CN113648394B - 一种抗癌中药组合提取物和单味药提取物组合物及应用 - Google Patents

一种抗癌中药组合提取物和单味药提取物组合物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种由扶正抗癌方简化的抗癌中药组合物，其组合提取物和单味药提取物组合物及应用，属于抗癌中药领域。所述由扶正抗癌方简化的抗癌中药组合物包括以下重量份的组分：75份白术，150份黄芪，150份白花蛇舌草，150份龙葵和75份莪术。将所述抗癌中药组合物整体提取得到组合提取物，将所述抗癌中药组分分别提取并按一定比例混合得到所述单味药提取物组合物，本发明的由扶正抗癌方简化的抗癌中药组合物的组合提取物和单味药提取物组合物能够抑制对吉非替尼耐药的肺癌细胞的生长，且单味药提取物组合物效果更佳，它还能够显著增强吉非替尼抑制耐吉非替尼的肺癌细胞生长的能力，具有重要的临床意义。

Description

一种抗癌中药组合提取物和单味药提取物组合物及应用
技术领域
本发明涉及抗癌中药领域，具体地，涉及一种抗癌中药组合物的组合提取物和提取物组合物及其制备方法和应用。
背景技术
肺癌是一种常见的恶性肿瘤，其特征在于肺中细胞生长不受控制。根据美国国家癌症研究所和世界卫生组织的数据，肺癌是2018年与癌症相关死亡的主要原因之一。大约6.3％的男女一生中都会被诊断出患有肺癌和支气管癌。肺癌可分为小细胞肺癌或非小细胞肺癌(NSCLC)。NSCLC是小细胞肺癌以外的一种上皮癌，约占所有肺癌病例的85％。非小细胞肺癌最常见的类型包括鳞状细胞癌，大细胞癌和腺癌。非小细胞肺癌主要发生在吸烟人群中，通常表现为胸部不适或疼痛，慢性咳嗽，呼吸急促和咳血。对于大多数患者而言，NSCLC是无法治愈的，标准疗法包括化学疗法，放射疗法和靶向疗法。
在中医中，NSCLC的病因类似于任何其他形式的癌症。当健康的气(人体中的重要物质之一)不足并受到病原性的气(阻碍人体健康机制的因素)的攻击时，就会发生此类疾病。
关于在分子水平上对NSCLC病理学的生物学解释，越来越多的证据指出，表皮生长因子受体(EGFR)和间变性淋巴瘤激酶(ALK)基因的突变是NSCLC发展的驱动力(图1)。临床结果还显示，与具有EGFR突变的晚期NSCLC患者相比，采用标准的EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)一线治疗可显著提高无进展生存期(PFS)，并减少不良副作用。因此，对于晚期NSCLC的此类驱动程序突变呈阳性的患者，EGFR-TKI单一疗法已成为护理的标准。目前，有五个EGFR-TKI：吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼、达科替尼和奥西替尼可用于治疗EGFR突变的肺癌。
尽管吉非替尼已成为针对EGFR突变的非小细胞肺癌的有前景的治疗方法，但其副作用限制了治疗的剂量和持续时间。此外，部分患者倾向于对EGFR-TKI产生耐药性。
当前的研究表明，中草药是抗EGFR治疗晚期NSCLC的有效佐剂。扶正抗癌汤(FZKA)作为改善癌症患者的辅助汤剂，对患者产生积极影响。然而，对传统中药汤剂与现代草药提取物粉末混合物对疾病的治疗功效比较的研究较少。
发明内容
为了解决上述技术问题中的至少一种，本发明采用的技术方案如下：
本发明第一方面提供一种由扶正抗癌方简化的抗癌中药组合物，所述抗癌中药组合物包括以下重量份的组分：75份白术，150份黄芪，150份白花蛇舌草，150份龙葵和75份莪术。
在本发明中，组合物与混合物具有相同的含义。
在本发明中，所述扶正抗癌方包括以下重量份的组分：30份太子参，15份白术，30份黄芪，30份白花蛇舌草，30份龙葵，30份石见穿，30份山慈菇，30份薏苡仁，30份八月札，30份蛇泡勒，15份莪术，10份甘草。由此可见，本发明的抗癌中药组合物比现有技术的扶正抗癌方减少多味中药。
本发明第二方面提供本发明第一方面所述的中药组合物的组合提取物，所述组合提取物由所述的抗癌中药组合物组合在一起整体提取制备而成。
本发明第三方面提供本发明第二方面所述组合提取物的制备方法，包括：S11，取75g白术，150g黄芪，150g白花蛇舌草，150g龙葵和75g莪术混合，用10倍水煮沸2小时；
S12，再加8倍水煮沸1小时得到汤剂；
S13，将汤剂在旋转蒸发仪中蒸发，并用冷冻空气干燥器将其干燥成颗粒。
在本发明中，步骤S12中制备的汤剂也称为简化扶正抗癌汤(简化FZKA汤)。
本发明的第四方面提供一种由扶正抗癌方简化的抗癌中药组合物的单味药提取物组合物，包括以下重量份的组分：75份白术提取物，150份黄芪提取物，150份白花蛇舌草提取物，150份龙葵提取物和75份莪术提取物。
本发明的第五方面提供本发明第四方面所述的单味药提取物组合物的制备方法，包括：S21，取白术、黄芪、白花蛇舌草、龙葵、莪术，分别用10倍清水浸泡30分钟后煮沸2小时；
