CN102133220B - 白头翁皂苷a的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种白头翁皂苷类物质的制备方法及其制剂的制备方法与其在制备治疗癌症药物中的应用。本发明涉及一种白头翁皂苷类物本身是白头翁皂苷A(Pulsatilla saponin A)或者是水解后产生白头翁皂苷A(Pulsatilla saponin A)，因而共同拥有的23-羟基齐墩果酸-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷等结构单元，因这类物质水解后都容易白头翁皂苷A，因而在人体中具有类似的治疗功效。
Description
技术领域
本发明涉及一种白头翁皂苷类物质的制备方法及其制剂的制备方法与其在制备治疗癌症药物中的应用。本发明涉及一种白头翁皂苷类物本身是白头翁皂苷A(Pulsatilla saponin A)或者是水解后产生白头翁皂苷A(Pulsatilla saponin A)，因而共同拥有的23-羟基齐墩果酸-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷等结构单元，因这类物质水解后都容易白头翁皂苷A，因而在人体中具有类似的治疗功效。
背景技术
白头翁药材取自毛茛科白头翁属植物白头翁(Pulsatilla chinensis(Bunge)Regel)的干燥根，味苦，性寒。归胃、大肠经，具清热解毒，凉血止痢之功。用于热毒血痢，阴痒带下，阿米巴痢。据文献报道，白头翁中含原白头翁素(Protoanemonin)、白头翁素(Anemonin)、白头翁灵(Okinalin，C32H46O2)、白头翁英(Okinalein，C4H6O2)等，近年来国内外学者从白头翁属植物中分离鉴定出几十种五环三萜皂苷成分，这些皂苷主要为齐墩果烷型和羽扇豆烷型两种。蔡鹰等通过细胞计数法，MTT法，集落形成实验，研究了白头翁水提液和醇提液的体外抗肿瘤作用，显示水提液、醇提液有直接细胞毒作用，并和时间、剂量呈正相关，且水提液作用比醇提液强，表明白头翁抗肿瘤活性成分系水溶性物质，亦可部分溶于乙醇中。钟邱等研究了白头翁总皂苷的体外抑制肿瘤细胞生长的生物活性，发现其对人肝癌7721、人宫颈癌HeLa生长有抑制作用。
白头翁皂苷A(Pulsatilla saponin A)的化学名为23-羟基齐墩果酸-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷，其结构式如下图所示。Mimaki Y等于1999年报道白头翁皂苷A在体外对人类血癌HL-60细胞显示中等强度的抑制活性，而未进行更深入的研究。目前关于白头翁皂苷A(Pulsatilla saponin A)在任何一种癌症治疗方面的研究还没有报道，我们通过系统的体内外实验研究，首先发现其对胃癌、肝癌、肺癌等多种癌症具有良好的治疗作用。
发明内容
本发明目的是提供一种白头翁皂苷类物质的制备方法及其制剂的制备方法与其在制备治疗癌症药物中的应用。
本发明的技术方案是：
白头翁皂苷类物质在制备治疗癌症药物中的应用，其中：该白头翁皂苷类物质是白头翁皂苷A(Pulsatilla saponin A)，白头翁皂苷A(Pulsatilla saponin A)的化学名为23-羟基齐墩果酸-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷。
白头翁皂苷类物质在制备治疗癌症药物中的应用，其中：该白头翁皂苷类物质是水解后会产生白头翁皂苷A(Pulsatilla saponin A)的物质。
白头翁皂苷类物质在制备治疗癌症药物中的应用，其中：该白头翁皂苷类物质是水解后会产生白头翁皂苷A(Pulsatilla saponin A)的物质，该物质是白头翁皂苷A(Pulsatilla saponin A)的化学名为23-羟基齐墩果酸-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷中的皂苷元的第28位的羧基中的氢被脂肪链烷烃基、环链烷烃基、芳香族取代基、酰胺基中的任意一种取代。
