高，明显减轻心肌缺血程度，降低心肌缺血面积和血清心肌酶含量，提示其具有较好的防治心肌缺血性疾病的作用，且随牡丹叶有效组分给药剂量增加，其治疗效果也随之增强。
本发明人采用了大鼠大脑中动脉结扎所致的部分脑缺血模型以及沙土鼠四动脉结扎所致的全脑缺血模型，以神经生物学评分，脑缺血程度及范围为观测指标，结果发现牡丹叶有效组分给药后可明显改善大鼠神经生物行为，明显降低脑缺血程度及范围，提示其具有显著的改善脑缺血的作用，且随牡丹叶有效组分给药剂量增加，其治疗效果也随之增强。
本发明人经过多年的研究，用牡丹叶为原料，经过溶剂提取、大孔树脂吸附、溶剂洗脱、洗脱液浓缩，乙醇溶解，浓缩干燥得牡丹叶有效组分，其特征在于主要包含有没食子酸和没食子酸乙酯，其重量百分比为50％～100％，其中没食子酸含量为35-70％，没食子酸乙酯含量在15-30％。牡丹叶有效组分是从牡丹叶中分离得到，本领域普通技术人员能够理解，其中可能含有一些源于药材中的少量其它成分，但这些少量其它成分并不影响本发明药物组合物防治心脑血管病的效果；此处少量意味着按重量计不大于49％，较好的是不大于40％，更理想是不大于20％，最优选是不大于10％。
牡丹叶有效组分中主要成分没食子酸、没食子酸乙酯的结构式如下：
没食子酸(3，4，5-三羟基苯甲酸) 没食子酸乙酯(3，4，5-三羟基苯甲酸乙酯)
本发明采用大孔树脂技术富集牡丹叶有效组分，没食子酸和没食子酸乙酯含量较高，易于控制质量，可用于制备各种制剂，以达到疗效稳定的治疗效果。本发明牡丹叶有效组分灌胃给药小鼠的LD50为5g/Kg，药效学有效剂量为20mg/kg，根据实验推算，推荐人临床日用量为300mg/天。
由于采用了中药现代化技术中的树脂技术，制备工艺简单，成本低，适合工业化生产。
具体实施方式
本发明人通过以下实施例详细说明本发明技术方案的实施，但不应以此限定本发明的实施范围。
实施例1：牡丹叶有效组分的制备方法
1kg粉碎的牡丹叶药材，装入回流提取罐，以水回流提取，每次3h，共提取三次，合并提取液，直接吸附于NKA-II树脂，用0-50％乙醇连续梯度洗脱，用常规薄层层析跟踪检测洗脱液中没食子酸和没食子酸乙酯。先用0-5％乙醇洗脱除杂，收集后面10-50％乙醇洗脱液，浓缩，用60％乙醇加热回流3h后，得牡丹叶有效组分15g，其中没食子酸含量为51.6％，没食子酸乙酯含量为20.9％。
取上述牡丹叶有效组分，用高效液相色谱法测定其单体含量，其中色谱条件为：
高效液相色谱仪：JASCO PU-1580；色谱柱：RP-C18柱(250×4.6mm，5μm)；柱温：27.2℃；流速：1ml/min；进样量10μl；灵敏度：1.000AUFS。
1)没食子酸∶流动相∶甲醇-水-磷酸(10∶90∶0.2)；检测波长：273nm；
2)没食子酸乙酯∶流动相∶甲醇-水-磷酸(30∶70∶0.2)；检测波长：273nm；
实施例2：牡丹叶有效组分的制备方法
1kg粉碎的牡丹叶药材，以95％乙醇浸泡2h，装入渗漉桶，以95％乙醇渗漉，收集渗漉液30L，浓缩后以水溶解，直接吸附于DA201大孔树脂，以水除杂，20％乙醇解吸，收集解吸液，浓缩，真空干燥，50％乙醇煎煮1h，得牡丹叶有效组分20g，没食子酸含量可达41.5％，没食子酸乙酯含量可达28.9％。
实施例3：牡丹叶有效组分的制备方法
1kg粉碎的牡丹叶药材，以55％乙醇浸渍24h，收集浸渍液30L，浓缩后以5％乙醇溶解，直接吸附于S-8大孔树脂，5％乙醇除杂，25％乙醇除杂收集解吸液，浓缩，真空干燥，40％乙醇煎煮1h，得牡丹叶有效组分18g，没食子酸含量可达49.6％，没食子酸乙酯含量可达25.3％。
