CN101229212A

CN101229212A - 黄褐毛忍冬总次级皂苷部位、其制备方法及抗肿瘤用途

Info

Publication number: CN101229212A
Application number: CNA2008100192843A
Authority: CN
Inventors: 李萍; 陈君; 汤丹
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2008-01-18
Filing date: 2008-01-18
Publication date: 2008-07-30

Abstract

本发明涉及天然药物领域，具体涉及黄褐毛忍冬花蕾总次级皂苷部位，本发明将黄褐毛忍冬花蕾总皂苷通过碱水解，得到了具有抗肿瘤作用的黄褐毛忍冬花蕾总次级皂苷部位。

Description

黄褐毛忍冬总次级皂苷部位、其制备方法及抗肿瘤用途

技术领域

本发明涉及天然药物领域，具体涉及黄褐毛忍冬花蕾总次级皂苷部位及其在制备抗肿瘤药物中的新用途。

背景技术

恶性肿瘤是严重危害人类健康的重大疾病之一。尽管随着现代生命科学的飞速发展，抗肿瘤药物的研发与应用取得重要进展，某些类型肿瘤的化疗取得突出的疗效；但是，目前对于大多数类型肿瘤，特别是对于发病率较高的实体性癌瘤的药物治疗效果仍难以令人满意，发现与研究新型有效的抗肿瘤药物具有极其迫切的需要。自然界植物资源丰富，是研制抗肿瘤新药的重要来源。目前用于临床的抗肿瘤药物中，来源于植物的约占1/3，包括了植物的原形成分和它们的衍生物如长春碱类、三尖杉酯碱类、鬼臼毒素类、喜树碱类、紫杉醇等。相对于人工合成的化学药物，这些天然来源的有效成分以其毒性较低的优点在肿瘤治疗中得到了大量的应用。

黄褐毛忍冬为忍冬科忍冬属植物Lonicera fulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng的干燥花蕾。其药材来源是20世纪70年代后期在黔西南州发现的忍冬属植物新种，为中国特有植物种类，主要分布于贵州、广西、云南三省且资源丰富。黄褐毛忍冬花蕾具有清热解毒、凉散风热等功效，在民间已有5代人以上的药用历史，主要用于治疗肝炎、胃病、感冒等，并有解酒的功效。黄褐毛忍冬系贵州省地方标准品种，也为贵州、广西等地区金银花商品药材主流品种之一，已被纳入2005年版《中国药典》增补版，被列为山银花药材基源植物之一。

黄褐毛忍冬花蕾中富含常春藤皂苷类成分，含量高达约20％。对黄褐毛忍冬皂苷类成分的药学研究开展得并不多。其中报道黄褐毛忍冬皂苷类成分具有良好的保肝(时京珍，刘耕陶.药学学报，1995，30(4)：311)、抗炎(刘杰，夏琍，陈秀芬.中国药理学报，1988，9(3)：395.)等药理活性。发明人前期在对黄褐毛忍冬花蕾的化学成分研究中，分离得到一个新化合物3-O-β-D-吡喃木糖基-(1→3)-a-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-a-L-吡喃阿拉伯糖基-常春藤皂苷元-28-O-β-D-吡喃木糖基(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷，命名为黄褐毛忍冬皂苷乙(fulvotomentoside B)，该化合物可作为前药转变为具有抗肿瘤活性的常春藤皂苷元-3-O-β-D-吡喃木糖基-(1→3)-a-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-a-L-吡喃阿拉伯糖苷(专利申请号200710135566.5)。

发明内容

黄褐毛忍冬总皂苷储量丰富，该部位在药材中含量高达约20％，但其活性并不明确。发明人通过碱水解将大量存在于黄褐毛忍冬花蕾中没有抗肿瘤活性的总皂苷转变成具有强抗肿瘤活性的提取物，称为黄褐毛忍冬总次级皂苷。发明人在研究中发现，当将黄褐毛忍冬总皂苷进行碱水解后，仅水解其皂苷中28位糖酯键而不破坏3位糖链，克服了酸水解目的性差、产物复杂、分离纯化困难的缺点，制备工艺简便易行，产物得率及纯度高。本发明制备的抗肿瘤活性提取物，具有来源充足、成本低、适合工业化生产的优点，拥有关阔的市场前景和开发价值。

黄褐毛忍冬总皂苷可以用现有文献报道的方法得到，也可以用以下方法制备：以黄褐毛忍冬干燥花蕾为原料，乙醇回流提取，减压浓缩，过滤或高速离心，滤液或离心上清液上大孔树脂柱，以乙醇-水系统梯度洗脱，合并50～70％乙醇洗脱液，减压蒸干即得。

上述提取用乙醇浓度优选30～90％，本发明中乙醇浓度均为体积百分比。

上述大孔树脂优选自D101、AB-8、HPD100、HPD300或D1型大孔树脂。

本发明中所述的碱水解方法可以是化学上常用的水解方法，所用的碱优选氢氧化钾或氢氧化钠。

本发明优选的碱水解方法包括：黄褐毛忍冬总皂苷提取物和1～10％氢氧化钾或氢氧化钠水溶液于水浴中温热或回流反应，冷却后加酸调pH值至3～6，然后用水饱和的正丁醇萃取，回收正丁醇至稠膏，冷冻干燥，即得。