28位羧基与脂肪链烷烃基、环链烷烃基、芳香族取代基、酰胺基形成酯键或酰胺键，易水解得到白头翁皂苷A。
白头翁皂苷类物质在制备治疗癌症药物中的应用，其中：该白头翁皂苷类物质是水解后会产生白头翁皂苷A(Pulsatilla saponin A)的物质，该物质是白头翁皂苷A(Pulsatilla saponin A)的化学名为23-羟基齐墩果酸-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷中的皂苷元的第23位的羟基中的氢被酰胺基中的任意一种取代。
23位羟基与酰胺基形成酰胺键，易水解得到白头翁皂苷A。
白头翁皂苷类物质在制备治疗癌症药物中的应用，其中：所涉及的癌症是胃癌、肝癌、肺癌中的任意一种。
白头翁皂苷类物质在制备治疗癌症药物中的应用，其中：所述药物包括口服液、片剂、胶囊、涂剂、巴布剂、喷雾剂和注射剂等各种剂型。
白头翁皂苷类物质在制备治疗癌症药物中的应用，其中：所述药物还包括各种单方和复方制剂。
白头翁皂苷A(Pulsatilla saponin A)的制备方法为：将白头翁药材粉碎成粗粉，用0-95％乙醇浸泡0.5-2h，6-12倍量加热回流提取2-3次，每次1-3h，过滤，合并滤液。上述滤液于50-70℃减压浓缩至0.5-1.0g生药材/mL，0-4℃冷藏过夜，析胶，滤过，滤渣上减压硅胶柱，上样后依次用二相或多相有机溶剂梯度洗脱，以白头翁皂苷A作为对照品TLC检测，合并相应流份。上述流份于50-70℃减压蒸干，适量乙醇溶解，滤过，减压回收乙醇至含醇量为10-40％之间，0-4℃冷藏过夜，析胶，滤过，滤液中加入适量的聚酰胺，搅拌0.5-4h，静置4-12h，滤过，滤液中再加入适量的活性炭，搅拌0.5-4h，静置4-12h，滤过，滤液用喷雾干燥法进行干燥，收集喷干粉，以10-40％乙醇重结晶，即得。
提供白头翁皂苷A(Pulsatilla saponin A)的制备方法及其在各种癌症治疗药物中的用途。所述药物包括口服液、胶囊、涂剂、巴布剂、喷雾剂和注射剂等，所述药物还包括各种单方和复方制剂。
尽管白头翁及其提取物在临床上已用于治疗用于热毒血痢，阴痒带下，阿米巴痢，但目前还没有文献报道白头翁所含单体成分白头翁皂苷A(Pulsatilla saponin A)可通过口服、鼻(口)粘膜喷雾、透皮给药和注射给药能治疗癌症，尤其是胃癌、肝癌、肺癌方面的报道。我们研究发现白头翁皂苷A(Pulsatilla saponin A)在体外对多种人源性瘤株具有较强的生物活性，尤其对胃癌、肝癌、肺癌的细胞毒活性更强，在此基础上，我们通过裸鼠动物实验系统地考察了白头翁皂苷A(Pulsatilla saponin A)对人MKN45胃癌、7402肝癌、A549肺癌裸鼠等的体内生物活性，均表现出很好的治疗作用。这一发现，将对胃癌、肝癌、肺癌的研究和药物开发产生重大的影响，并具有临床实用价值，为胃癌、肝癌、肺癌等肿瘤疾病提供新的治疗药物。
本发明的优点是：
1.白头翁皂苷A(Pulsatilla saponin A)在体内外对多种人源性瘤株均表现出较强的生物活性，尤其对胃癌、肝癌、肺癌的活性更强。
2.白头翁皂苷A(Pulsatilla saponin A)在胃癌、肝癌、肺癌等多种癌症治疗中安全性好，治疗系数(LD50/ED50)＞10。
3.白头翁皂苷A(Pulsatilla saponin A)多种给药途径包括皮肤给药、口服、口(鼻)粘膜喷雾和注射等均有效，优选注射给药途径及口服。
4.白头翁皂苷A的制备方法主要通过从天然药物中提取，为纯天然组分，具有良好的生物相容性。
附图说明
图1是白头翁皂苷A(Pulsatilla saponin A)的分子结构式；
图2是白头翁皂苷A的核磁共振碳谱图；
图3是白头翁皂苷A的核磁共振氢谱图；
图4是白头翁皂苷A的核磁共振电喷雾质谱图。
具体实施例
下面结合实施例对本发明作进一步描述：