S22，再分别加8倍清水煮1小时；
S23，利用旋转蒸发仪将药液浓缩，得到每个单味药的粉末；
S24，将各单味药提取物粉末按质量比白术:黄芪:白花蛇舌草:龙葵:莪术＝1:2:2:2:1混合，即得到所述提取物组合物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法包括：
S21，取白术、黄芪、白花蛇舌草、龙葵、莪术各150g，分别用10倍清水浸泡30分钟后煮沸2小时；
S22，再分别加8倍清水煮1小时；
S23，利用旋转蒸发仪将药液浓缩，得到每个单味药的粉末；
S24，将各单味药提取物粉末按质量比白术:黄芪:白花蛇舌草:龙葵:莪术＝1:2:2:2:1混合，即得到所述提取物组合物。
本发明第六方面提供本发明第一方面所述的抗癌中药组合物或本发明第二方面所述的组合提取物或本发明第四方面所述的单味药提取物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
在本发明的一些实施方案中，所述癌症为非小细胞肺癌。在本发明的一些实施方案中，所述药物为治疗药物或辅助药物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述药物为与吉非替尼联用的辅助药物。
本发明的有益效果
本发明相对于现有技术，具备以下有益效果：
本发明由扶正抗癌方简化的抗癌中药组合物的组合提取物和单味药提取物组合物与现有技术的扶正抗癌方相比，对非小细胞肺癌细胞具有更好的抑制效果，其中，由扶正抗癌方简化的抗癌中药组合物的单味药提取物组合物的抑制效果最好。
本发明的由扶正抗癌方简化的抗癌中药组合物的单味药提取物组合物能够增强吉非替尼抑制耐吉非替尼的肺癌细胞生长的能力，可以与吉非替尼联用用于治疗非小细胞肺癌等癌症，具有重要的医药价格和临床推广前景。
附图说明
图1示出了FZKA汤、简化FZKA汤和简化FZKA方各单味药提取物混合物在A549和NCI-H1299细胞系中的细胞生长抑制率。*代表与FZKA汤比较p<0.05；***代表与FZKA汤比较p<0.0002。
图2示出了简化FZKA汤和单一草药成分白术(AmK)、黄芪(AmB)、白花蛇舌草(OdR)、龙葵(SnL)和莪术(CkS.G.)的细胞生长抑制率在A549和NCI-H1299细胞系中的分布。*代表与简化汤相比p<0.05；**代表与简化汤相比p<0.001；***代表与简化汤相比p<0.0002。
图3示出了简化FZKA各单味药提取物混合物和单一草药成分白术(AmK)、黄芪(AmB)、白花蛇舌草(OdR)、龙葵(SnL)和莪术(CkS.G.)的细胞生长抑制率在A549和NCI-H1299细胞系中的分布。*代表与简化FZKA单味药粉末混合物相比p<0.05；**代表与简化FZKA单味药粉末混合物相比p<0.001；***代表与简化FZKA单味药粉末混合物相比p<0.0002。
图4示出了简化的FZKA汤和简化的FZKA各单味药提取物混合物对A549和NCI-H1299细胞系的抑制作用。*代表与简化汤相比p<0.05；，**代表与简化汤相比p<0.001；***代表与简化汤相比p<0.0002。
图5示出了吉非替尼、简化FZKA汤和吉非替尼+简化FZKA汤在A549和NCI-H1299细胞系中的细胞生长抑制率。*代表与吉非替尼治疗相比，p<0.05；**代表与吉非替尼治疗相比p<0.001；***代表与吉非替尼治疗相比p<0.0002。
图6示出了吉非替尼、简化FZKA各单味药提取物混合物和吉非替尼+简化的FZKA各单味药提取物混合物在A549和NCI-H1299细胞系中的细胞生长抑制率。*代表与吉非替尼治疗相比p<0.05；**代表与吉非替尼治疗相比p<0.001；***代表与吉非替尼治疗相比p<0.0002。
具体实施方式
除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下，本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的合成技术、产物和加工设计、聚合物、共聚单体、引发剂或催化剂等的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。
本申请中的数字范围是近似值，因此除非另有说明，否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值，条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。例如，如果记载组分、物理或其它性质(如分子量，熔体指数等)是100至1000，意味着明确列举了所有的单个数值，例如100，101，102等，以及所有的子范围，例如100到166，155到170，198到200等。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数(例如1.1，1.5等)的范围，则适当地将1个单位看作0.0001，0.001，0.01或者0.1。对于包含小于10(例如1到5)的个位数的范围，通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本申请中。
