CN106668041A - 重楼皂苷vi在制备抗肺癌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及含有机有效成分的医药配制品,具体涉及重楼皂苷VI在制备抗肺癌药物中的应用。本发明所述的重楼皂苷VI对肺癌细胞和动物移植瘤的生长具有良好的抑制作用,具体表现在:(1)在体外对A549和NCI‑H1299肺癌细胞有很强的生长抑制作用;(2)能够诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞,并且对细胞凋亡和细胞周期相关的蛋白有明显影响;(3)对体内移植瘤有明显的抑制作用。
Description
技术领域:
本发明涉及含有通过配糖键与非糖化合物连接的糖基的化合物,具有涉及重楼皂苷VI,该化合物可用于制备抗肺癌的药物。
背景技术:
肺癌是全球最常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率居于各类恶性肿瘤之首,已成为严重危害人类健康和生命的疾病之一。近年来,受各种因素的影响,全球各国肺癌的发病率和死亡率都明显上升,而中国是世界上肺癌患者数量最多的国家。因此,寻求新的有效的肺癌治疗药物,进一步提高临床疗效,己成为当前迫切需要研究的问题。我国作为中草药的聚集地,有着得天独厚的优势,因此,从中草药中寻找具有高效、低毒特点的抗肿瘤药物是非常适宜的手段之一。
重楼(Rhizoma Paridis)是来源于百合科植物云南重楼或七叶一枝花的干燥根茎,在中医中药抗癌配方中的治疗具有上千年的历史,是抗癌中药配方中的常用草药。现代研究证明重楼的主要活性物质是甾体皂苷,主要包括薯蓣皂苷和偏诺皂苷两大类化合物,化合物重楼皂苷VI即是上述甾体皂苷中的一种,其化学结构式如下式(Ⅰ)所示。
目前已发现重楼皂苷VI具有抗肿瘤、消炎、抑菌、止血等多种生物活性,但尚未见该化合物治疗肺癌的报道。
发明内容:
本发明要解决的技术问题是提供重楼皂苷VI的新用途,即在制药中的新应用。
上述新用途实际上是,重楼皂苷VI在制备抗肺癌药物中的应用。
上述应用中,所述药物由重楼皂苷VI和医学上可接受的辅料组成,其中,重楼皂苷VI在药物中的质量百分含量为10%~50%。所述药物可以是常见的口服制剂,如颗粒剂、片剂或胶囊剂。
本发明所述的重楼皂苷VI对肺癌细胞和动物移植瘤的生长具有良好的抑制作用,具体表现在:(1)在体外对A549和NCI-H1299肺癌细胞有很强的生长抑制作用;(2)能够诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞,并且对细胞凋亡和细胞周期相关的蛋白有明显影响;(3)对体内移植瘤有明显的抑制作用。
附图说明
图1为重楼皂苷VI对肺癌细胞周期的阻滞情况的统计分析图,图的PVVII表示重楼皂苷VI。
图2为重楼皂苷VI诱导肺癌细胞发生凋亡的统计分析图,图的PVVII表示重楼皂苷VI。
图3为重楼皂苷VI对细胞凋亡和G2/M检查点相关蛋白的影响的统计分析图,图的PVVII表示重楼皂苷VI。
具体实施方式
下述实施例1~5所用重楼皂苷VI购于成都曼斯特生物科技有限公司。
实施例1:重楼皂苷VI对体外肺癌细胞的抑制作用
取对数生长期的肿瘤细胞,以3000/孔接种于96孔培养板中,培养过夜,细胞生长状态良好后,弃去原有的培养基,然后按照设计的药物浓度:重楼皂苷VI以0,0.78,1.56,3.12,6.25,12.5μM作用于A549和NCI-H1299细胞24,48,72h后停止培养;然后加入0.5mg/ml的MTT溶液,处理4h后,弃上清,最后加入150μl DMSO振荡混匀,置于酶标仪中测定其吸光度值(测定波长为570nm)。结果如表1所示,重楼皂苷VI可明显抑制肺癌细胞A549和NCI-H1299的增殖,具有细胞毒作用,是一种肿瘤治疗药物(IC50见表1)。
表1重楼皂苷VI对A549和NCI-H1299细胞的半数抑制率
实施例2:流式细胞仪分析重楼皂苷VI/VI对肺癌细胞周期的影响情况
