CN113952378A - 独一味酚苷的提取方法及防治肝纤维化药物或保健品的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药及保健品领域，具体涉及酚苷混合物在制备防治肝纤维化药物或保健品中的应用，特别是独一味总酚苷提取物的酚苷混合物，本发明还涉及一种独一味总酚苷提取物的提取方法。本发明独一味总酚苷提取物中标志性成分为毛蕊花糖苷、连翘酯苷B、4‑羟基苯甲酸、淫羊藿苷H1、Decaffeoylverbascoside、大波斯菊苷、木犀草素和芹菜素这8种成分，它们具有抗肝纤维化的作用，可用来制备预防和治疗肝纤维化的药物，或辅助治疗CCl4肝损伤的保健品。本发明独一味总酚苷提取物的提取方法采用聚丙烯酰胺凝胶树脂，使独一味总酚苷提取物的分离纯化更顺利、得率更高。

Description

独一味酚苷的提取方法及防治肝纤维化药物或保健品的应用
技术领域
本发明涉及中药及保健品领域，特别涉及酚苷混合物在制备防治肝纤维化药物或保健品中的应用，特别是独一味总酚苷提取物的酚苷混合物，也涉及一种独一味总酚苷提取物的提取方法。
背景技术
长期的乙肝病毒侵害、非/酒精性脂肪、或肝胆汁淤积对肝脏的损伤，引起肝组织修复能力失调，导致粘连蛋白(FN)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和胶原-α1(Coll-α1)等细胞外基质过度沉积，最终形成肝纤维化。研究表明转化生长因子-β(transforming growthfactor-β，TGF-β)的过度活化是肝纤维化发生发展的主要因素之一(Meng X M,et al.TGF-β:the master regulator of fibrosis.[J].Nature Reviews Nephrology,2016,48:)；TGF-β信号通路的过度激活，促进细胞外基质(ECM)的过度沉积，进一步导致肝硬化或肝细胞癌的发生。此外，TGF-β信号通路还调节许多生物反应，包括细胞增殖、凋亡、分化、自噬和免疫反应等。因此，抑制TGF-β通路激活成为抗纤维化重要的靶点之一。
独一味为唇形科植物独一味Lamiophlomis rotata(Benth.)Kudo的干燥地上部分，也是《中国药典》收载治疗多种外科手术后的刀口创伤、出血等疾病的常用药，其相关口服制剂疗效确切，且安全性好。
2010-2013年，张怡课题组研究发现独一味颗粒具有较好的抗肝纤维化作用(杨晗,张怡,谭万初,等.独一味颗粒抗大鼠肝纤维化的实验研究[J].上海中医药杂志,2010,044:64-67；张怡,代夏欢,解秀翠,等.独一味颗粒对实验性肝纤维化大鼠TGF-β1/Smads信号通路的影响[J].中国中医基础医学杂志,2013,019(012):1401-1403,1407.)，但未见相关后继报道。
独一味颗粒以独一味药材的水提取物，浓缩干燥后，加适当的赋形剂组成，服用量大，药效物质不明确。迄今为止从独一味中已鉴定环烯醚萜、黄酮和苯乙醇苷等127个化学成分(Zhan-HuCui,et al.Traditional uses,phytochemistry,pharmacology andtoxicology of Lamiophlomis rotata(Benth.)Kudo:a review.RSC Advances.2020,10:11463–11474)，究竟哪一类或那些成分具有抗肝纤维化的作用，迄今为止，未见报道。
我们前期研究表明，独一味总环烯醚萜苷可明显促进机械损伤模型动物伤口胶原沉积，而独一味中的黄酮和苯乙醇苷类成分(合称酚苷)却未显示相关药理活性。本发明体外实验首次发现，不同浓度的独一味总酚苷提取物可人源抑制肝星状细胞(LX-2)增殖，促进TGF-β活化后LX-2细胞的凋亡，体内实验，独一味总酚苷提取物可显著减轻CCl4小鼠肝组织炎症反应、肝纤维化程度，能够显著改善CCl4小鼠肝损伤，减轻肝脏组织胶原沉积，抑制肝纤维化，同时降低模型动物血浆中ALT和AST。
