CN108434399A - 一种防治肿瘤的中药组合物及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抑制恶性肿瘤生长，并增强其化疗敏感性的中药组合物，由如下重量份比例的原料药制成：白花蛇舌草1‑10份，莪术1‑10份，黄芪1‑10份，甘草1‑10份，还公开了一种防治肿瘤的中药制剂的制备方法。本发明的中药组合物，经药效学实验和毒理试验显示，其可抑制肿瘤细胞生长，且适用于抑制紫杉醇耐药癌细胞的生长，安全可靠，副作用小，与化疗药配合使用，可增加肿瘤细胞对化疗药的敏感性，促进肿瘤细胞的凋亡，利于对肿瘤的防治。

Description

一种防治肿瘤的中药组合物及制备方法

技术领域

本发明涉及一种中药复方制剂，具体涉及一种防治肿瘤的中药组合物及制备方法，属于医药领域。

背景技术

恶性肿瘤——癌症已成为常见且严重威胁人类生命和生活质量的主要疾病之一。据世界卫生组织1997年度报道，1996年全球58亿人口中因癌症死亡约有630万人，约占总死亡人数的12％，其中近60％死于肺癌、胃癌、乳腺癌、结肠直肠癌、口腔癌、肝癌、宫颈癌及食管癌，恶性肿瘤是仅次于心血管疾病的第二大死因。从1996年以来全球每年新确诊的肿瘤患者均在1030万人以上，到1999年底全球肿瘤患者总数已逾4000万人。世界卫生组织2001年报道，世界癌症发病率和死亡率比1990年上升了22％。世界卫生组织2004年4月发表的《世界肿瘤报告》说，今后几年将是全球肿瘤高发年份，发病率将增加50％，到2020年每年将增加1500万病例。

近年来随着经济社会的发展，虽然人们生活水平在不断提高，但癌症的发病率和死亡率却在不断上升，其中尤以乳腺癌最为突出，乳腺癌已经成为女性癌症发病率首位，乳腺癌的防治工作已经成为癌症防治工作不可忽视的重点。

目前临床使用的治疗肿瘤的西药毒副作用大，在治疗的同时对肿瘤患者的身体也造成极大的伤害。中药在抗肿瘤中已显现了其具有减轻放化疗毒副作用，改善肿瘤患者生存质量的效果。但是，目前的抗肿瘤的中药药效物质及疗效尚不太明确，质量控制指标不严格等，使得中药在治疗使用中受到很大限制，已不符合中药现代化和走向国际化的要求。

发明内容

为克服现有技术存在的上述不足，本发明提供一种防治肿瘤的中药组合物及制备方法。本发明通过以下技术方案实现：一种防治肿瘤的中药组合物，由如下重量份比例的原料药制成：白花蛇舌草1-10份，莪术1-10份，黄芪1-10份，甘草1-10份。

优选的，所述白花蛇舌草、所述莪术、所述黄芪及所述甘草的重量比依次为1:1:1:1。

优选的，所述肿瘤的癌细胞包括紫杉醇耐药型细胞。

优选的，所述肿瘤的癌细胞经化疗药处理。

优选的，所述化疗药包括紫杉醇类、烷化剂、有机铂类、蒽环类和生物碱类化疗药中的一种或几种。

优选的，所述化疗药包括紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛、拉罗他赛、奥他赛、替司他赛、卡铂、顺铂、奈达铂、奥沙利铂、四硝酸铂、环磷酰胺、多柔比星、阿霉素、吡柔比星、环磷酰胺、长春新碱、尼莫司汀、苯达莫司汀、卡莫司汀、拓扑替康、贝洛替康、依托泊苷和替尼泊苷中的一种或几种。

优选的，该中药组合物还包括填充剂、助悬剂、崩解剂、润滑剂、防腐剂、甜味剂和矫味剂中的一种或几种。

优选的，该中药组合物的质量控制方法为高效液相色谱法。

本发明还提供一种防治肿瘤的中药制剂的制备方法，包括以下步骤：

1)称取如下重量份比例的中药饮片：白花蛇舌草1-10份，莪术1-10份，黄芪1-10份，甘草1-10份；

2)将上述中药饮片粉碎、提取后过滤，得到滤液；

3)将上述滤液减压浓缩后干燥；

4)将步骤3)干燥所得物料制成中药制剂。

本发明的中药组合物，经药效学实验和毒理试验显示，其可抑制肿瘤细胞生长，且适用于抑制紫杉醇耐药癌细胞的生长，安全可靠，副作用小，与化疗药配合使用，可增加肿瘤细胞对化疗药的敏感性，促进肿瘤细胞的凋亡，利于对肿瘤的防治。

