CN103893412A

CN103893412A - 一种抗肿瘤裸花紫珠提取物及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN103893412A
Application number: CN201310724691.5A
Authority: CN
Inventors: 冯世秀; 易博; 陈涛; 徐文彤; 张旻; 张力军
Original assignee: 187 CENTRAL HOSPITAL OF CHINESE PLA; XIANHU BOTONICAL GARDEN ADMINISTRATIVE DIVISION SHENZHEN CITY
Current assignee: 187 CENTRAL HOSPITAL, PLA; Shenzhen Xianhu Botanical Garden (Shenzhen Garden Research Center)
Priority date: 2013-12-24
Filing date: 2013-12-24
Publication date: 2014-07-02
Anticipated expiration: 2033-12-24
Also published as: CN103893412B

Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤裸花紫珠提取物及其制备方法和用途。将裸花紫珠药材粉碎，然后用水、乙醇或甲醇或乙醇水溶液或甲醇水溶液浸提，浸提液过滤后浓缩获得总浸膏；将总浸膏用水溶解，使之成悬浮状，再依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液浓缩后获得乙酸乙酯萃取物；将乙酸乙酯萃取物用乙醇或乙醇水溶液溶解，然后置于0～5℃冷藏，冷藏后溶液会有沉淀产生，收集沉淀部分，冷冻干燥后即为裸花紫珠提取物。裸花紫珠提取物的主要成分是倍半萜和二萜类成分，而且还有黄酮和三萜类成分，总有效成分含量相对很高，提取物的制备工艺简单，得率高。裸花紫珠提取物具有显著的抗肿瘤作用，毒性小，能够用于制备抗肿瘤药物，具有临床应用的巨大潜力。

Description

一种抗肿瘤裸花紫珠提取物及其制备方法和用途

技术领域：

本发明属于中药制药领域，具体涉及一种抗肿瘤裸花紫珠提取物及其制备方法和用途。

背景技术：

中药资源是中华民族几千年医药文化积淀所形成的国粹，是我国参与世界创新药物研发，治疗重大疾病的有利战略资源。传统中药以其丰富的化学组分和新颖的化学结构在新药创新中独领风骚，在对当前重大疾病、慢性病和老年病等的预防和治疗中发挥着独特的作用，其功能和价值往往超过西药所含有的单一的化学组分，并具有毒副作用小和不易产生耐药性的显著优势。

癌症目前已经成为威胁人类健康的首要疾病之一，循证医学证据显示癌症发病率和死亡率均呈逐年上升的态势，尤其以包括中国在内的发展中国家患病人群增长较快。临床使用的抗癌药物以化学药居多如阿霉素、顺铂、卡铂等，在临床中广泛使用，但往往其毒副作用较大，许多患者无法耐受，化疗用药过程异常痛苦，有些患者不得不被迫放弃治疗。从我国濒危保护植物云南红豆杉中分离得到的紫杉醇（Paclitaxel，别名泰素、紫素、特素）已进入国家基本药物目录，成为临床一线抗癌药物，但是珍稀的植物资源与不断上升的药物需求之间产生巨大的供需矛盾冲突。随着对传统中药化学成分的长期研究和抗癌新颖天然产物的系统筛选，科学家发现，植物提取物或称之为化合物组合物往往表现出比单体化合物更强的抗肿瘤活性。其内在原因一方面是因为化合物之间存在构效关系，具有协同增效作用；另一方面植物提取物活性成分中富含具有提高机体免疫、保护肌体细胞免受损伤的活性分子。所以，在整体上表现为提高免疫与抗肿瘤共同推进的作用，临床表现出非常好的抗肿瘤作用。我国现临床使用的大量抗肿瘤药物即是基于这一原理开发出来的。如康莱特注射液，是从薏苡里面提取的薏苡酯，主要用于原发性肺癌、肝癌、胃癌、鼻咽癌、乳腺癌、食道癌等，尤其对晚期肿瘤有治疗作用。消癌平注射液，是由乌骨藤等天然中药材提炼精制而成的纯中药制剂，主要含多糖、生物碱和皂苷类等，具有抗癌、消炎、平喘、利尿的作用。莪术油注射液和莪术油葡萄糖注射液，主要为莪术油，含莪术醇、榄香烯、莪术二酮等多种抗癌活性成分，是一种非细胞毒性广谱抗肿瘤药，适用于各种恶性肿瘤，尤其是肝癌、肺癌、皮肤癌、宫颈癌、外阴癌等。鸦胆子油乳注射液，是鸦胆子提取物中的油性成分，主含油酸等，能够抑制拓扑异构酶活性，从而抑制细胞DNA的合成，阻断癌细胞的增殖，诱导干扰素的生成，促使癌细胞的凋亡。哈特灵注射液和岩舒注射液，是由天然药物苦参提取的总碱性注射液，具有抗肿瘤、止血、止痛等作用。艾迪注射液，是黄芪、刺五加、人参等与抗癌药斑蝥素精制而成。还有以人参多糖为主要成分的安尔欣注射液、参一胶囊，白花蛇舌草注射液、复方红豆杉胶囊等，都是中药提取物抗肿瘤药物。仔细分析发现，上述抗肿瘤药物大多具有提高免疫、软坚散结、清热解毒、抗炎消肿的作用，为抗肿瘤药物的开发提供了新的方向和思路。