独一味总酚苷提取物抗模型动物肝纤维化的机制，与其抑制TGF-β/Smad信号通路过度激活密切相关，该提取物可显著抑制CCl4小鼠肝组织中Smad 2、3、4蛋白和mRNA水平的表达，升高Smad 7蛋白和mRNA水平的表达；进而减轻肝脏组织中FN、α-SMA和Coll-α1等细胞外基质的分泌，最终防治肝纤维化的发生发展。
发明内容
鉴于此，本发明的目的之一是提供酚苷混合物在制备预防或治疗肝纤维化保健品或药物中的应用，所述酚苷混合物含有毛蕊花糖苷、连翘酯苷B、4-羟基苯甲酸、淫羊藿苷H1、Decaffeoylverbascoside、大波斯菊苷、木犀草素和芹菜素这八种酚苷中的任意两种或两种以上，当然，酚苷混合物可以只是这八种酚苷中的任意两种或两种以上；
优选地，所述酚苷混合物为独一味总酚苷提取物，即酚苷混合物从独一味中提取获得，并含有上述八种酚苷中的任意两种或两种以上；
优选地，独一味总酚苷提取物中含有毛蕊花糖苷、连翘酯苷B、4-羟基苯甲酸、淫羊藿苷H1、Decaffeoylverbascoside、大波斯菊苷、木犀草素和芹菜素这八种成分，且这八种成分的液相色谱-质谱的离子峰面积之和占总酚苷提取物全部峰面积总和的比例为大于或等于60％；
优选地，独一味总酚苷提取物的提取包括，称取独一味地上部分药材，粉碎，加入药材重量10倍体积的水，煎煮2次，每次2h，过滤后合并滤液，静置12h，取上清液通过处理的聚酰胺吸附，先用吸附树脂床5倍量的水洗脱，再用75％的乙醇洗脱解析，收集解析液，回收溶剂，在90℃温度下浓缩后干燥即得到独一味总酚苷提取物；
优选地，独一味总酚苷提取物的提取包括，称取独一味地上部分药材，粉碎，加入药材重量10倍体积的水，煎煮2次，每次2h，过滤后合并滤液，静置12h，取上清液通过Bio-Gel P–2聚丙烯酰胺凝胶树脂吸附，先用树脂床5倍量的水洗脱，再用75％的乙醇洗脱解析，收集解析液，回收溶剂，在90℃温度下浓缩后干燥；所述凝胶树脂的粒径为45–90μm；
优选地，所述酚苷混合物由6-10重量份的毛蕊花糖苷、3-5重量份的连翘酯苷B、2-3重量份的4-羟基苯甲酸、1.5-2重量份的淫羊藿苷H1、1-1.5重量份的Decaffeoylverbascoside、1-1.5重量份的大波斯菊苷、1-1.5重量份的木犀草素和1-1.5重量份的芹菜素组成；
优选地，所述保健品或药物为酚苷混合物与保健品上或药学上可接受的辅料组成的组合物；
优选地，保健品或药物的制剂为汤剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、片剂或口服液。
另外，独一味总酚苷提取物可以制成口服剂型和非口服剂型。
本发明的目的之二是提供一种独一味总酚苷提取物的提取方法，包括，称取独一味地上部分药材，粉碎，加入药材重量10倍体积的水，煎煮2次，每次2h，过滤后合并滤液，静置12h，取上清液通过Bio-Gel P–2聚丙烯酰胺凝胶树脂吸附，先用树脂床5倍量的水洗脱，再用75％的乙醇洗脱解析，收集解析液，回收溶剂，在90℃温度下浓缩后干燥；所述凝胶树脂的粒径为45–90μm；
优选地，上述提取方法中获得的独一味总酚苷提取物中含有毛蕊花糖苷、连翘酯苷B、4-羟基苯甲酸、淫羊藿苷H1、Decaffeoylverbascoside、大波斯菊苷、木犀草素和芹菜素这八种成分，且这八种成分的液相色谱-质谱的离子峰面积之和占提取物全部峰面积总和的比例为大于或等于60％。