附图说明

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。

图1为本发明实施例的中药组合物药效学实验1的结果示意图；

图2为本发明实施例的中药组合物药效学实验2的结果示意图；

图3为本发明实施例的中药组合物药效学实验3的结果示意图；

图4为本发明实施例的中药组合物药效学实验4的结果示意图；

图5为本发明实施例的中药组合物的色谱峰示意图，其中，对照品的色谱峰(a，216nm)；制剂样品色谱峰(b，216nm)；峰1：p-香豆酸，峰2：毛蕊异黄酮葡萄糖苷，峰3：甘草苷，峰4：甘草酸，峰5：莪术醇。

具体实施方式

下面结合附图以及实施方式对本发明进行进一步的描述：

作为一种示例，本实施例的防治乳腺癌的中药组合物，由如下重量份的原料药制成：白花蛇舌草1-10份，莪术1-10份，黄芪1-10份，甘草1-10份。其具有良好的防治乳腺癌效果和较少的不良反应。

关于上述原料药的说明如下：

白花蛇舌草来源于茜草科植物Hedyotis DiffusaWilld的干燥全草，具有清热解毒，利湿通淋的功效。常用于治疗肺热喘咳，咽喉肿痛，毒蛇咬伤，热淋涩痛，湿热黄疸，癌肿等症。现代药理研究表明，白花蛇舌草对于多种癌症均具有治疗作用，尤其是对于肺癌和乳腺疾病的作用明显。以其作为该中药组合物的君药，能够针对乳腺癌起到良好的预防或治疗作用。

莪术来源于姜科植物莪术Curcuma aeruginosa Roxb.[C.zedoaria non Rosc.]、广西莪术Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang和温郁金Curcuma wenyujinY.H.Chen et C.Ling的干燥根茎。莪术本身就具有行气破血，消积止痛之功效，具有潜在的抗癌活性。现代研究表明，莪术对于胃癌、黑色素瘤和乳腺癌均具有良好的治疗作用。以该药为该中药组合物的臣药，能够和君药协同对乳腺癌起到预防或治疗作用。

黄芪来源于豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.Mongolicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，具有补气升阳，生津养血，行滞通痹，托毒排脓，敛疮生肌等功效。现代药理研究表明，黄芪具有调节免疫，抗肿瘤等作用。以其作为佐药，补气升阳，生津养血，能够增强乳腺癌患者的体质，又能够与君药和臣药一同实现抗癌作用，还可以缓解和治疗乳腺癌细胞浸润到皮肤引起的皮肤瘙痒、糜烂、破溃等症。

甘草来源于为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根茎，具有补脾益气，清热解毒，调和诸药等功效。以其作为使药，能够调和诸药，缓解莪术的峻猛的药性。

药效学实验1

如图1所示，该中药组合物对乳腺癌细胞系(MDA-MB-231和MCF-7)及其衍生的耐紫杉醇细胞系(MDA-MB-231/T和MCF-7/T)的抑制作用：

紫杉醇分别在24小时(图1A)，48小时(图1B)和72小时(图1C)的不同时间点作用于各细胞系后，在亲代细胞和耐药细胞中都观察到了显著地抑制生长作用。MDA-MB-231细胞的半数抑制浓度(IC50)值为43至61μg/ml，MDA-MB-231/T为52至61μg/ml，MCF-7细胞为48至66μg/ml，而对于MCF-7/T细胞为62至77μg/ml。对于MDA-MB-231、MDA-MB-231/T、MCF-7和MCF-7/T，该中药组合物在48h的IC50值分别为约50、58、66、70μg/ml。

这些数据表明该中药组合物对紫杉醇敏感型和耐药型乳腺癌细胞具有相似的抑制作用(p>0.05)，紫杉醇耐药型乳腺癌细胞对该中药组合物的治疗依然敏感。

该中药组合物可应用于制备抑制乳腺癌细胞及紫杉醇耐药乳腺癌细胞的生长和乳腺癌肿瘤化疗药物的增敏等方面。

将该中药组合物对正常乳腺上皮细胞MCF-10A的毒性实验，经其作用48h后，MCF-10A细胞的IC50约为122μg/ml，其IC50值较乳腺癌细胞高约两倍(p≤0.01)，提示该中药组合物能够对正常乳腺上皮细胞和癌细胞发挥不同的作用，而对紫杉醇敏感型和耐药型乳腺癌细胞具有相似的细胞毒性。