裸花紫珠（Callicarpa nudiflora Hook）是马鞭草科紫珠属植物，是我国海南省黎族地区常用的特色民族药，在广东和广西等省地亦有分布，以海南五指山产的为上品。裸花紫珠以地上干燥部分入药，具有止血消炎、散瘀消肿、解毒、驱风湿之功效，民间主要用于治疗创伤出血、呼吸道及消化道出血、化脓性炎症等症，外用治烧、烫伤及外伤出血。裸花紫珠收载于1977年版《中国药典》，以裸花紫珠水提物为主要成分的成药有裸花紫珠片、裸花紫珠分散片、裸花紫珠颗粒和裸花紫珠胶囊等。

对裸花紫珠的研究和专利申报主要集中在止血活性部位的发现、止血功能和止血制剂的保护等方面。裸花紫珠的化学成分和药理作用研究表明，其主要含有黄酮、鞣质、三萜类和酚类等成分，其中总黄酮提取物具有抗血栓形成、降低全血粘度、抑制血小板凝集和抗炎等作用。在临床应用中，裸花紫珠片口服对肛肠病、鼻腔鼻窦、流产和上环等术后止血作用效果显著。

然而，针对裸花紫珠抗肿瘤作用的研究目前还无相关的专利和文献报道。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种具有抗肿瘤活性的裸花紫珠提取物及其制备方法。

本发明的裸花紫珠提取物是通过以下方法制备的，该方法包括以下步骤：

a、将裸花紫珠药材粉碎，然后用水、乙醇或甲醇或乙醇水溶液或甲醇水溶液浸提，浸提液过滤后浓缩获得总浸膏；

b、将总浸膏用水溶解，使之成悬浮状，再依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液浓缩后获得乙酸乙酯萃取物；

c、将乙酸乙酯萃取物用乙醇或乙醇水溶液溶解，然后置于0～5℃冷藏，冷藏后溶液会有沉淀产生，收集沉淀部分，冷冻干燥后即为裸花紫珠提取物。

所述的浓缩优选为减压浓缩。

所述的步骤a和步骤c的乙醇水溶液优选为体积分数95%乙醇水溶液。

本发明的第二个目的是提供裸花紫珠提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述的抗肿瘤药物优选为抗肺癌、肝癌、乳腺癌、表皮瘤、鼻咽癌或白血病的药物。

本发明的裸花紫珠提取物的主要成分是倍半萜和二萜类成分，而且还有黄酮和三萜类成分，总有效成分含量相对很高，提取物的制备工艺简单，得率高。所得裸花紫珠提取物具有显著的抗肿瘤作用，毒性小，能够用于制备抗肿瘤药物，具有临床应用的巨大潜力。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：裸花紫珠提取物的制备：

将裸花紫珠药材1.0kg，粉碎，经体积分数95％乙醇水溶液于70℃水浴锅回流提取3次，每次提取1h，合并提取液并过滤，滤液于旋转蒸发仪减压浓缩获得醇提总浸膏125.0g。取总浸膏100.0g水溶解后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取分别得到石油醚萃取物ZH-Petro、乙酸乙酯萃取物ZH-EtOAc，正丁醇萃取物ZH-BuOH以及水相ZH-H₂O。其中乙酸乙酯萃取物减压浓缩后经体积分数95%的乙醇水溶液加热溶解，于4℃冰箱放置过夜，有沉淀产生，离心将沉淀与上清液分离，沉淀部分冷冻干燥后得ZH-EtOAc-Prep：25.3g，即为本实施例的裸花紫珠提取物。