实施例4：牡丹叶有效组分的优选制备方法
1kg粉碎的牡丹叶药材，以30％乙醇回流3h，共提取3次，收集提取液，浓缩后以7％乙醇溶解，直接吸附于S-8大孔树脂，3％乙醇除杂，30％乙醇解吸收集解吸液，浓缩，真空干燥，90％乙醇浸渍12h，得牡丹叶有效组分16g，没食子酸含量可达38.5％，没食子酸乙酯含量可达15.6％。
实施例5：牡丹叶有效组分的制备方法
1kg粉碎的牡丹叶药材，以80％乙醇浸泡2h，装入渗漉桶，以80％乙醇渗漉，收集渗漉液30L，浓缩后以水溶解直接吸附于NKA-II大孔树脂，5％乙醇除杂，10％乙醇除杂收集解吸液，浓缩，真空干燥，40％乙醇加热回流4h，得牡丹叶有效组分18g，没食子酸含量可达65.8％，没食子酸乙酯含量可达26.5％。
实施例6：本发明牡丹叶有效组分的分离鉴定
取实施例5的牡丹叶有效组分，通过硅胶柱层析粗分，氯仿∶甲醇(100∶1-1∶100)梯度洗脱得到过个流份，再分别对不同流份利用反相柱层析，凝胶柱层析，甲醇水系统梯度洗脱，得到没食子酸和没食子酸乙酯。并且通过核磁共振技术，解析化合物结构，经与文献对照确定化合物分别为没食子酸、没食子酸乙酯。
没食子酸的结构确定：该化合物化合物薄层斑点FeCl3显阳性，说明化合物结构中有酚羟基。氢谱中δ6.94(2H，s)为芳香质子信号。而碳谱中δ167.5为1个酯羰基或羧基碳信号，δ145.4、137.9、120.5、108.7为1组苯环碳信号，其中有2个重叠峰。因此推测其结构为没食子酸。与文献[2]数据对照，因此化合物确定为没食子酸。
没食子酸乙酯的结构确定：该化合物FeCl3显阳性，说明化合物结构中有酚羟基。ESI-MS中分子离子峰为197[M-1]-。氢谱中δ7.13(2H，s)处的信号为芳香质子信号。由信号δ4.28(2H，p，J＝6.9Hz，CH2)，1.34(3H，t，J＝6.9Hz，CH3)可以推断分子中含有OCH2CH3的结构片断。而碳谱中δ165.9为1个酯羰基或羧基碳信号，δ145.5、138.2、119.7、108.5为1组苯环碳信号，其中有2个重叠峰。δ60.1、14.4为乙氧基的2个碳信号。推测其结构为没食子酸乙酯。与文献[1]数据对照，数据一致。因此化合物确定为没食子酸乙酯。
参考文献：
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实施例7：牡丹叶有效组分的胶囊剂制备
取实施例4方法制备的牡丹叶有效组分100g，60℃干燥，研磨粉碎，过80目筛，加过80目筛的微晶纤维素100g，混合均匀，用70％乙醇适量制成软材，过30目筛制颗粒，烘干，使水分小于5％，过40目筛整粒，分装于3号胶囊中。每粒胶囊含牡丹叶有效组分0.1g，用铝塑复合包装，即得。口服给药，每日3次，每次1粒。
实施例8：牡丹叶有效组分的片剂制备
实施例3方法制备的牡丹叶有效组分60g，加入微晶纤维素60g，以2％的羟丙甲纤维素作为粘合剂进行制软材，制粒干燥整粒，加入4％的崩解剂羧甲基淀粉钠和润滑剂0.5％硬脂酸镁与细粉混合均匀，干粒加入硬脂酸镁，整粒，混匀，压片，即得。每片含牡丹叶有效组分0.1g。口服给药，每日3次，每次1片。
实施例9：牡丹叶有效组分冻干粉针剂的制备
取实施例5方法制备的牡丹叶有效组分100g，加入2％的甘露醇为支架剂，加适量注射用水，搅拌溶解后，超滤，得到无热源的澄清液，加注射用水至2000ml，分装为1000支，按冻干粉针制备工艺冻干，制成冻干粉针剂。每支冻干粉针剂含量有牡丹叶有效组分0.10g，每天注射给药1次，每次1支。