该中药组合物对各组细胞的IC50值详见图1D-E。研究结果表明，该中药组合物能够显著抑制紫杉醇敏感和紫杉醇耐药的人乳腺癌细胞的生长。

药效学实验2

如图2所示，采用上述中药组合物(50μg/ml)，或加紫杉醇(50ng/ml)作用于MDA-MB-231和MCF-7细胞48小时。发现该中药组合物能够显着增强紫杉醇诱导的亲代乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7的生长抑制活性。

虽然在低浓度(≤50ng/ml)时，亲代MDA-MB-231和MCF-7细胞对紫杉醇所致细胞毒性敏感，但MDA-MB-231/T和MCF-7/T在紫杉醇给药≥100ng/ml，48h后仍然呈现较强的耐药性。而将该中药组合物给药50μg/ml，作用于耐药乳腺癌细胞时，细胞数量明显减少(图2A)。

实验还评估了该中药组合物对含有或不含紫杉醇的乳腺癌细胞集落形成能力的长期抑制作用。结果显示，联合用药组MDA-MB-231和MCF-7细胞的集落数量出现显著地减少。而在该中药组合物给药情况下，紫杉醇耐药细胞MDA-MB-231/T和MCF-7/T的生长也出现较强地抑制(图2B-C)。此外，药物外排实验结果显示，该中药组合物可以增强乳腺癌细胞对阿霉素的摄入，通过该中药组合物处理后的细胞中，阿霉素的荧光强度出现了显著地增强(图2D)。

以上结果表明，该中药组合物能够增强紫杉醇敏感型和耐药型的人乳腺癌细胞的化疗敏感性。

经药效学实验3

细胞增殖失控是癌症的标志，本实验采用碘化丙锭(PI)染色法来检测紫杉醇敏感型和耐药型细胞上的细胞周期调控。如图3所示，流式细胞分析结果显示，在单用紫杉醇、单用上述的中药组合物或联合用药，对MDA-MB-231和MCF-7的指定浓度(图3A)给药48小时后，细胞G2/M期显著增加。与紫杉醇组比较，该中药组合物对MDA-MB-231细胞的G2/M分数增加了26％，对MCF-7细胞增加了66％。此外，该中药组合物对耐药细胞MDA-MB-231/T和MCF-7/T细胞的G2/M分数分别增加了56％和63％(图3B)。

以往的研究表明，药物对细胞G2/M期的扰动很大程度上是由于DNA损伤的存在，而p-H2AX是DNA双链断裂的标志，并且已经被认为是DNA损伤修复的指标。因此，本实验采用p-H2AX抗体对各组进行了免疫荧光的测定。结果显示，在该中药组合物或紫杉醇给药后，其表达尤其是在核内的表达大大增强(图3C)。同时该中药组合物可显著增强耐药肿瘤细胞MDA-MB-231/T和MCF-7/T中的DNA损伤强度(图3D)。

这些结果揭示了该中药组合物和紫杉醇的化疗增敏作用可归因于显著的G2/M期阻滞伴随诱导DNA损伤。

药效学实验4

化疗的主要目的是使癌细胞凋亡。本实验探讨了该中药组合物是否可以通过诱导细胞凋亡的方式协同抑制乳腺癌细胞，因此采用荧光标记的Annexin V/PI双染色法，通过流式细胞技术对指定的细胞进行检测。如图4所示，在50ng/ml紫杉醇给药后，早期和晚期凋亡的MDA-MB-231和MCF-7细胞的比例分别约占20％和25％(图4A)。当与50μg/ml的该中药组合物联合用药时，早期和晚期凋亡的MDA-MB-231和MCF-7细胞的百分比分别增加至约60％和51％。流式细胞术分析还显示，该中药组合物给药后，紫杉醇耐药型乳腺癌细胞AnnexinV的荧光强度增加(图4B和4C)。50μg/ml的该中药组合物给药后，能够诱导约45％的MDA-MB-231/T细胞群细胞凋亡，而在其作用48h后，MCF-7/T细胞Annexin V+的细胞所占比例几乎达到30％(图4D)。

