CN103450023A - 牡丹叶中没食子酸乙酯的提取方法及其新用途 - Google Patents

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郭凤
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Abstract

本发明涉及化学与农业领域，具体来说是提供一种牡丹中没食子酸乙酯的提取方法，包括取牡丹叶植物干粉，用乙醇提取、石油醚和乙酸乙酯萃取，对乙酸乙酯相萃取物经硅胶柱色谱，依次用石油醚+丙酮、丙酮+甲醇进行梯度洗脱得到8个馏分，取活性较高的M5馏分进一步用石油醚+丙酮梯度洗脱得到没食子酸乙酯。本发明进一步提供没食子酸乙酯的除草新用途。

Description

牡丹叶中没食子酸乙酯的提取方法及其新用途
技术领域
本发明涉及化学与农业领域，具体来说是提供一种牡丹叶中没食子酸乙酯的提取方法及其用途。
背景技术
牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)为芍药科芍药属牡丹组落叶灌木,是重要的观赏植物和药用植物。其根皮为常用中药材，内含的丹皮酚具有抗血栓形成、抗动脉硬化、降血压、保护脑组织等多种药理作用[林碧璇.中国实用医药,2011,6(19):237-238]。花瓣富含多酚、类黄酮与花色苷，具抗氧化活性和自由基清除能力[冯志文,杨霞光,潘剑. 西北农林科技大学学报,2009,37(1)205-209]。牡丹籽提取物Ⅱ（脂溶性成分）对枯草杆菌、沙门氏菌、根霉菌和黑曲霉菌均有一定的抑制作用；提取物Ⅲ（水溶性成分）对枯草杆菌、沙门氏菌和巴氏杆菌均有一定抑菌作用[白喜婷,朱文学,罗磊,等.中国酿造, 2009,(3):59-61]。叶中所含有的黄酮类化合物对大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和沙门氏菌(Salm onella)3种细菌均有较强的抑制作用[唐浩国,单方方,魏晓霞,等.时珍国医医药,2009,20(6): 1355-1357]。黄酮类化合物还具有抗氧化、清除自由基、消炎、调节血脂、抗癌、抗HIV等广泛的生物活性[王宇翎,张艳,方明,等.中国药理学通报,2005,21(3):348]。而发明人也最先报道了其不同器官的除草活性 [罗小勇.植物保护,2011, 37(2):87-90]，并通过进一步研究找到了除草活性物质提取的最佳溶剂及浓度为80%乙醇溶液[郭凤,罗小勇.杂草科学,2012,30(3):21-26]。
本发明人在对牡丹叶中有效成分的进一步研究中，首次从中分离到没食子酸乙酯(ethyl gallate)，并首次发现其具有高除草活性，从而完成了本发明。尽管此前，已经从椿叶[罗晓东,吴少华,马云保,等.中草药,2001,32(5):390-393]、洋紫荆[赵燕燕,崔承彬,蔡兵,等.中国药物化学杂志,2005,15(5):302-306]、救心草[于志斌,杨广义,吴霞,等.天然产物研究与开发,2007, 19:67-69]、栾树[杨小凤,付宏征,雷海民,等.