为了便于理解牡丹叶有效组分的治疗效果，本发明人采用实施例5所述的方法制备得到的牡丹叶有效组分进行了实施例7和实施例8所述的药效学实验。
实施例7：牡丹叶有效组分对垂体后叶素所致大鼠实验性心肌缺血的影响
采用舌下静脉注射垂体后叶素建立Wistar大鼠心肌缺血模型。将大鼠随机分为空白对照组(不给予受试药物，仅给予生理盐水)，模型组，盐酸地尔硫卓(L-型钙通道拮抗药)阳性对照组(6mg/kg)，牡丹叶有效组分小(20mg/kg)、中(40mg/kg)、大(80mg/kg)剂量组。
各剂量组大鼠均按10ml/kg连续灌胃给药7天，空白对照组和模型组给予相同体积的生理盐水，于第7天灌胃给药后1h，腹腔注射乌来糖(1000mg/kg)麻醉，并测心电图1min，作为造模前值，然后按2.0IU/kg经舌下静脉注射垂体后叶素造成急性心肌缺血模型，分别记录各剂量组造模后30s、1min、5min、10min、15min的心电图，作为造模后值。实验数据均以均数±标准差(x±s)表示，模型组与空白对照组比较，其它剂量组均与模型组比较，采用F检验和t检验进行统计分析。结果见表1和表2。
表1牡丹叶有效组分灌胃给药对实验性心肌缺血大鼠II导联心电图T波变化绝对值的影响(x±s，单位：mV，n＝10)
注：与空白对照组比较，△P＜0.05 △△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05 **P＜0.01
由表1可见，舌下静脉注射垂体后叶素后，模型组动物均由于冠状动脉痉挛出现心肌急性缺血，表现为心电图T波抬高，变化绝对值增加。与模型组比较，牡丹叶有效组分小、中、大三个剂量组均具有降低T波变化绝对值的作用，且随着灌胃给药剂量的增加，药效随之增强。
表2牡丹叶有效组分对冠脉结扎致大鼠心肌梗死面积占全心面积百分比的影响(x±s，n＝16)
注：与假手术组比较，△△△P＜0.001；与模型组比较，**P＜0.01
由上表2可见，冠脉结扎后，模型组心肌梗死严重，心肌梗死面积显著增大。与模型组比较，盐酸地尔硫卓组及牡丹叶有效组分组均能显著缩小心肌梗死面积，牡丹叶有效组分大剂量组作用优于阳性药。本试验结果表明牡丹叶有效组分在20mg/kg即具有良好的抗心肌缺血活性，且其活性随着给药剂量的增加而增强。
综合以上结果，牡丹叶有效组分对冠脉结扎所致大鼠实验性心肌缺血有显著的治疗作用，通过改善缺血，减少心肌细胞损伤和减少心肌梗死范围等作用对冠脉结扎所致大鼠实验性心肌缺血和梗死有治疗作用。
实施例8：牡丹叶有效组分对大脑中动脉结扎所致大鼠脑梗死的影响。
将Wistar大鼠96只，随机分为6组，每组16只分别为：假手术组、模型组、阳性药组(尼莫地平30mg/kg)、牡丹叶有效组分小剂量组(20mg/kg)、中剂量组(40mg/kg)、大剂量组(80mg/kg)。采用结扎大鼠大脑中动脉复制局部脑梗死的动物模型，观察其对局部脑缺血及梗死的影响，考察其对脑梗死面积的影响。结果见表3：
表3牡丹叶有效组分对大脑中动脉结扎所致脑梗死面积占全脑面积的百分比的影响(x±s，n＝16)
注：注：与假手术组比较，△△△P＜0.001；与模型组比较，**P＜0.01
由上表3可见，大脑中动脉结扎后，模型组损伤严重，脑梗死面积显著增大。与模型组比较，尼莫地平组及药物各组均能明显减轻脑动脉缺血导致的局部脑梗死，显著缩小脑梗死面积，大剂量效果最优，作用优于阳性药。
同时，本发明人分别采用实施例1-4中制备得到的牡丹叶有效组分进行“牡丹叶有效组分对垂体后叶素所致大鼠实验性心肌缺血的影响”和“牡丹叶有效组分对大脑中动脉结扎所致大鼠脑梗死的影响”。结果表明，不同含量的牡丹叶有效组分同样具有抗心肌缺血作用和改善脑梗死情况，且随着给药剂量增加，作用效果也明显增加。