本实验采用Hoechst 33258染色法进一步分析该中药组合物促进乳腺癌细胞凋亡，并在荧光显微镜下观察凋亡细胞的形态学变化。Hoechst染料能够结合双链DNA富含AT的区域，增强荧光强度。紫杉醇敏感型乳腺癌细胞模型中，该中药组合物和紫杉醇联合诱导的亮蓝色更为明显，而细胞核内形态变化也更明显。在紫杉醇耐药型乳腺癌细胞模型中，在该中药组合物给药48小时后，在MDA-MB-231/T和MCF-7/T细胞中出现了典型的细胞凋亡的核形态(DNA凝聚)。典型的细胞凋亡形态学特征，如染色质浓缩和细胞固缩，在该中药组合物给药后的细胞中比用载体处理的细胞更容易观察到(图4E)。这些结果均表明该中药组合物促进了紫杉醇诱导的乳腺癌细胞凋亡。

质量控制方法

为保证生产工艺的稳定性、该中药组合物的质量和临床疗效，本实施例提供了该中药组合物的高效液相色谱法的质量控制方法。

(1)色谱条件，采用HPLC-DAD系统(Agilent 1260)用于该中药组合物的分析，色谱柱为Agilent C18column(5μm,250mm×4.6mm)，保护柱为HPLC guard cartridge system(Phenomenex,SecurityGuard)，流动相由乙腈-0.05％磷酸组成，梯度洗脱0-22min乙腈为15％，22-37min乙腈为15％-38％，37-48min乙腈为38％，48-60min乙腈为38％-60％，60-75min乙腈为60％；流速为1.0mL/min；柱温设定为30℃.DAD检测器设定波长为216nm、236nm、260nm、276nm和308nm。

(2)供试液的制备和测定，将称取的0.1g该中药组合物置于100mL锥形瓶中，精密加入20mL甲醇，超声提取60min，静置放冷，甲醇补足失重，取上清液适量，过0.22μm滤膜，制得供试液，将10μL供试品溶液注入色谱系统进行测定。

(3)对照品溶液的制备和测定，将p-香豆酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、甘草酸和莪术醇对照品用甲醇溶解为适宜浓度的对照品贮备液，再用甲醇分别稀释为不同浓度梯度，过0.22μm滤膜，制得对照品溶液，将10μL对照品溶液注入色谱系统进行测定，根据色谱峰面积和浓度绘制标准曲线，确定浓度范围。

结果发现，如图5所示，该中药组合物的对照品和供试品图谱中，p-香豆酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、甘草酸和莪术醇的色谱峰与临近峰分离度良好，在色谱图中的保留时间分别为19.2min、23.1min、25.5min、50.1min和69.5min，对照品线性范围良好，R2值均≥0.9995(附表1)，制备的5份该中药组合物的各成分含量见附表2。

附表1:本发明所述中药组合物对照品线性范围

附表2:5份所述中药组合物各成分含量测定数据

制备方法

作为一种示例，本实施例的防治乳腺癌的中药制剂的制备方法为：称取如下重量份的中药饮片：白花蛇舌草1-10份，莪术1-10份，黄芪1-10份，甘草1-10份，粉碎，提取，过滤，静置，滤液减压浓缩呈膏状，干燥，制成该中药复方制剂原料浸膏或粉末，再采用常规制剂工艺和对应的辅料，制备相应的中药制剂。

具体地，提取可以选用的溶剂是20-95％乙醇或蒸馏水，提取方式可以选择采用煎煮、渗漉、浸渍、回流或者超声提取，优选的提取次数为1-8次，进一步优选为3-5次。提取工艺优选还包括精制纯化工艺，精制纯化工艺包括萃取、大孔吸附树脂纯化、硅胶柱色谱分离等。

在一些实施方案中，中药制剂及由其精制获得的有效部位在医学上可接受载体或赋性剂制备成合剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、软膏剂、栓剂、散剂、煎膏剂、外用制剂、缓释或控释制剂。

在一些实施方案中，一些中药制剂需要加入相应的药用辅料，如填充剂、助悬剂、崩解剂、润滑剂、防腐剂、甜味剂和矫味剂等。其中，填充剂可选自淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；助悬剂可选自聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；崩解剂可选自淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂可选自硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉和二氧化硅等；粘合剂可选自淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等。

