CN104861020B - 一个苯丙素苷类化合物、其提取方法及其应用 - Google Patents

一个苯丙素苷类化合物、其提取方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及具有下述结构式的苯丙素苷类化合物：本发明所述的苯丙素苷类化合物从葫芦茶中提取分离得到，动物实验证实上述化合物可显著降低糖尿病小鼠、大鼠的血糖水平，减少尿蛋白排泄，缓解肾脏损伤，在制备治疗糖尿病及糖尿病肾病的药物上具有较好的应用前景。

Description

一个苯丙素苷类化合物、其提取方法及其应用
技术领域
本发明属于生物化学医药领域，具体而言涉及一个苯丙素苷类化合物、其提取方法及其应用。
背景技术
糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)是由高血糖引起的、危害性最大的糖尿病慢性并发症。糖尿病肾病引发的终末期肾病，只能依靠透析和肾移来治疗，是威胁糖尿病患者生命健康的主要原因。随着糖尿病患者的不断增加，糖尿病肾病的发病率呈明显上升趋势。因此，糖尿病肾病的防治已成为当前社会关注的公共卫生问题。临床上主要通过控制高血糖、高血脂、限制蛋白质摄入以及抑制肾素-血管紧张素系统进行治疗，但糖尿病肾病具有发病率高、治疗困难、预后差的特点，目前尚无特别有效的药物。随着糖尿病肾病发病的机制特别是与氧化应激关系研究的不断深入，与糖尿病肾病发生发展密切相关的细胞信号转导通路被陆续发现。以细胞信号转导通路中的关键因子为靶点，研发高效、低毒、特异性强的药物逐渐成为糖尿病肾病保护药物研究领域的热点。
葫芦茶系豆科(Leguminosae)葫芦茶属(Tadehagi)植物葫芦茶(Tadehagitriquetrum or Desmodium triquetrum)，主产于海南、广东、广西等地区。葫芦茶具有清热解毒的功效，收载于1997版中国药典，并作为黎药收录于《黎族药志》。
目前对葫芦茶的研究多集中在对其功效、组方配伍的研究，对其所含化学成分以及化学成分的药理活性研究较少。而化学成分是药材发挥其功效、药理活性的基础，也是进行组方法配伍的基础，因此对葫芦茶中所含的化学成分进行研究生具有重要的意义。
发明内容
本发明提供了一种如式Ⅰ所示的结构的化合物的提取方法，包括以下步骤：
(1)沸水提取粉碎后的葫芦茶得提取液；
(2)浓缩提取液，得到浸膏；
(3)将步骤(2)中所得的浸膏悬浮于水中得混悬液，萃取除去脂溶性物质后，用正丁醇萃取，得到正丁醇萃取物；
(4)步骤(3)中所得的正丁醇萃取物浓缩后，上样至硅胶色谱柱上，用氯仿和甲醇的混合溶剂进行梯度洗脱，按照所使用的不同梯度的洗脱液收集流份；
(5)将步骤(4)中使用氯仿:甲醇体积比为70:30的混合溶剂洗脱下来的流份上样至硅胶色谱柱上，用氯仿和丙酮的混合溶剂进行洗脱，氯仿和丙酮的体积比为2:1；对所得的流份进行纯化，得到该化合物，结构如式Ⅰ所示：
进一步，所述步骤(3)除去脂溶性物质使用的试剂为二氯甲烷，加入量为混悬液提体积的1/4，萃取次数为5-10次。
进一步，所述步骤(4)中，氯仿和甲醇的混合溶剂中氯仿和甲醇的体积比为100:0至0:100；所用的硅胶色谱柱中硅胶的粒径为10-100μm。
进一步，所述步骤(4)中所使用的混合溶剂中氯仿:甲醇的体积比例依次为：100:0、98:2、95:5、90:10、85:15、80:20、70:30、60:40、50:50和0:100。
进一步，所述步骤(5)中，所用的硅胶色谱柱中硅胶的粒径为10-100μm；所用的纯化方法为薄层色谱和/或高效液相色谱法。
进一步，所述的高效液相色谱柱为ZORAX SB-phenyl。
本发明的有益效果：
本发明的化合物属于苯丙素类化合物，具有多种药理活性。通过动物实验表明，本发明所述的化合物可显著降低糖尿病小鼠的血糖水平，减少尿蛋白排泄，缓解肾脏损伤，可用于制备治疗糖尿病及糖尿病肾病的药物。
附图说明
图1为本发明所述的苯丙素苷类化合物的高分辨质谱图；
图2为本发明所述的苯丙素苷类化合物的核磁共振氢谱；
图3为本发明所述的苯丙素苷类化合物的核磁共振碳谱；
图4为本发明所述的苯丙素苷类化合物的HSQC谱；
图5为本发明所述的苯丙素苷类化合物的1H-1H COSY谱；
图6为本发明所述的苯丙素苷类化合物的HMBC谱；
图7为本发明所述的苯丙素苷类化合物对小鼠血糖、尿蛋白及体重/肾脏比的影响；