实施例一、白头翁皂苷A的制备方法，其中：将白头翁药材粉碎成粗粉，用50％乙醇浸泡0.5h，12倍量加热回流提取3次，每次1.5h，过滤，合并滤液。上述滤液于70℃减压浓缩至1.0g生药材/mL，0-4℃冷藏过夜，析胶，滤过，收集滤渣，晾干，乙醇溶解，加入滤渣量的60-100目硅胶拌匀，常温汇干溶剂，研匀，干法上样，减压硅胶(60-100目，硅胶用量为滤渣量的20倍)柱层析，用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，以白头翁皂苷A作为对照品TLC检测，合并相应流份。上述流份于70℃减压蒸干，适量乙醇溶解，滤过，减压回收至含醇量为20％，0-4℃冷藏过夜，析胶，滤过，滤液中加入生药量5％聚酰胺，搅拌0.5-4h，静置4-12h，滤过，滤液中再加入生药量2％的活性炭，搅拌0.5-4h，静置4-12h，滤过，滤液用喷雾干燥法进行干燥，收集喷干粉，以20％乙醇重结晶，即得。采用上述方法制备白头翁皂苷A的得率约为0.05-0.1g/kg药材，经HPLC检测纯度为98.2％，
其中：白头翁皂苷A(Pulsatilla saponin A)的化学名为23-羟基齐墩果酸-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷。
色谱条件：色谱柱：Diamonsil C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：甲醇-水(75∶25)；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；进样量20ml；ELSD检测器：SHIMADZU ELSD-LT Ⅱ型检测器；检测温度：40℃；ELSD载气：高纯氮气：载气压力：0.35MPa。
实施例二、白头翁皂苷A的制备方法，其中：将白头翁药材粉碎成粗粉，用50％乙醇浸泡0.5h，12倍量加热回流提取3次，每次1.5h，过滤，合并滤液。上述滤液于70℃减压浓缩至1.0g生药材/mL，0-4℃冷藏过夜，析胶，滤过，收集滤渣，晾干，乙醇溶解，加入滤渣量的60-100目硅胶拌匀，常温汇干溶剂，研匀，干法上样，减压硅胶(60-100目，硅胶用量为滤渣量的20倍)柱层析，用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，以白头翁皂苷A作为对照品TLC检测，合并相应流份。上述流份于70℃减压蒸干，适量乙醇溶解，滤过，减压回收至含醇量为20％，0-4℃冷藏过夜，析胶，滤过，滤液中加入生药量5％聚酰胺，搅拌0.5-4h，静置4-12h，滤过，滤液中再加入生药量2％的活性炭，搅拌0.5-4h，静置4-12h，滤过，滤液用喷雾干燥法进行干燥，收集喷干粉，以30％乙醇重结晶，即得。采用上述方法制备白头翁皂苷A的得率约为0.05-0.1g/kg药材，经HPLC检测纯度为95％。
其中：白头翁皂苷A(Pulsatilla saponin A)的化学名为23-羟基齐墩果酸-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷。
色谱条件：色谱柱：Diamonsil C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：甲醇-水(75∶25)；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；进样量20ml；ELSD检测器：SHIMADZU ELSD-LT Ⅱ型检测器；检测温度：40℃；ELSD载气：高纯氮气：载气压力：0.35MPa。
实施例三、白头翁皂苷A的制备方法，其中：将白头翁药材粉碎成粗粉，用50％乙醇浸泡0.5h，12倍量加热回流提取3次，每次1.5h，过滤，合并滤液。上述滤液于70℃减压浓缩至1.0g生药材/mL，0-4℃冷藏过夜，析胶，滤过，收集滤渣，晾干，乙醇溶解，加入滤渣量的60-100目硅胶拌匀，常温汇干溶剂，研匀，干法上样，减压硅胶(60-100目，硅胶用量为滤渣量的20倍)柱层析，用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，以白头翁皂苷A作为对照品TLC检测，合并相应流份。上述流份于70℃减压蒸干，适量乙醇溶解，滤过，减压回收至含醇量为20％，0-4℃冷藏过夜，析胶，滤过，滤液中加入生药量5％聚酰胺，搅拌0.5-4h，静置4-12h，滤过，滤液中再加入生药量2％的活性炭，搅拌0.5-4h，静置4-12h，滤过，滤液用喷雾干燥法进行干燥，收集喷干粉，以40％乙醇重结晶，即得。采用上述方法制备白头翁皂苷A的得率约为0.05-0.1g/kg药材，经HPLC检测纯度为94.4％。