水解时氢氧化钾或氢氧化钠水溶液的量优选黄褐毛忍冬总皂苷提取物重量的2～20倍。

优选的制备本发明黄褐毛忍冬总次级皂苷的方法如下：

1)以黄褐毛忍冬干燥花蕾为原料，以30～90％乙醇回流提取2～4次，每次3～5小时，合并提取液，减压浓缩至无醇味，过滤或高速离心，滤液或离心上清液上大孔树脂柱充分吸附后，以乙醇-水系统梯度洗脱，合并50～70％乙醇洗脱液，减压蒸干，得到黄褐毛忍冬总皂苷提取物。该提取物中总皂苷含量≥50％。

2)将1重量份黄褐毛忍冬总皂苷和2～20重量份1～10％氢氧化钾或氢氧化钠水溶液，于20～100℃水浴中温热或回流进行反应0.5～10小时。

3)冷后加酸调pH值至3～6。然后用水饱和的正丁醇萃取3次，合并萃取液，回收正丁醇至稠膏，冷冻干燥，即得黄褐毛忍冬花蕾总次级皂苷提取物。该提取物中活性总次级皂苷含量≥50％。

经药理试验证明，本发明的黄褐毛忍冬花蕾总次级皂苷提取物具有良好的抗肿瘤效果。

更优选的制备方法是：

1)取黄褐毛忍冬干燥花蕾为原料，以50～90％乙醇回流提取3次，每次4小时，合并提取液，减压浓缩至无醇味，过滤或高速离心，滤液或离心上清液上大孔树脂充分吸附后，依次用水、30％乙醇、50％乙醇液洗脱至洗脱液近无色，收集50％乙醇洗脱液，减压蒸干，得到黄褐毛忍冬总皂苷提取物。其中大孔树脂优选D101、AB-8、HPD100、HPD300或D1型大孔树脂。最优选的是D101型大孔树脂。

2)将1重量份黄褐毛忍冬总皂苷和10重量份5～10％氢氧化钾或氢氧化钠水溶液，于40～80℃水浴中温热或回流进行反应2～8小时。

3)冷后加浓盐酸调pH值至3～6。然后用水饱和的正丁醇萃取3次，合并萃取液，回收正丁醇至稠膏，冷冻干燥，即得黄褐毛忍冬花蕾总次级皂苷提取物。

经药理试验证明，本发明的黄褐毛忍冬花蕾总次级皂苷提取物具有优异的抗肿瘤活性。

下面是本发明部分药理学试验及结果：

一、本发明黄褐毛忍冬花蕾总皂苷及其总次级皂苷体外对肿瘤细胞的抑制作用：

1)细胞系与试剂：人肺癌细胞A549，Lewis肺癌细胞(LLC)，人宫颈癌细胞Hela，黑色素瘤细胞B16，乳腺癌细胞MDA-MB-231。DMEM高糖培养基购自美国Gibco公司。小牛血清、非必需氨基酸购自Hyclone公司。胰蛋白酶、MTT试剂购自Sigma公司。

2)受试药物：黄褐毛忍冬花蕾总皂苷(I)由黄褐毛忍冬L.fulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng的花蕾提取制备。黄褐毛忍冬总次级皂苷(II)由总皂苷碱水解制备。阳性对照药物为阿霉素(Doxorubicin)。

3)细胞培养：5种肿瘤细胞均用含10％小牛血清的DMEM培养液于37℃，5％CO₂及饱和湿度条件下培养。取对数生长期状态良好的细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，计数约5×10⁴个/mL，按每孔5000个细胞取细胞悬液接种入96孔板，100μL/孔，置于细胞培养箱内培养24小时；给药组用不同浓度的I或II处理，药物终浓度为12.5，25，50，100，200，400，800μg/mL。同时以含0.02％二甲亚砜的培养液为阴性对照组，以阿霉素为阳性对照组，每组6个复孔。培养36小时后，观察细胞形态，每孔加MTT溶液(5mg/mL)10μL，37℃下孵育4小时后，小心吸弃孔内培养上清，每孔加入200μL DMSO，振荡3min，使结晶充分溶解。选择570nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值(OD值)，取3个复孔OD值平均数，按下式计算细胞抑制率：

细胞抑制率(％)＝(阴性对照组OD值-受试物组OD值)/阴性对照组OD值×100％

结果见表1。表1显示黄褐毛忍冬总皂苷不显示抗肿瘤活性，但不同浓度的黄褐毛忍冬总次级皂苷对5种癌细胞均具备较强的生长抑制作用。

表1黄褐毛忍冬总皂苷及其碱水解产物总次级皂苷对不同肿瘤细胞系的ED₅₀(ug/mL)

	A549	LLC	Hela	B16	MDA-MB-231
	A549	LLC	Hela	B16	MDA-MB-231	黄褐毛忍冬总皂苷黄褐毛忍冬总次级皂苷阿霉素	＞40042.50.84	＞40029.21.32	＞40051.2未测	＞40050.00.12	＞40035.4未测