取对数生长期A549和NCI-H1299细胞,以2×105/孔接种于六孔培养板中,培养过夜,弃去培养基,加入重楼皂苷VI(0,1,2,4μM),处理细胞24h后;用胰酶消化、收集细胞、离心、PBS清洗2次,再用预冷的体积分数为75%乙醇溶液混悬细胞,密封保存后置于4℃冰箱过夜。次日,离心,PBS洗1次,接着每管细胞中加入500μl PBS溶液(含有25μl PI(1mg/ml)和0.5μl RNA酶(10mg/ml),涡旋混匀,然后将细胞置于37℃避光孵育30min,充分混匀后,采用流式细胞仪检测细胞周期的分布情况,样品于l h内检测完毕。结果如图1所示,肺癌细胞经重楼皂苷VI作用后,细胞的DNA的分布表现为G2/M期细胞比率增加。
实施例3:流式细胞仪检测重楼皂苷VI的细胞凋亡情况
取对数生长期A549和NCI-H1299细胞,以2×105/孔接种于六孔培养板中,培养过夜,弃去培养基,加入重楼皂苷VI(0,1,2,4μM)处理细胞48h后,消化、收集细胞、离心、PBS清洗2次,倒掉上清液,用滤纸倒扣滤干;再用凋亡试剂盒中的l×Binding Buffer 100μl/Tube悬浮细胞,然后加入Annexin-FITC和PI各5μl/Tube,避光,室温放置15min;最后再分别加入400μl/Tube的1×Binding Buffer,充分混匀后,采用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况,样品于1h内检测完毕。结果如图2所示,肺癌细胞经重楼皂苷VI作用后,细胞的凋亡率呈现剂量依赖性增加。
实施例4:Western blotting法检测细胞凋亡和G2/M检查点相关蛋白
重楼皂苷VI(0,1,2,4μM)I(0,0.5,1,2μM)分别与A549和NCI-H1299细胞共同孵育48h后,胰酶消化、收集细胞,用RIPA裂解液提取总蛋白,然后进行蛋白定量。采用western blotting检测细胞凋亡相关蛋白Fas,DR3,DR5,DcR3,PARP,Cleaved PARP,Cleaved Caspase-3,p53和phosphor-p53及G2/M检查点相关蛋白Cyclin B1,p21Waf1/Cip1的表达情况。结果如图3所示,重楼皂苷VI能够显著性上调A549细胞中p53和p-p53的蛋白表达,下调了Cyclin B1和p21Waf1/Cip1的蛋白表达水平;而重楼皂苷VI能显著性上调NCI-H1299细胞中p21Waf1/Cip1,下调Cyclin B1。另外,重楼皂苷VI上调A549和NCI-H1299 细胞中的Fas、DR3、DR5,PARP,Cleaved PARP和Cleaved Caspase-3的蛋白表达水平,降低DcR3的蛋白表达水平。
实施例5:建立裸鼠移植瘤模型研究重楼皂苷VI对移植瘤生长的影响
建立人非小细胞肺癌A549细胞裸鼠移植瘤模型:选用4到6周的雌性BALB/c nu/nu小鼠,将肿瘤细胞制成悬液,然后按照细胞数为2×106/只接种于裸鼠的右侧腋窝下。每周称量2~3次体重和用游标卡尺测量2~3次肿瘤的大小。然后按照以下公式计算肿瘤体积:Tumor Volume(TV)=1/2×(L×W2),其中L是肿瘤纵轴的长度,W是肿瘤横轴的长度,并绘制裸鼠肿瘤的生长曲线。当肿瘤的平均体积达到约100mm3时,将裸鼠随机分为8个组,每组8只。按照如下方案给药:空白对照组(0.9%生理盐水);重楼皂苷VI的高、中、低剂量组(4、3、2mg/kg)。裸鼠每周腹腔注射给药5次,持续给药4周。给药结束后,处死裸鼠,然后取出肿瘤组织冻存于-80℃。部分肿瘤组织用RIPA裂解液裂解提取总蛋白,然后进行蛋白定量。采用western blotting方法检测细胞凋亡相关蛋白DR3,DR5,p53和G2/M检查点相关蛋白Cyclin B1,p21Waf1/Cip1的表达情况。结果如下表2和图3所示,重楼皂苷VI能够显著性抑制A549裸鼠移植瘤的生长,具有体内抗肿瘤活性。
表2重楼皂苷VI处理4周后各组裸鼠体重变化、肿瘤体积生长曲线、肿瘤重量和抑瘤率(Mean±SD)
Claims (3)
1.重楼皂苷VI在制备抗肺癌药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述药物由重楼皂苷VI和医学上可接受的辅料组成,其中,重楼皂苷VI在药物中的质量百分含量为10%~50%。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述药物为颗粒剂、片剂或胶囊剂。
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