图7中，P组为阳性药组，M组为糖尿病肾病模型组，L组为化合物低剂量组，M组为中剂量组，H组为高剂量组；
图8为本发明所述的苯丙素苷类化合物对大鼠血糖水平的影响；
图9为本发明所述的苯丙素苷类化合物对大鼠尿白蛋白水平的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的描述，但仅是对本发明的示例性说明，绝不是对本发明范围的限制。
实施例1.本发明的化合物的制备
取葫芦茶5-10kg，粉碎后用水煎3-10次，每次用10倍体积的水煎1-6小时，共使用15-50倍体积的水。将提取液合并，过滤，减压蒸干水分，得到约1000g浸膏。将浸膏悬浮于100000ml蒸馏水中，用二氯甲烷萃取除去脂溶性物质，每次使用二氯甲烷2500ml，萃取5-10次。将母液采用正丁醇萃取，得到正丁醇萃取物50ml。取正丁醇萃取物40ml，上样至硅胶色谱柱上，色谱柱购于青岛海洋化工有限公司柱层析硅胶，硅胶粒径60-8μm。使用不同梯度的氯仿-甲醇混合溶剂进行洗脱，氯仿、甲醇的体积比范围为100:0-0:100，流速为6-10ml/min。每种梯度的混合溶剂用量为6000mL，按照所用不同梯度的洗脱液收集流份。每种梯度的洗脱液的配比以及所得流份的命名如表1所示。
表1不同梯度洗脱液所得的流份命名
洗脱液配比(氯仿:甲醇，v/v) 所得的流份命名编号
100:0 Fr.1
90:10 Fr.2
80:20 Fr.3
70:30 Fr.4
50:50 Fr.5
0:100 Fr.6
将其中的Fr.4流份经过薄层色谱硅胶，填装的柱色谱进行分离；所用硅胶为青岛海洋化工有限公司的薄层色谱硅胶，粒径10-40μm。使用不同梯度的氯仿-丙酮混合溶剂进行洗脱，氯仿与丙酮的分别体积比为2:1和1:1，流速为3-5ml/min。每种梯度的混合溶剂用量为2000ml，按照所用不同梯度的洗脱液收集细分流份。每种梯度的洗脱液的配比以及所得细分流份的命名如表2所示。
表2不同梯度洗脱液所得的细分流份编号
洗脱液配比(氯仿:丙酮，v/v) 所得的细分流份命名编号
2:1 subFr.a
1:1 subFr.b
其中在subFr.a流份中析出百色固体，溶解于甲醇，经高效液相色谱法(HPLC)纯化后得到单体化合物，纯度达到95％以上。
在化合物的纯化过程中，还可以采用薄层色谱法或者薄层色谱法和高效液相色谱法相结合的方法纯化得到单体化合物。
实施例2.本发明化合物的表征
本发明所述的化合物的高分辨质谱图如图1所示，其波谱数据见表3。
表3.化合物的高分辨质谱数据
质谱仪 电离模式 实测值 理论值 分子式
HR-ESI-MS [M+Na]+ 603.1492 603.1478 C30H28NaO12
本发明所述的化合物的核磁共振波谱图如图2至图6所示，其波谱数据见表4。
表4.化合物的核磁共振波谱数据
Position 1H-NMR 13C-NMR 1H-NMR 13C-NMR
1 1.75，1.05 33.6 1.29，1.65 37.2
2 1.39，1.57 18.4 1.57，1.42 18.1
3 1.13，1.39 42.2 1.42，1.08 41.8
4 - 32.3 - 32.6
5 1.57 40.1 1.57 43.1
6 1.90，2.00 22.9 2.32，2.10 24.4
7 6.85 140.8 7.13 142.3
8 - 132.2 - 126.3
9 3.54 71.4 3.06 60.6
10 - 36.9 - 36.7
11 - - 9.75 203.7
12 - 168.0 - 167.5
13 0.85 32.6 0.85 32.5
14 0.87 21.4 0.87 21.8
15 0.65 18.1 1.10 21.1
1H-NMR测试条件为600MHz，CD3OD；13C-NMR测试条件为150MHz，CD3OD
实施例3.本发明化合物对昆明小鼠糖尿病及糖尿病肾病的治疗作用
昆明小鼠禁食12h后，随机分组(n＝10，雌雄各半)，一次性腹腔注射注射150mg/kg链脲佐菌素(STZ)。5d后，选择空腹血糖>16.7mmol/L的小鼠，每周定期监测血糖和24h尿白蛋白，持续出现蛋白尿的小鼠视为成模小鼠。成模小鼠随机分为五组：阳性药组(10mg·Kg-1，图中为P组)，糖尿病肾病模型组(图中为M组)，化合物低剂量组(5mg·Kg-1，图中为L组)，中剂量组(10mg·Kg-1，图中为M组)，高剂量组(20mg·Kg-1，图中为H组)。每天灌胃给药一次，连续6周。测定血糖值、肾脏/体重比、24h尿蛋白/尿肌酐比。结果如图7所示。