独一味总酚苷提取物，以及由上述八种酚苷中任意两种或两种以上组成的酚苷组合物均可抑制LX-2细胞的增殖，并促进TGF-β活化后LX-2细胞的凋亡。独一味总酚苷提取物还可显著减轻CCl4小鼠肝组织炎症反应、肝纤维化程度，H&E染色、天狼星红及马松染色，模型动物肝组织的纤维化程度减弱，降低模型动物血浆中ALT和AST。独一味总酚苷提取物通过可显著降低肝组织中Smad2、3、4mRNA和蛋白水平的表达，促进Smad7mRNA和蛋白水平(Smad家族抑制剂)的表达，进而抑制TGF-β/Smad信号通路过度激活，并减少纤连蛋白(FN)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和胶原-α1(Coll-α1)等细胞外基质的分泌。
独一味颗粒以独一味药材的水提取物，浓缩干燥后，加适当的赋形剂组成，服用量大，药效物质不明确。迄今为止从独一味中已鉴定环烯醚萜、黄酮和苯乙醇苷等127个化学成分。本发明明确独一味总酚苷提取物具有抗纤维化的作用，并明确八种酚苷(毛蕊花糖苷、连翘酯苷B、4-羟基苯甲酸、淫羊藿苷H1、Decaffeoylverbascoside、大波斯菊苷、木犀草素和芹菜素)的组合物具有抗肝纤维化作用，它们可用于制备预防或治疗肝纤维化保健品或药物。
本发明独一味总酚苷提取物的提取方法采用聚丙烯酰胺凝胶树脂，聚丙烯酰胺凝胶树脂内部为网状结构，粒径为45-90μm，相同柱床体积，其吸附载量较普通不规则聚酰胺颗粒状(内部为实心结构)大，因此对溶液中分类成分吸附更充分，相应的，独一味总酚苷提取物的得率更高；又由于聚丙烯酰胺凝胶树脂为球状颗粒，分离纯化过程中，药液更易通过树脂床，不宜堵塞，可保障纯化过程的顺利进行。
附图说明
图1ESI正离子模式独一味总酚苷提取物UPLC-TOF/MS色谱图；
图2独一味总酚苷提取物UPLC-TOF/MS图谱鉴定的化合物结构；
图3独一味总酚苷提取物及八种酚苷的酚苷组合物对肝星状细胞增殖的影响；
图4独一味总酚苷提取物及八种酚苷的酚苷组合物对TGF-β活化肝星状细胞的影响；
图5独一味总酚苷提取物对CCl4肝纤维化模型的影响；
图6独一味总酚苷提取物对CCl4模型小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)影响；
图7独一味总酚苷提取物对模型小鼠肝脏中TGF-β/Smad信号通路的影响。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。
实施例一：本发明独一味总酚苷提取物的提取制备与UPLC-TOF/MS分析
1、独一味总酚苷提取物的提取制备
方法一称取独一味地上部分5kg，粉碎，加入药材重量10倍体积的水，煎煮2次，每次2h，过滤后合并滤液，静置12h，取上清液通过处理的聚酰胺(10-30目)吸附，先用吸附树脂床5倍量的水洗脱，再用75％的乙醇洗脱解析，收集解析液，回收溶剂，在90℃温度下浓缩后，干燥得到独一味总酚苷提取物203.6g。
方法二称取独一味地上部分5kg，粉碎，加入药材重量10倍体积的水，煎煮2次，每次2h，过滤后合并滤液，静置12h，取上清液通过Bio-Gel P–2聚丙烯酰胺凝胶树脂(粒径45-90μm)吸附，先用树脂床5倍量的水洗脱，再用75％的乙醇洗脱解析，收集解析液，回收溶剂，在90℃温度下浓缩后，干燥得到独一味总酚苷提取物248.9g。
2、独一味总酚苷提取物的UPLC-TOF/MS分析
(1)色谱及质谱条件
①色谱条件:Waters Acquity UPLC BEH Cl8 column柱(100mm×2.1mm,1.8μm)，柱温25℃，流速为0.2mL/min，进样量2μl，流动相为甲醇(A)和0.01甲酸％水(B)，梯度洗脱程序：0-30min，20-70％A。
②质谱条件:TOF MS-MS/MS模式，电喷雾离子源(ESI)，在正离子检测模式下采集，正离子:喷雾电压(IS)～5500eV，去簇电压(DP)～100eV，碰撞电压(CE)～10e V；质量数扫描范围m/z 100～1500Da。
(2)供试品的制备