二、本发明黄褐毛忍冬总次级皂苷体内抗肿瘤药效学研究

1)肿瘤动物模型的建立：雌性C57BL/6J小鼠，6～8周龄，一级，体重18±2g。本实验建立的实体瘤模型为Lewis肺癌模型。取指数生长期的肿瘤细胞，经胰酶消化后，用PBS洗两遍，将细胞皮下注射到C57BL/6J小鼠右侧背部皮下，LLC肿瘤模型每只小鼠接种1×10⁶个肿瘤细胞(50μ1)，约5天后可见原位肿瘤，待肿瘤直径达5mm左右时将动物随机分为3组，即黄褐毛忍冬总次级皂苷组(分别为40，80，160mg/kg)、阿霉素组(4mg/kg)和对照组(Control)，使每组小鼠达到8只以上。每日腹腔注射给药1次，持续7天，对照组于腹腔内注射等体积PBS。

2)药品黄褐毛忍冬总次级皂苷由黄褐毛忍冬总皂苷碱水解制备。阳性对照药物为阿霉素。

3)肿瘤测量和体积计算：用游标卡尺测量小鼠皮下肿瘤，每3天测量一次，分别量取肿瘤的长径(L)和短径(W)，根据公式V＝L×W²×0.52计算肿瘤体积。按下式计算抑瘤率：

抑瘤率＝[(对照组平均瘤体积-实验组平均瘤体积)/对照组平均瘤体积]×100％

实验结果见表2。表2显示不同浓度的黄褐毛忍冬总次级皂苷对荷瘤小鼠的肿瘤生长均有较强的抑制作用。

表2本发明黄褐毛忍冬总次级皂苷对Lewis荷瘤小鼠肿瘤生长抑制率的影响

	n	对Lewis荷瘤小鼠的抑瘤率(％)^*
	n	对Lewis荷瘤小鼠的抑瘤率(％)^*	给药大剂量组160mg/kg给药中剂量组80mg/kg给药小剂量组40mg/kg阿霉素	8888	64.050.441.834.5

^*为观察21天的抑瘤率结果。

本发明的黄褐毛忍冬总次级皂苷可以和药学上可接受的载体混合制备成各种药物制剂，如片剂、胶囊、颗粒剂、缓释剂、注射剂、微丸等剂型。所述的药学上可接受的载体可以是：崩解剂、稀释剂、粘合剂、缓释材料等药学上常用的辅料。

具体实施方式

实施例1

黄褐毛忍冬药材(干燥花蕾)50g粉碎后，分别用10倍量90％、80％和70％乙醇各回流提取一次，每次4小时，合并三次提取液，减压浓缩至无醇；过滤或高速离心，滤液或离心上清液上D101型大孔树脂充分吸附后，依次用水、30％乙醇、50％乙醇液洗脱至洗脱液近无色，收集50％乙醇液洗脱液，减压浓缩至无醇，减压蒸干，即得黄褐毛忍冬总皂苷提取物约20g。

实施例2

取实施例1方法制备的黄褐毛忍冬总皂苷2g，加入5％NaOH溶液20mL，于60℃水浴回流提取4h，放冷，加入浓HCL调节pH值至4～5。加入水饱和正丁醇溶液(1∶1，v/v)萃取3次，合并正丁醇萃取液，减压回收溶剂至干，即得黄褐毛忍冬总次级皂苷提取物约17g。

实施例3

取实施例2方法制备的黄褐毛忍冬总次级皂苷提取物100mg，用适量注射用水溶解，加甘露醇200mg，冻干，即得注射用冻干粉。

Claims

1.一种源自黄褐毛忍冬的天然药物，其特征是：它是由黄褐毛忍冬总皂苷提取物通过碱水解而得。

2.权利要求1的天然药物，其中黄褐毛忍冬总皂苷提取物由以下方法制备：以黄褐毛忍冬干燥花蕾为原料，乙醇回流提取，减压浓缩，过滤或高速离心，滤液或离心上清液上大孔树脂柱，以乙醇-水系统梯度洗脱，合并50～70％乙醇液洗脱液，减压蒸干即得。

3.权利要求2的天然药物，其中提取用乙醇浓度是30～90％，为体积百分比。

4.权利要求2的天然药物，其中大孔树脂选自D101、AB-8、HPD100、HPD300或D1型大孔树脂。

5.权利要求1的天然药物，其中碱水解所用的碱是氢氧化钾或氢氧化钠。

6.权利要求1的天然药物，其中碱水解方法包括：黄褐毛忍冬总皂苷提取物和1～10％氢氧化钾或氢氧化钠水溶液于水浴中温热或回流反应，冷却后加酸调pH值至3～6，然后用水饱和的正丁醇萃取，回收正丁醇至稠膏，冷冻干燥，即得。

7.权利要求5的天然药物，其中氢氧化钾或氢氧化钠水溶液的量是黄褐毛忍冬总皂苷提取物重量的2～20倍。

8.一种治疗肿瘤的药物组合物，其中含有权利要求1的天然药物和药学上可接受的载体。

9.权利要求1的天然药物用于制备抗肿瘤药物的用途。