由图7可以得出，本发明中的化合物可显著降低糖尿病小鼠的血糖水平，明显降低肾脏/体重比、减少尿蛋白排泄，缓解肾脏损伤，说明本发明中的化合物，对于糖尿病及糖尿病肾病具有明显的治疗作用。
实施例4.本发明化合物对SD大鼠糖尿病及糖尿病肾病的治疗作用
SD大鼠，雌雄各半，体重180～220g，随机分组(n＝10，雌雄各半)：对照组、模型组、苯那普利组和化合物组(高中低剂量)。除对照组外，其余大鼠禁食12h，腹腔注射戊巴比妥进行麻醉，切除左肾。术后4周，禁食12h，采用1％的STZ溶液(35mg/kg，一次腹腔注射)。注射3d后，空腹血糖在16.7mmol/L以上的纳入DN研究，每周定期监测尿蛋白/尿肌酐，连续3天检测尿蛋白/尿肌酐均达到30mg·g-1以上，视为造模成功。将DN大鼠分为模型组、阳性药组、化合物高剂量组(40mg·Kg-1)、中剂量组(20mg·Kg-1)、低剂量组(10mg·Kg-1)。不同给药周期剪尾采血检测空腹血糖，检测尿液中白蛋白排泄水平。其结果如图8和图9所示。
由图8，图9可以得出，本发明的化合物在中、高剂量下可显著降低模型大鼠血糖水平，具有明显降血糖的作用，对糖尿病具有治疗作用；并且可以减少尿中白蛋白的排泄，缓解肾脏损伤，对糖尿病肾病具有保护作用。
实施例5.本发明中的化合物散剂制备例
将实施例所制得的化合物1份，加入淀粉3.5份、乳糖6.5份按等量递加混合法混合均匀，按容量法分剂量制得散剂。
实施例6.本发明化合物硬胶囊剂的制备例
将实施例所制得的化合物1份，加入干淀粉1.1份作为填充剂，加入1-3％滑石粉作助流剂，混匀后用空心胶囊充填制得硬胶囊剂。
实施例7.本发明中的化合物片剂的制备例
将实施例所制得的化合物1份，加入羟丙基纤维素1.1份做崩解剂，加入药用糊精0.4份作粘合剂，加入适量50-95％的乙醇做润滑剂，湿法制粒、干燥、整粒后加入1-3％的润滑剂混合均匀，压制成片剂。
实施例8.本发明中的化合物分散片的制备例
将实施例所制得的化合物1份和载体材料4份共同溶于50-95％的乙醇中，用喷雾干燥法干燥后，过筛，加入2.0份的微晶纤维素做崩解剂，加入适量微粉硅胶做助流剂，混合均匀后将粉末直接压制成片剂，即得分散片。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种如式Ⅰ所示的苯丙素苷类化合物的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)沸水提取粉碎后的葫芦茶得提取液；
(2)浓缩提取液，得到浸膏；
(3)将步骤(2)中所得的浸膏悬浮于水中，萃取除去脂溶性物质后，用正丁醇萃取，得到正丁醇萃取物；
(4)步骤(3)中所得的正丁醇萃取物浓缩后，上样至硅胶色谱柱上，用氯仿和甲醇的混合溶剂进行梯度洗脱，按照所使用的不同梯度的洗脱液收集流份；
(5)将步骤(4)中使用氯仿:甲醇体积比为70:30的混合溶剂洗脱下来的流份上样至硅胶色谱柱上，用氯仿和丙酮的混合溶剂进行洗脱，氯仿和丙酮的体积比为2:1；对所得的流份进行纯化，得到该化合物，结构如式Ⅰ所示：
2.如权利要求1所述的一种如式Ⅰ所示的苯丙素苷类化合物的提取方法，其特征在于：所述步骤(3)除去脂溶性物质使用的试剂为二氯甲烷，加入量为混悬液体积的1/4，萃取次数为5-10次。
3.如权利要求2所述的一种如式Ⅰ所示的苯丙素苷类化合物的提取方法，其特征在于：所述步骤(4)中，氯仿和甲醇的混合溶剂中氯仿和甲醇的体积比为100:0至0:100；所用的硅胶色谱柱中硅胶的粒径为10-100μm。
4.如权利要求3所述的一种如式Ⅰ所示的苯丙素苷类化合物的提取方法，其特征在于：所述步骤(4)中所使用的混合溶剂中氯仿:甲醇的体积比例依次为：100:0、98:2、95:5、90:10、85:15、80:20、70:30、60:40、50:50和0:100。
5.如权利要求1所述的一种如式Ⅰ所示的苯丙素苷类化合物的提取方法，其特征在于：所述步骤(5)所用的硅胶色谱柱中硅胶的粒径为10-100μm；所用的纯化方法为薄层色谱和/或高效液相色谱。
6.如权利要求5所述的一种如式Ⅰ所示的苯丙素苷类化合物的提取方法，其特征在于：所述的高效液相色谱柱为ZORAX SB-phenyl。
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