实施例2：裸花紫珠提取物抗肿瘤活性测定

（1）细胞株：人肺腺癌细胞A549，人肝癌细胞HepG2，人乳腺癌细胞MCF-7，人表皮瘤细胞KB-3-1，人鼻咽癌细胞CNE，非小细胞肺癌NCI-H460，白血病细胞K562。

（2）待测样品：ZH-Petro、ZH-EtOAc、ZH-BuOH、ZH-H₂O、ZH-EtOAc-Prep，分别设置梯度浓度为200,100,50,25,12.5,6.25μg/ml。阳性对照：Doxorubicin（阿霉素）。

（3）方法：MTT法

a)收集对数生长期的肿瘤细胞以1×10⁵/mL的浓度接种于96孔板，100μL/孔，于37℃，5%CO₂培养箱中培养24h使细胞贴壁；

b)吸去上清液，加入含实验所需浓度样品液的维持液（含有待测样品），于37℃，5%CO₂培养箱中培养48h；

c)弃药液，每孔加含5mg/mL的MTT20μL，继续培养4h；

d)终止培养，弃孔内培养液，加DMSO150μL/孔，置于摇床上震荡10min，使结晶充分溶解，于酶标仪570nm处测各孔吸光值。实验同时设置调零孔（培养基，MTT，DMSO），对照孔（细胞，相同浓度的药物溶解介质DMSO，培养液，MTT，DMSO）

e)计算：细胞抑制率=[（对照-本底）-（给药-本底）]/(对照-本底)×100%.

测定结果：(IC₅₀:μg/ml)

3.抗肿瘤活性测定结果：（IC₅₀：μg/mL），具体结果如表1所示：

表1：各提取物的对肿瘤细胞的细胞毒性结果

测试样品	A549	NCI-H460	HepG2	Hela	CNE	MCF-7	K562
								ZH-Petro	>100	>100	>100	>100	>100	98.10	100.0
ZH-EtOAc	43.52	55.89	41.05	34.33	61.03	30.56	38.79
								ZH-EtOAc-prep	20.10	21.28	40.41	17.371	13.60	16.13	11.33
ZH-BuOH	90.13	88.13	>100	65.50	86.61	96.12	58.90
								ZH-H₂O	>100	>100	>100	>100	>100	>100	>100
Doxorubicin	3.6	4.5	0.6	1.2	1.3	3.1	0.5

以上结果表明，本发明的裸花紫珠提取物ZH-EtOAc-Prep对人肺腺癌细胞A549，人肝癌细胞HepG2，人乳腺癌细胞MCF-7，人表皮瘤细胞KB-3-1，人鼻咽癌细胞CNE，非小细胞肺癌NCI-H460，白血病细胞K562等有明显的抑制作用，与其他紫珠提取部位相比，具有更为强烈和集中的抗肿瘤作用。其IC₅₀值在11.33-40.41μg/mL之间。因此本发明的裸花紫珠提取物ZH-EtOAc-Prep能够用于抗肺癌、肝癌、乳腺癌、表皮瘤、鼻咽癌和白血病的药物。

实施例3：裸花紫珠提取物的小鼠体内毒性实验

1.药品：ZH-EtOAc-Prep，设置为2.0，1.0，0.5g·kg^-1三个给药浓度。

2.动物：昆明种SPF级KM小鼠，雌雄各半，体质量（20±2）g。

3.方法：小鼠在给药前和经灌胃给药后7d，分别称量体重并记录。各组数据使用SPSS19.0统计软件，检验方差齐性，并进行One-Way ANOVA分析差异的显著性，数据以

4.结果：给药7d后，计算给药前后小鼠体重的变化。将ZH-EtOAc-Prep高、中、低三个给药浓度下小鼠体重的增加值与模型组体重增加值比较，各组小鼠体重的变化没有明显区别（P＞0.05），呈平稳增长趋势。试验结果见表2。

表2：裸花紫珠提取物ZH-EtOAc-Prep对小鼠体重的影响

如表2所示，给药期间，对小鼠行为的观察发现，小鼠生理和生活情况一切正常，思维敏捷，运动活跃，睡眠正常。结果表明ZH-EtOAc-Prep在既定的给药浓度下对小鼠不存在毒副作用，具有潜在开发应用价值。

Claims

1.一种裸花紫珠提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的浓缩为减压浓缩。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤a和步骤c的乙醇水溶液为体积分数95%乙醇水溶液。

4.一种根据权利要求1或2或3所述的制备方法制备得到的裸花紫珠提取物。

5.权利要求4所述的裸花紫珠提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物为抗肺癌、肝癌、乳腺癌、表皮瘤、鼻咽癌或白血病的药物。