其中：白头翁皂苷A(Pulsatilla saponin A)的化学名为23-羟基齐墩果酸-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷。
色谱条件：色谱柱：Diamonsil C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：甲醇-水(75∶25)；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；进样量20ml；ELSD检测器：SHIMADZU ELSD-LT Ⅱ型检测器；检测温度：40℃；ELSD载气：高纯氮气：载气压力：0.35MPa。
实施例四-1、白头翁皂苷A的制备方法，其中：将白头翁药材粉碎成粗粉，用10％乙醇浸泡0.5h，6倍量加热回流提取2次，每次1h，过滤，合并滤液。上述滤液于50℃减压浓缩至0.5g生药材/mL，0℃冷藏过夜，析胶，滤过，滤渣上减压硅胶柱，上样后依次用三氯甲烷-甲醇梯度洗脱，以白头翁皂苷A作为对照品TLC检测，合并相应流份。上述流份于50℃减压蒸干，适量乙醇溶解，滤过，减压回收乙醇至含醇量为10％之间，0℃冷藏过夜，析胶，滤过，滤液中加入适量的聚酰胺，搅拌0.5h，静置4h，滤过，滤液中再加入适量的活性炭，搅拌0.5h，静置4h，滤过，滤液用喷雾干燥法进行干燥，收集喷干粉，以10％乙醇重结晶，即得，经HPLC检测纯度为96.7％。其余同实施例1。
实施例四-2、白头翁皂苷A的制备方法，其中：将白头翁药材粉碎成粗粉，用95％乙醇浸泡2h，12倍量加热回流提取3次，每次3h，过滤，合并滤液。上述滤液于70℃减压浓缩至1.0g生药材/mL，4℃冷藏过夜，析胶，滤过，滤渣上减压硅胶柱，上样后依次用三氯甲烷-甲醇梯度洗脱，以白头翁皂苷A作为对照品TLC检测，合并相应流份。上述流份于70℃减压蒸干，适量乙醇溶解，滤过，减压回收乙醇至含醇量为40％之间，4℃冷藏过夜，析胶，滤过，滤液中加入适量的聚酰胺，搅拌4h，静置12h，滤过，滤液中再加入适量的活性炭，搅拌4h，静置12h，滤过，滤液用喷雾干燥法进行干燥，收集喷干粉，以40％乙醇重结晶，即得，经HPLC检测纯度为94.5％。其余同实施例1。
实施例四-3、白头翁皂苷A的制备方法，其中：将白头翁药材粉碎成粗粉，用50％乙醇浸泡1h，8倍量加热回流提取2.5次，每次2h，过滤，合并滤液。上述滤液于60℃减压浓缩至0.7g生药材/mL，3℃冷藏过夜，析胶，滤过，滤渣上减压硅胶柱，上样后依次用三氯甲烷-甲醇梯度洗脱，以白头翁皂苷A作为对照品TLC检测，合并相应流份。上述流份于60℃减压蒸干，适量乙醇溶解，滤过，减压回收乙醇至含醇量为30％之间，3℃冷藏过夜，析胶，滤过，滤液中加入适量的聚酰胺，搅拌3h，静置6h，滤过，滤液中再加入适量的活性炭，搅拌3h，静置6h，滤过，滤液用喷雾干燥法进行干燥，收集喷干粉，以30％乙醇重结晶，即得，经HPLC检测纯度为93.8％。其余同实施例1。
实施例五、白头翁皂苷A在制备治疗癌症药物中的应用，其中：白头翁皂苷A含量为93％以上。其余同实施例一。
实施例六、所述白头翁皂苷A制成的制剂，其中：该白头翁皂苷A中皂苷类成分与药物辅料配制成药剂学上的各种制剂。其余同实施例四至五中的任意一项。
实施例七、所述白头翁皂苷A制成的制剂，其中：该白头翁活性组分中皂苷类成分在制剂中的分散状态可以是液体，也可以是固体。其余同实施例六。
实施例八、所述的白头翁抗肿瘤活性组分，其中：该制剂的给药途径可以是口服、注射和局部给药。其余同实施例八。