Claims (14)
1.一种牡丹叶有效组分，其特征在于主要包含没食子酸和没食子酸乙酯，其中没食子酸的含量为35-70％，没食子酸乙酯的含量为15-30％。
2.根据权利要求1所述的牡丹叶有效组分，其特征在于没食子酸的含量在40-70％，没食子酸乙酯的含量为15-30％。
3.根据权利要求2所述的牡丹叶有效组分，其特征在于没食子酸的含量在50-70％，没食子酸乙酯的含量为20-30％。
4.根据权利要求3所述的牡丹叶有效组分，其特征在于没食子酸的含量在60-70％，没食子酸乙酯的含量为25-30％。
5.一种牡丹叶有效组分的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)取牡丹叶，用水和/或低级醇提取，得提取液；
(2)将步骤(1)提取液直接上大孔吸附树脂柱，或者，将步骤(1)提取液浓缩后上大孔吸附树脂柱；
(3)依次用0-50％低级醇进行梯度洗脱；
(4)收集富含没食子酸及没食子酸乙酯的洗脱液，浓缩；
(5)用水和/或低级醇对富含没食子酸及没食子酸乙酯的浓缩液进行溶解，干燥，得牡丹叶有效组分，其中没食子酸的含量为35-70％，没食子酸乙酯的含量为15-30％。
6.权利要求5所述的制备方法，其中，
提取或者梯度洗脱或者溶解时，所用低级醇是指碳数为C1-C5的直链或支链低级醇；水和低级醇是V/V混合；
步骤(1)提取中，醇浓度为0-95％；用回流、浸渍、渗漉或水煎方法提取；
步骤(2)中大孔树脂为聚苯乙烯型、聚丙烯酸酯型或聚甲基丙烯酸酯型中的任意一种或几种为骨架材料的树脂；
步骤(3)所述梯度洗脱是先用浓度为低于5％的低级醇洗脱除去杂质，再用浓度为X的低级醇洗脱，收集富集没食子酸和没食子酸乙酯的洗脱液，浓缩，其中5％≤X≤50％；
步骤(5)中所用低级醇的浓度为0-100％；选用减压、真空、冷冻或喷雾方法中的任意一种方法进行干燥。
7.权利要求6所述的制备方法，其中，
提取或者梯度洗脱或者溶解时，所用低级醇选自甲醇、乙醇、丙醇或正丁醇中的任意一种或它们的混合物；
所述大孔树脂选自NKA-II、DA201、S-8型树脂。
8.权利要求7制备方法，其中，提取所用溶剂是30-90％乙醇；梯度洗脱是先用0-5％乙醇除去杂质，再用10-30％乙醇洗脱；溶解所用溶剂是50-100％乙醇。
9.权利要求8制备方法，其中，提取所用溶剂是55-80％乙醇；梯度洗脱是先用0-5％乙醇除去杂质，再用10％-20％乙醇洗脱；溶解所用溶剂是60-100％乙醇。
10.一种防治心脑血管疾病的药物组合物，其特征在于是将权利要求1至9任一项所述牡丹叶有效组分与药学上可接受载体混合制成的药用制剂。
11.权利要求10的药物组合物，所述药学上可接受载体包括常规制剂辅料，也包括对本发明药效没有明显影响的抗氧化剂、氨基酸、维生素、碳水化合物或植物提取物。
12.权利要求11的药物组合物，其特征在于所述药用制剂为口服制剂，包括胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、口服液、片剂或滴丸；或者为注射剂，包括冻干粉针剂和注射液；或者为局部给药制剂，包括霜剂、软膏剂、贴剂、喷雾剂、皮下植入剂。
13.权利要求1至12任一项牡丹叶有效组分在制备防治心脑血管病药物中的应用。
14.权利要求13的应用，所述心脑血管疾病包括冠心病。
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