称取方法二提取制备的独一味总酚苷提取物12.14mg置于10mL容量瓶中，加55％的甲醇/水稀释至刻度并摇匀，即得供试品溶液。
(3)结果分析
通过ESI正离子模式检测供试品溶液，共检测并鉴定出16个组成成分，如图1中1-16峰，成分分别为1：Decaffeoylverbascoside，2：4-羟基苯甲酸，3：淫羊藿苷H1，4：Campneoside II，5：连翘酯苷C，6：连翘酯苷B，7：Leuteolin-7-O-[β-D-apiose(6→1)]-β-glucoside，8：异毛蕊花糖苷，9：毛蕊花糖苷，10：木犀草苷，11：大波斯菊苷，12：Dehydroacteoside，13：Leucosceptoside A，14：木犀草素，15：芹菜素，16：Apigenin7-O-(6”-(E)-p-coumaroyl-β-D-galactopyranoside，其对应的化合物的结构如图2所示，其中黄酮类化合物6个，主要包括：木犀草苷、大波斯菊苷、木犀草素和芹菜素等；苯乙醇苷类化合物7个，主要包括：连翘酯苷B、连翘酯苷C、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷和Dehydroacteoside等；有机酚酸及其苷类3个，为4-羟基苯甲酸、淫羊藿苷H1和CampneosideII。
依据各化合物在独一味总酚苷提取物液相色谱-质谱的色谱离子峰的面积比例，最终确定其标志性成分八种，为：毛蕊花糖苷、连翘酯苷B、4-羟基苯甲酸、淫羊藿苷H1、Decaffeoylverbascoside、大波斯菊苷、木犀草素和芹菜素，八种标志性成分占液相色谱-质谱的离子峰全部峰面积总和的60％以上。对方法一获得的独一味总酚苷提取物也进行液相色谱-质谱检测，同样含有上述八种标志性成分，且占液相色谱-质谱的离子峰全部峰面积总和的60％以上。
下面将对独一味总酚苷提取物以及由这些标志性成分的成品所组成的组合物进行抗肝纤维化实验。
实施例二：独一味总酚苷提取物和酚苷组合物对肝星状细胞增殖和凋亡的影响
1、溶液配置
(1)独一味总酚苷提取物溶液制备
称取实施例1中方法二提取制备的20.0mg干燥的独一味总酚苷提取物置于10mL容量瓶中，加DMSO 10mL至刻度并摇匀，得到独一味总酚苷提取物溶液准备液，浓度为2.0mg/mL。
将独一味总酚苷提取物溶液准备液稀释为不同浓度的独一味总酚苷提取物溶液：10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL。
(2)酚苷组合物溶液的配制
实验药品：毛蕊花糖苷、连翘酯苷B、淫羊藿苷H1和Decaffeoylverbascoside为本实验室分离纯化所得，经紫外、红外、核磁和质谱检测，确定其结构，经HPLC检测纯度≥98％。木犀草素、芹菜素和4-羟基苯甲酸均购于上海麦克林生化试剂有限公司，纯度均≥98％；大波斯菊苷购于成都曼斯特生物科技有限公司，纯度≥98％。
参考实施例1提取的独一味总酚苷提取物中的八种酚苷之间的离子峰面积之比，分别精密称取毛蕊花糖苷25.6mg、连翘酯苷B12.2mg、4-羟基苯甲酸6.7mg、淫羊藿苷H14.7mg、Decaffeoylverbascoside 3.8mg、大波斯菊苷3.3mg、木犀草素2.9mg和芹菜素2.7mg，置于10mL容量瓶中，加DMSO 10mL至刻度并摇匀，得到酚苷组合物溶液准备液，浓度为6.19mg/mL。
将酚苷组合物溶液准备液稀释为不同浓度的酚苷组合物溶液：8μg/mL、16μg/mL、31μg/mL、62μg/mL、124μg/mL。
2、独一味总酚苷提取物和酚苷组合物对肝星状细胞增殖的影响
实验分组及药物干预情况如下表：
Figure BDA0003315155700000081