具体实施时，可参考如下实施例：

实施例1汤剂

组方：白花蛇舌草饮片15g，莪术饮片15g，黄芪饮片15g，甘草饮片15g。

制法：称取各饮片，加水1200-1800mL，浸泡半小时，煎煮1h，过滤，药渣继续煎煮2次，混合3次煎煮的滤出的药液，煎煮浓缩至1000mL。

用法用量：每日饮用1000mL(相当于60g原药)，每日三次。

实施例2颗粒剂

组方：白花蛇舌草饮片30g，莪术饮片30g，黄芪饮片30g，甘草饮片30g。

制法：称取各原料饮片，粉碎，过1号筛，分别用12倍、10倍和8倍量的95％乙醇回流提取3次，每次1h，过滤，滤液静置，取上清液，合并三次提取的上清液，减压浓缩呈膏状，挥干乙醇，获得该中药复方制剂的原料浸膏，加适宜赋性剂、矫味剂等常用辅料，制成颗粒，按单次服用量分装，即得颗粒剂。

实施例3胶囊剂

组方：白花蛇舌草饮片30g，莪术饮片30g，黄芪饮片30g，甘草饮片15g。

制法：称取各原料饮片，粉碎，过1号筛，分别用10倍的50％乙醇超声提取三次，温度设置为60℃，减压浓缩，干燥获得浸膏，加适宜常用辅料，如赋性剂、矫味剂等，制成颗粒，按照服用量分装于胶囊中，即得胶囊剂。

实施例4合剂

组方：白花蛇舌草饮片60g，莪术饮片30g，黄芪饮片30g，甘草饮片15g。

制法：称取各原料饮片，粉碎，过一号筛，分别用12-10-8倍重蒸水提取3次，每次1h，过滤，合并三次滤液，减压浓缩至一定体积，加入常规辅料(矫味剂、抑菌剂等)，按照服用量分装至相应规格容器中，即得合剂或酊剂。

实施例5片剂

组方：白花蛇舌草饮片30g，莪术饮片30g，黄芪饮片30g，甘草饮片30g。

制法：称取各原料饮片，用10倍量50％乙醇回流提取5次，每次0.5h，滤取滤液，合并滤液减压浓缩至较小体积，与常规辅料(赋性剂、崩解剂等)制成软材，压片，干燥，分装即得片剂。

当然，上述防治乳腺癌的中药组合物、上述防治乳腺癌的中药制剂的制备方法，并不局限于防治乳腺癌，也可用于其它肿瘤的防治，如前列腺癌、胆囊癌、肺癌及肝癌等。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

上面对本发明专利进行了示例性的描述，显然本发明专利的实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明专利的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进将本发明专利的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种防治肿瘤的中药组合物，其特征在于，由如下重量份比例的原料药制成：白花蛇舌草1-10份，莪术1-10份，黄芪1-10份，甘草1-10份。

2.根据权利要求1所述的一种防治肿瘤的中药组合物，其特征在于，所述白花蛇舌草、所述莪术、所述黄芪及所述甘草的重量比依次为1:1:1:1。

3.根据权利要求1所述的一种防治肿瘤的中药组合物，其特征在于，所述肿瘤的癌细胞包括紫杉醇耐药型细胞。

4.根据权利要求1所述的一种防治肿瘤的中药组合物，其特征在于，所述肿瘤的癌细胞经化疗药处理。

5.根据权利要求4所述的一种防治肿瘤的中药组合物，其特征在于，所述化疗药包括紫杉醇类、烷化剂、有机铂类、蒽环类和生物碱类化疗药中的一种或几种。

6.根据权利要求4所述的一种防治肿瘤的中药组合物，其特征在于，所述化疗药包括紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛、拉罗他赛、奥他赛、替司他赛、卡铂、顺铂、奈达铂、奥沙利铂、四硝酸铂、环磷酰胺、多柔比星、阿霉素、吡柔比星、环磷酰胺、长春新碱、尼莫司汀、苯达莫司汀、卡莫司汀、拓扑替康、贝洛替康、依托泊苷和替尼泊苷中的一种或几种。

7.根据权利要求1所述的一种防治肿瘤的中药组合物，其特征在于，该中药组合物还包括填充剂、助悬剂、崩解剂、润滑剂、防腐剂、甜味剂和矫味剂中的一种或几种。

8.根据权利要求1所述的一种防治肿瘤的中药组合物，其特征在于，该中药组合物的质量控制方法为高效液相色谱法。

9.一种防治肿瘤的中药制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)称取如下重量份比例的中药饮片：白花蛇舌草1-10份，莪术1-10份，黄芪1-10份，甘草1-10份；

2)将上述中药饮片粉碎、提取后过滤，得到滤液；

3)将上述滤液减压浓缩后干燥；

4)将步骤3)干燥所得物料制成中药制剂。