药学学报,1999,36(6):1-8]、小紫金牛[李药兰,苏妙贤,岑颖洲,等.中药材,2006,29(4):331-333]、使君子[黄文强,施敏峰,宋晓平,等.西北农林科技大学学报,2006,34(4):79-82]、乌桕[柳润辉,孔令义.中国中药杂志,2005, 30(15): 1213-1215]、叶下株[沙东旭,刘英华,王龙顺,等.沈阳药科大学学报,2000, 17(3): 176-180]、芒果[梁耀光,徐巧林,谢海辉,等.热带亚热带植物学报, 2010, 18(4): 445-448]、余甘子[钟振国,梁红,钟益宁,等. 现代化中约制剂发展与中药药理学研究交流会论文集,2009，258-263]和青橄榄[陈荣,梁敬钰,卢海英,等.林产化学与工业,2007, 27(2):45-50]等多种植物中被分离到，并主要用于油脂的抗氧化剂、食品添加剂及某些药品的中间体。但尚未见其农用除草活性的任何报道。而且，本发明中所述的提取分离方法，系采用活性追踪法一步步探索而成，它非常适合于牡丹中该物质的提取分离，提取分离的过程及方法不同于上述植物。
发明内容
本发明的目的之一在于从牡丹叶中分离出活性物质没食子酸乙酯。
本发明的另外一个目的是提供所述化合物的提取方法。
本发明的又一个目的是提供所述化合物的农药用途，更进一步的是提供该化合物的除草用途。
具体的，一种牡丹叶中没食子酸乙酯的提取方法，包括如下步骤：
取牡丹叶干粉，用体积比80%乙醇浸泡提取6次，每次时间为3d，合并提取液，过滤后将提取液减压（真空抽滤）浓缩，得乙醇提取浸膏。将乙醇提取浸膏加入20倍重量蒸馏水混悬后，依次分别用石油醚和乙酸乙酯进行萃取。将乙酸乙酯相萃取液回收溶剂后得乙酸乙酯萃取物浸膏，取乙酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱，依次用1:0~0:1体积比的石油醚和丙酮混合溶剂以及25:1~ 0:1体积比的丙酮和甲醇混合溶剂进行梯度洗脱得M1~M10共10个馏分，对活性较高的M5馏分用5:1~0:1体积比的石油醚和丙酮混合溶剂进一步柱色谱分离，得到没食子酸乙酯。
优选的，植物干粉为牡丹植物叶干粉。用浓度为80%乙醇提取6次，每次时间为3d，用石油醚和乙酸乙酯各分别萃取8次，取乙酸乙酯相继续分离。
具体实施方式
本发明所述的化合物具有下列结构式：
Figure 2013103764968100002DEST_PATH_IMAGE001
该化合物是从牡丹的干叶中提取。
具体的，将植物牡丹干燥叶的粗粉用80%乙醇提取，提取液减压（真空抽滤）回收溶剂，得乙醇提取浸膏；取浸膏加入20倍量蒸馏水混悬后，依次分别用石油醚和乙酸乙酯萃取；取乙酸乙酯萃取相依次分别用石油醚+丙酮、丙酮+甲醇经硅胶柱色谱进行洗脱，得到M1~M10共10个馏分；对活性较高的M5馏分用石油醚+丙酮进一步柱色谱分离，得到本发明的活性物质。
本发明所述化合物具有较强的抑制植物幼苗生长的活性。具体来说本发明所分离的化合物对生菜和夏至草幼苗胚根和胚轴的生长具有很强的抑制作用，可用于直接开发植物源除草剂或作为先导化合物开发仿生除草剂。
 