LX-2细胞(人半活化肝星状细胞)正常传代分板，贴壁生长12h后，加入不同浓度的独一味总酚苷提取物、不同浓度和组成的酚苷组合物溶液，干预48h后，CCK-8试剂盒检测分析对LX-2细胞增殖情况的影响。
结果如图3所示，独一味总酚苷提取物和酚苷组合物可有效抑制LX-2细胞的增殖，其中，独一味总酚苷提取物200μg/mL抑制效果最明显(P<0.001，与空白组比较)，它们的半抑制浓度(IC50)略有区别，其中，独一味总酚苷提取物的IC50值为78.1μg/mL，酚苷组合物的IC50值为80.8μg/mL。
3、独一味总酚苷提取物及酚苷组合物对TGF-β活化肝星状细胞凋亡的影响
活化的肝星状细胞(HSC)发生凋亡被认为是肝纤维化逆转、ECM降解过程中重要的形成机制，现应用流式技术检测药物干预后的细胞凋亡情况。
实验分组及药物干预情况如下表：
Figure BDA0003315155700000091
LX-2细胞正常传代分板，贴壁生长12h后，加入10ng/mL的TGF-β激动12h，加入不同浓度的独一味总酚苷提取物和不同浓度的酚苷组合物溶液，Annexin V/PI CellApoptosis Detection试剂盒检测TGF-β活化后LX-2细胞的凋亡情况。
实验结果显示，不同浓度的独一味总酚苷提取物和酚苷组合物均可有效促进TGF-β活化后LX-2细胞的凋亡。其中，100μg/mL的独一味总酚苷提取物，可诱导18.8％的活化LX-2细胞凋亡，62.0μg/mL酚苷组合物干预后，可诱导18.2％的活化LX-2细胞凋亡(图4)。
CCK-8和流式细胞仪检测实验结果，均明确独一味总酚苷提取物体外可抑制肝星状细胞(LX-2)增殖，促进肝星状细胞凋亡。同时，依据独一味总酚苷提取物的UPLC-TOF/MS分析实验结果，按照八个标志性成分所占液相色谱-质谱的离子峰全部峰面积的比例，选取对应的化合物单体，配制成的酚苷组合物，同样对肝星状细胞具有抑制增殖和促进凋亡的作用；实验发现，独一味总酚苷提取物和八种酚苷的酚苷组合物组，均可有效促进TGF-β活化后LX-2细胞的凋亡，但独一味总酚苷提取物效果更好；均可抑制肝星状细胞(LX-2)增殖，其中，独一味总酚苷提取物的IC50值为78.1μg/mL，略低于标志性成分混合物组(IC50＝80.8μg/mL)，表明独一味总酚苷提取物的药理活性略优于八种酚苷的酚苷组合物组。依据上述试验结果，最终选取独一味总酚苷提取物进行整体动物实验，深入挖掘独一味总酚苷提取物抗肝纤维化的药理作用和作用机制。
实施例三：独一味总酚苷提取物对CCl4肝纤维化模型的影响
将C57雄性小鼠(体重在22-25g)随机分为对照组、CCl4诱导组、独一味总酚苷提取物高、中、低(50、100、200mg/kg)剂量组，每组10只。除正常对照组外，CCl4用玉米油配制成浓度为10％，CCl4玉米油溶液腹腔注射0.5mL/kg，每周一、四造模，持续6周。独一味总酚苷提取物给药组在第一次CCl4注射后伴随CCl4注射后给药。
CCl4诱导后2天，收取肝组织，进行病理切片HE染色。结果显示正常组肝小叶结构清晰，肝板排列整齐呈条索状，汇管区无扩大，无炎症细胞浸润；模型组可见大量炎症细胞浸润，肝细胞肿胀坏死；各用药组与模型组相比，均有不同程度减轻，其中，独一味总酚苷高剂量组与改善更为显著(图5A)。
独一味总酚苷提取物对CCl4模型小鼠肝脏胶原纤维化和沉积的影响：天狼星红(Sirius red)染色是胶原纤维特异性染色，将石蜡切片用天狼星红染色，观察小鼠肝脏组织纤维化情况。结果显示，正常组除血管壁外，肝窦有少量表达；模型组可见汇管区大量胶原沉积，纤维间隔形成、增粗并包绕成假小叶；各用药组与模型组相比，均有不同程度减轻，其中，独一味总酚苷高剂量组与改善更为显著(图5B)。
Masson染色是胶原用来显示组织中纤维以及炎性因子的特异性染色，独一味总酚苷干预前后，模型组小鼠肝脏组织中，可见大面积蓝色阳性区域；各用药组与模型组相比，蓝色阳性区域面积均有不同程度减小，其中，独一味总酚苷高剂量组与改善更为显著(图5C)，表明独一味总酚苷提取物组可降低CCl4肝脏组织的胶原沉积，并降低此过程中伴随的炎症反应。