关于化学化合物使用时，除非明确地说明，否则单数包括所有的异构形式，反之亦然(例如，“己烷”单独地或共同地包括己烷的全部异构体)。另外，除非明确地说明，否则用“一个”，“一种”或“该”形容的名词也包括其复数形式。
术语“包含”，“包括”，“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在，且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本申请中披露无关。为消除任何疑问，除非明确说明，否则本申请中所有使用术语“包含”，“包括”，或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反，出来对操作性能所必要的那些，术语“基本上由……组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由……组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明，否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均按照《分子克隆实验指南》(第四版)(J.萨姆布鲁克、M.R.格林，2017)一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。其他实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1简化扶正抗癌汤及其制备
1.扶正抗癌(FZKA)汤及其制备
FZKA汤处方中的成分包括：30g太子参，15g白术，30g黄芪，30g白花蛇舌草，30g龙葵，30g石见穿，30g山慈菇，30g薏苡仁，30g八月札，30g蛇泡勒，15g莪术，10g甘草。
煎煮前，将处方中的所有成分浸泡30分钟。总共310g草药使用3100mL水煮沸2小时，然后将残留的草药再与2480mL水煮沸一小时。然后将汤剂在旋转蒸发仪中蒸发，并用冷冻干燥器将其干燥成颗粒。
在体外实验中，将颗粒溶解在RPMI-1640培养基和DMEM培养基中至浓度为5mg/mL，然后在使用前用0.22μm滤器过滤除菌。
2.简化FZKA汤
简化FZKA汤是在FZKA汤的基础上改制成的，其组成为75g白术，150g黄芪，150g白花蛇舌草，150g龙葵，75g莪术。
总共600g草药使用6000mL水煮沸2小时，然后将残留的草药再与4800mL水煮沸一小时。然后将汤剂在旋转蒸发仪中蒸发，并用冷冻空气干燥器将其干燥成颗粒。
对于体外实验，将颗粒溶解在RPMI-1640培养基和DMEM培养基中至浓度为5mg/mL，然后在使用前用0.22μm滤器过滤除菌。
3.简化FZKA各单味药提取物混合物
简化FZKA单味药提取物粉末混合物由白术、黄芪、白花蛇舌草、龙葵、莪术各单味药提取物粉末混合溶解而成，其比例分别为1：2：2：2：1。
每种单味药粉均由150g草药制成：将每种中药先用10倍清水浸泡30分钟后煮沸2小时，再加8倍清水再煮一小时，然后利用旋转蒸发仪将药液浓缩，最后用冷冻干燥仪干燥成颗粒状。
在体外实验中，将颗粒溶解在RPMI-1640培养基和DMEM培养基中至5mg/mL的浓度，然后在使用前用0.22μm滤器过滤除菌。
实施例2FZKA汤、简化FZKA汤及简化FZKA各单味药提取物混合物在NSCLC的抑制
本实施例研究实施例1制备的FZKA汤、简化FZKA汤或者简化FZKA各单味药提取物粉末混合物对非小细胞肺癌的治疗作用。
1.细胞系和细胞培养
EGFR-TKI耐药A549(野生型EGFR/突变型K-Ras)和NCI-H1299(突变型EGFR/野生型K-Ras)人非小细胞肺癌细胞系购自中山大学实验动物中心(中国广州)的细胞系库和中国科学院典型培养物保藏中心(中国上海)。将所有细胞培养在包含10％FBS(Gibco)和0.5％硫酸青霉素-链霉素的RPIM-1640培养基和DMEM培养基中。当细胞密度达到70-80％时，用0.25％胰蛋白酶-EDTA将它们消化，收集细胞以用于以下实验。
2.细胞活性测定
使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四氮唑(MTT)测定法测量细胞活性。