通过实施例和实验例对本发明进行更详细的说明。
实施例1  化合物没食子酸乙酯的提取
取4000g牡丹叶粉末，用80%乙醇溶液（8000mL）浸泡提取6次，每次时间为3d。期间每隔6小时搅拌一次。提取液合并后经真空抽滤和旋转蒸发将乙醇回收得到乙醇提取浸膏665g。将乙醇提取浸膏640g加入20倍量蒸馏水混悬后，依次分别加入等量石油醚和乙酸乙酯各萃取8次，合并各自萃取液后旋转蒸发回收溶剂，分别得到石油醚和乙酸乙酯萃取物浸膏，其中乙酸乙酯萃取物浸膏129g。取乙酸乙酯萃取物浸膏80g经硅胶柱色谱，依次用1:0、100:1、50:1、25:1、15:1、10:1、5:1、3:1、1:1和0:1体积比的石油醚和丙酮混合溶剂与25:1、10:1、5:1、1:1和0:1体积比的丙酮和甲醇混合溶剂进行梯度洗脱得到M1~M10共10个馏分，对活性较高的M5馏分用5:1、3:1、2:1、1:1和0:1体积比的石油醚和丙酮混合溶剂进行进一步硅胶柱色谱分离，得到没食子酸乙酯，为无色针晶。
对上述分离的化合物没食子酸乙酯进行结构鉴定，所得波谱数据如下：
ESI-MS：198.1(M.1)
1H-NMR (500 MHz, CD3COCD3)：δ:1.29 (3H, t, J=7.5Hz, H-9, -CH3), 4.23(2H, q, J=7.5Hz, H-8, -O-CH2-), 7.11(s, 2H, H-2,5).  
     13C-NMR (125MHz,CD3COCD3)： δ:165.8(C-7, -COO-), 145.1(C-3,5), 137.7(C-4), 121.3(C-1), 108.9(C-2,6), 60.0(C-8, -O-CH2-), 13.7(C-9, -CH3).
实验例2 没食子酸乙酯及其每个提取阶段的除草活性
1）实验材料
生菜、小麦、夏至草、稗
2）实验方法
琼脂法：将受体植物种子经0.2%次氯酸钠溶液浸泡15min后，用自来水冲洗数次并置流水下浸泡吸水3~5h左右，而后用蒸馏水洗涤数次，均匀摆放在带盖方盘内的吸水纸上，滴加蒸馏水至种子不漂浮，遮光置于全智能人工气候箱（HP1000GS-B型, 武汉瑞华仪器设备有限责任公司）内发芽，待胚根（或种子根）达3~5mm时移植至混有各阶段提取物的0.5%琼脂凝胶（事先配制100mL, 并均匀分注至3个小烧杯中）上，各提取物的浸膏需事先分别用0.5ml丙酮溶解后再加入至琼脂溶液中配制含毒基质，各处理（含空白对照）中丙酮最高浓度为0.5%，且在配置后待琼脂凝固后再进行处理，在该浓度下对受体植物的生长没有不良影响。以不含提取物的0.5%琼脂凝胶（含0.5%丙酮）为空白对照。移植时先用尖嘴镊子在已凝固的琼脂表面插5个小孔, 之后分别夹取胚根长度基本一致的预萌发受体植物种子, 将胚根（或种子根）垂直由小口轻轻植入琼脂凝胶中。每烧杯5粒, 重复3次。为防止光照对化合物及植物幼根生长的影响, 将各烧杯放入人工气候箱遮光培养2~4d。其中，生菜和小麦均培养2~3d，夏至草和稗均培养3~4d。人工气候箱设置为14h (25℃)和10h (20℃)的自动循环, 箱内相对湿度为60%。待处理结束后, 用电子游标卡尺分别测量受体植物幼苗胚根(或种子根)和胚轴(或胚芽鞘)的长度,以各植物胚根(种子根)和胚轴(胚芽鞘)的实际生长量计算有效中量（EC50）。
3）实验结果
从牡丹叶中提取分离没食子酸乙酯共分为乙醇提取、石油醚和乙酸乙酯萃取、柱色谱分离等阶段。每个阶段的除草活性见表1~3。
表1 牡丹叶乙醇提取物对生菜、小麦、夏至草和稗幼苗生长的抑制作用
Figure 2013103764968100002DEST_PATH_IMAGE002
表2 牡丹叶乙醇提取物的乙酸乙酯相对生菜、小麦、夏至草和稗幼苗生长的抑制作用
Figure 2013103764968100002DEST_PATH_IMAGE003
表3 没食子酸乙酯对生菜和夏至草幼苗生长的抑制作用
结论：可见提取分离该提取物的各阶段产物对受体植物幼苗的生长均具有很好的抑制作用，有效中浓度均很低，该提取物可用于直接开发植物源除草剂或作为先导化合物开发仿生除草剂。

Claims (5)

1.一种牡丹中没食子酸乙酯的提取方法，其特征在于包括如下步骤：
取牡丹叶干粉，用体积比80%乙醇浸泡提取6次，每次时间为3d，合并提取液，过滤后将提取液减压（真空抽滤）浓缩，得乙醇提取浸膏，将乙醇提取浸膏加入20倍重量蒸馏水混悬后，依次分别用石油醚和乙酸乙酯进行萃取，将乙酸乙酯相萃取液回收溶剂后得乙酸乙酯萃取物浸膏，取乙酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱，依次用1:0~0:1体积比的石油醚和丙酮混合溶剂以及25:1~0:1体积比的丙酮和甲醇混合溶剂进行梯度洗脱得M1~M10共10个馏分，对活性较高的M5馏分用5:1~0:1体积比的石油醚和丙酮混合溶剂进一步柱色谱分离，得到没食子酸乙酯。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于用浓度为80%乙醇提取6次，时间分别为3d，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，并对乙酸乙酯萃取物进行两级柱色谱分离。
3.如权利要求1－2任一所述的方法，其特征在于提取材料为牡丹叶干粉。
4.没食子酸乙酯的除草用途。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于所述的没食子酸乙酯是按权利要求1－3任一所述的方法提取的。
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