独一味总酚苷提取物对CCl4模型小鼠肝脏形态的影响：空白组小鼠的肝脏暗红色，表面未见有明显结节，边缘光滑较锐巧，质地柔软。模型组小鼠的肝脏暗褐色，体积缩小，有颗粒状物，表面粗糙，边缘变钝，色泽变暗，质地硬。独一味总酚苷各给药组：肝脏颜色呈暗红色，表面结节较模型组减少，边缘基本正常，有颗粒状物，但与模型组比较，颗粒状物体积缩小、数量明显减少(图5D)。总之独一味总酚苷干预后，小鼠肝脏组织色泽、体积、硬度及结节样改变等情况均有不同程度的改善。
独一味总酚苷提取物对CCl4模型小鼠肝脏功能的影响：独一味总酚苷干预前后，试剂盒检测小鼠血浆中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的活力值。与正常对照组相比，模型组血清ALT、AST活性显著升高(P<0.001)；与模型组相比，独一味总酚苷提取物组均能显著降低血清ALT、AST活性(图6)。其中，独一味总酚苷高剂量组与改善更为显著。
独一味总酚苷提取物对模型小鼠肝脏中TGF-β/Smad信号通路的影响：
1)独一味总酚苷提取物对模型小鼠肝脏ECM沉积的影响。
收取小鼠肝组织，采用免疫组织化学染色(Immunohistochemistry assay,IHC)技术，检测小鼠肝脏TGF-β、FN、α-SMA和Col1-α1等细胞外基质沉积的变化。如图7A染色结果显示，CCl4肝纤维化模型组TGF-β、FN、α-SMA和Col1-α1染色明显高于正常对照组。独一味总酚苷各剂量组干预后，肝脏组织中染色区域比模型组减少明显，说明独一味总酚苷能抑制小鼠肝脏组织中TGF-β、FN、α-SMA和Col1-α1表达，抑制肝纤维化后病变部位的细胞外基质沉积。
2)Western blotting方法检测小鼠肝脏中Smad家族蛋白表达水平变化。
独一味总酚苷干预前后，收取小鼠肝组织，采用Western blotting方法检测肝脏组织中TGF-β下游Smad蛋白家族的表达。如图7B，与正常对照组相比，模型组肝脏组织中TGF-β信号通路下游Smad 2、3、4蛋白水平表达显著升高(P<0.001)，Smad家族主要抑制转导分子Smad 7的蛋白水平表达显著降低；与模型组相比，独一味总酚苷提取物组均能显著降低肝脏组织中Smad 2、3、4蛋白水平的表达，升高Smad 7蛋白水平的表达。其中，独一味总酚苷高剂量组的抑制作用更为显著，结果表明，独一味总酚苷干预后，可抑制模型动物肝脏中TGF-β/Smad信号通路，延缓肝纤维化发生。
3)实时定量PCR方法检测小鼠肝脏中Smad家族基因表达水平变化。
独一味总酚苷干预前后，收取小鼠肝组织，参考文献中的方法和引物(JinfengLiu et al.Praziquantel ameliorates CCl4-induced liver fibrosis in mice byinhibiting TGF-β/Smad signalling via up-regulating Smad7 in hepatic stellatecells.Br J Pharmacol.2019,176:4666–4680)，检测肝脏组织中TGF-β下游Smad蛋白家族的基因表达水平变化。如图7C-G的qRT-PCR结果，与正常对照组相比，模型组肝脏组织中TGF-β信号通路下游Smad 2、3、4和FN的mRNA表达显著升高水平显著升高(P<0.001)，Smad7mRNA的表达水平显著降低；与模型组相比，独一味总酚苷提取物组均能显著降低肝脏组织中Smad 2、3、4和FN的mRNA表达水平表达，升高Smad 7mRNA表达水平，量效关系良好。其中，独一味总酚苷高剂量组的抑制作用更为显著，实验结果从基因水平证实了，独一味总酚苷可抑制模型动物肝脏中TGF-β/Smad信号通路，延缓肝纤维化发生。