将A549细胞和NCI-H1299细胞以2×103细胞/孔的密度接种在96孔板中，并在37℃的完全培养基中温育24小时，然后用递增浓度的FZKA汤或简化FZKA汤或FZKA单味药提取物粉末混合物处理72小时。
然后使用MTT测定法测量细胞活性。通过ELISA读数器(Perkin Elmer，Victor X5，Waltham，MA，USA)测定每孔在595nm处的吸光度。
3.统计分析
所有数据表示为三个独立实验的平均值±SD。各组间的差异通过单因素方差分析进行评估(GraphPad Prism 5.0软件，LaJolla，CA，美国)。如果p<0.05，则认为各组之间有显著性差异。
4.结果
4.1FZKA汤、简化FZKA汤和简化FZKA各单味药提取物混合物抑制了对吉非替尼耐药的肺癌细胞的生长
MTT法分别检测了传统的FZKA汤，简化的FZKA汤和简化的FZKA各单味药提取物混合物对A549和NCI-H1299细胞的生长的影响。如图1所示，所有候选药物均以剂量依赖性方式降低细胞活力。表1显示了药物作用72h后，抑制50％细胞生长的浓度即IC50。
表1 72h两种细胞系中传统FZKA汤，简化的FZKA汤和简化的FZKA各单味药提取物混合物的50％(IC 50)抑制浓度
Figure BDA0003262155810000081
结果表明，与传统的FZKA汤相比，简化FZKA各单味药提取物混合物在浓度为0.56mg/mL(p<0.0002)和5mg/mL(p<0.05)时具有明显更高的细胞生长抑制作用。
4.2与单一草药成分相比，简化FZKA汤和简化FZKA各单味药提取物混合物对吉非替尼耐药的肺癌细胞的生长抑制增强
发明人证明，与单一草药成分相比，简化FZKA汤剂和简化FZKA各单味药提取物混合物均表现出更好的细胞生长抑制作用(图2和图3)。这说明简化FZKA汤和简化FZKA各单味药提取物混合物均比单一草药成分对吉非替尼耐药的肺癌细胞的生长抑制能力强。
4.3简化FZKA各单味药提取物混合物在抑制吉非替尼耐药的肺癌细胞中表现出更强的抑制作用
简化FZKA各单味药提取物混合物在抑制A549和NCI-H1299细胞系中的生长方面表现更好。在0.56mg/mL的浓度下，简化FZKA单味药提取物混合物与简化FZKA汤在抑制对吉非替尼耐药的肺癌细胞生长能力差异最大(图4)。
4.4简化FZKA各单味药提取物混合物可增强吉非替尼抑制耐吉非替尼的肺癌细胞生长的能力
图5和图6表明，与仅吉非替尼相比，简化FZKA各单味药提取物混合物与吉非替尼(第一代可逆EGFR-TKI)的组合显示出对细胞生长的进一步抑制，显著性是p＜0.0002。
4.5简化FZKA各单味药提取物混合物可增强吉非替尼在耐TKI的NSCLC细胞系中的敏感性
A549和NCI-H1299细胞在外显子18至21序列中均缺乏EGFR-TK突变。因此，两种细胞系均对吉非替尼(一种表皮生长因子受体酪氨酸激酶(EGFR-TK)的特异性抑制剂)不敏感。实际上，A549具有野生型EGFR的过表达，而NCI-H1299具有低的EGFR。两种细胞系对吉非替尼的反应也存在差异。吉非替尼与简化FZKA各单味药提取物混合物联合治疗在A549和NCI-H1299细胞中的性能具有明显差异，可能是因为，具有p53无效基因型的NCI-H1299细胞比具有野生型p53的A549细胞(IC50，NCI-H1299中的40Mmol/L和A549中的5Mmol/L)对吉非替尼的耐药性更高)。
鉴于简化FZKA各单味药提取物混合物在NCI-H1299细胞中的性能优于在A549细胞中，这意味着对细胞活性的影响更大的是吉非替尼，它还诱导p53依赖性细胞凋亡，而不是简化FZKA单味药粉末混合物。但是，将吉非替尼和简化FZKA各单味药提取物混合物的联合疗法与吉非替尼的单药疗法进行比较时(图6)，其性能有了显著的改善(p<0.05)。表明，简化FZKA各单味药提取物混合物能够增强吉非替尼的疗效。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (2)

1.一种抗癌中药组合物的单味药提取物组合物，其特征在于，由以下重量份的组分组成：75份白术提取物，150份黄芪提取物，150份白花蛇舌草提取物，150份龙葵提取物和75份莪术提取物，所述单味药提取物组合物为用于治疗癌症的药物，所述癌症为非小细胞肺癌，所述药物为与吉非替尼联用的辅助药物。
2.一种权利要求1所述的单味药提取物组合物的制备方法，其特征在于，包括：
步骤1，取白术、黄芪、白花蛇舌草、龙葵、莪术，分别用10倍清水浸泡30分钟后煮沸2小时；
步骤2，再分别加8倍清水煮1小时；
步骤3，利用旋转蒸发仪将药液浓缩，得到每个单味药的粉末；
步骤4，将各单味药提取物粉末按质量比白术:黄芪:白花蛇舌草:龙葵:莪术=1:2:2:2:1混合，即得到所述单味药提取物组合物。
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