Claims (10)

1.酚苷混合物在制备预防或治疗肝纤维化保健品或药物中的应用，所述酚苷混合物含有毛蕊花糖苷、连翘酯苷B、4-羟基苯甲酸、淫羊藿苷H1、Decaffeoylverbascoside、大波斯菊苷、木犀草素和芹菜素8种成分中的任意2种或2种以上。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述酚苷混合物为独一味总酚苷提取物。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，独一味总酚苷提取物中毛蕊花糖苷、连翘酯苷B、4-羟基苯甲酸、淫羊藿苷H1、Decaffeoylverbascoside、大波斯菊苷、木犀草素和芹菜素8个成分的液相色谱-质谱的离子峰面积之和占全部峰面积总和的比例为大于或等于60％。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，独一味总酚苷提取物的提取方法包括，称取独一味地上部分药材，粉碎，加入药材重量10倍体积的水，煎煮2次，每次2h，过滤后合并滤液，静置12h，取上清液通过处理的聚酰胺吸附，先用吸附树脂床5倍量的水洗脱，再用75％的乙醇洗脱解析，收集解析液，回收溶剂，在90℃温度下浓缩后干燥。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，独一味总酚苷提取物的提取方法包括，称取独一味地上部分药材，粉碎，加入药材重量10倍体积的水，煎煮2次，每次2h，过滤后合并滤液，静置12h，取上清液通过Bio-Gel P–2聚丙烯酰胺凝胶树脂吸附，先用树脂床5倍量的水洗脱，再用75％的乙醇洗脱解析，收集解析液，回收溶剂，在90℃温度下浓缩后干燥；所述凝胶树脂的粒径为45–90μm。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述酚苷混合物由6-10重量份的毛蕊花糖苷、3-5重量份的连翘酯苷B、2-3重量份的4-羟基苯甲酸、1.5-2重量份的淫羊藿苷H1、1-1.5重量份的Decaffeoylverbascoside、1-1.5重量份的大波斯菊苷、1-1.5重量份的木犀草素和1-1.5重量份的芹菜素组成。
7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述保健品或药物为酚苷混合物与保健品上或药学上可接受的辅料组成的组合物。
8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，保健品或药物的制剂为汤剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、片剂或口服液。
9.一种独一味总酚苷提取物的提取方法，包括，称取独一味地上部分药材，粉碎，加入药材重量10倍体积的水，煎煮2次，每次2h，过滤后合并滤液，静置12h，取上清液通过Bio-GelP–2聚丙烯酰胺凝胶树脂吸附，先用树脂床5倍量的水洗脱，再用75％的乙醇洗脱解析，收集解析液，回收溶剂，在90℃温度下浓缩后干燥；所述凝胶树脂的粒径为45–90μm。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，独一味总酚苷提取物中毛蕊花糖苷、连翘酯苷B、4-羟基苯甲酸、淫羊藿苷H1、Decaffeoylverbascoside、大波斯菊苷、木犀草素和芹菜素8个成分的液相色谱-质谱的离子峰面积之和占全部峰面积总和的比例为大于或等于60％。
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