实施例九、白头翁皂苷A(Pulsatilla saponin A)的制备方法，其中：将白头翁药材粉碎成粗粉，用水浸泡0.5-2h，6-12倍量水加热回流提取2次，每次1h，过滤，合并滤液。上述滤液于50℃减压浓缩至0.5g生药材/mL，0℃冷藏过夜，析胶，滤过，滤渣上减压硅胶柱，上样后依次三氯甲烷-甲醇梯度洗脱，以白头翁皂苷A作为对照品TLC检测，合并相应流份。上述流份于50℃减压蒸干，适量乙醇溶解，滤过，减压回收乙醇至含醇量为10％之间，0℃冷藏过夜，析胶，滤过，滤液中加入适量的聚酰胺，搅拌0.5h，静置4h，滤过，滤液中再加入适量的活性炭，搅拌0.5h，静置4h，滤过，滤液用喷雾干燥法进行干燥，收集喷干粉，以10％乙醇重结晶，即得。白头翁抗肿瘤活性组分中皂苷类成分含量为93.9％；白头翁抗肿瘤活性组分中皂苷类成分含量的测定方法同实施例一。
实施例十、白头翁皂苷A(Pulsatilla saponin A)的制备方法，其中：将白头翁药材粉碎成粗粉，用95％乙醇浸泡2h，12倍量加热回流提取3次，每次3h，过滤，合并滤液。上述滤液于70℃减压浓缩至1.0g生药材/mL，4℃冷藏过夜，析胶，滤过，滤渣上减压硅胶柱，上样后依次用三氯甲烷-甲醇梯度洗脱，以白头翁皂苷A作为对照品TLC检测，合并相应流份。上述流份于70℃减压蒸干，适量乙醇溶解，滤过，减压回收乙醇至含醇量为40％之间，4℃冷藏过夜，析胶，滤过，滤液中加入适量的聚酰胺，搅拌4h，静置12h，滤过，滤液中再加入适量的活性炭，搅拌4h，静置12h，滤过，滤液用喷雾干燥法进行干燥，收集喷干粉，以40％乙醇重结晶，即得。白头翁抗肿瘤活性组分中皂苷类成分含量为96.6％；白头翁抗肿瘤活性组分中皂苷类成分含量的测定方法同实施例一。
实施例十一、白头翁皂苷A(Pulsatilla saponin A)的制备方法，其中：将白头翁药材粉碎成粗粉，用75％乙醇浸泡0.9h，10倍量加热回流提取3次，每次2h，过滤，合并滤液。上述滤液于60℃减压浓缩至0.7g生药材/mL，2℃冷藏过夜，析胶，滤过，滤渣上减压硅胶柱，上样后依次用三氯甲烷-甲醇梯度洗脱，以白头翁皂苷A作为对照品TLC检测，合并相应流份。上述流份于60℃减压蒸干，适量乙醇溶解，滤过，减压回收乙醇至含醇量为20％之间，2℃冷藏过夜，析胶，滤过，滤液中加入适量的聚酰胺，搅拌2h，静置6h，滤过，滤液中再加入适量的活性炭，搅拌2h，静置8h，滤过，滤液用喷雾干燥法进行干燥，收集喷干粉，以30％乙醇重结晶，即得。白头翁抗肿瘤活性组分中皂苷类成分含量为97.7％；白头翁抗肿瘤活性组分中皂苷类成分含量的测定方法同实施例一。
实施例十二、用本发明实施例一或实施例二或实施例三或实施例四或实施例五、实施例九、实施例十、实施例十一中的方法制备的白头翁皂苷A为原料，或者其他方式获得的白头翁皂苷A为原料进行下列制剂制备。
1、片剂制备
处方(50片)：
成分 重量(g)
白头翁皂苷A 5.0
乳糖 4.8
糊精 9
微晶纤维素 6
硬脂酸镁 0.2
按照常规片剂的操作方法，以上混合均匀，湿法制粒，最后加入硬脂酸镁混合均匀压制成每片500mg。
2、胶囊制备
处方(90粒)：
成分 重量(g)
白头翁皂苷A 9
乳糖 6
糊精 9
微晶纤维素 6
按照常规片剂的操作方法，以上混合均匀，湿法制粒，灌装成胶囊，每粒300mg。
3、巴布剂制备
处方：
成分 重量(g)
白头翁皂苷A 2
聚丙烯酸酯 18
月桂氮卓酮 0.6
月桂酸 1.8
丙二醇 5.4
乙酸乙酯 15
按照通常巴布剂的做作进行，将上述搅拌均匀，涂布于聚酯防粘层上，60度干燥2分钟后，覆盖聚氨基甲酯膜背衬层，切片即可。
4、粉针剂制备
处方：
成分 重量(g)
白头翁皂苷A 0.05
盐酸 适量
甘露醇 50
按照常规冻干粉针的操作进行，将本发明白头翁皂苷A加适量注射用水溶解，加入甘露醇，定容至1000ml，调节PH值至4.0-5.5之间，除菌过滤，冷冻干燥即得。
5、水针剂的制备
白头翁皂苷A，溶于适量注射用水中，加入计量的注射用水溶性辅料，加0.1-0.5％的活性炭除去热原，调节PH至6.0-7.5，经微孔滤膜超滤后，补充注射用水至规定量，灌装于安瓿瓶中或输液瓶中，熔封/轧盖，经检验合格后，包装即得。
6、亚微乳注射剂的制备
白头翁皂苷A，溶于适量注射用水中，加入计量的注射用水溶性辅料，加0.1-0.5％的活性炭除去热原，调节PH至6.0-7.5，经微孔滤膜超滤后，补充注射用水至规定量，灌装于安瓿瓶中或输液瓶中，熔封/轧盖，经检验合格后，包装即得。
实施例十三、用本发明实施例一中的方法制备的白头翁皂苷A原料，进行抗肿瘤药效学研究。
本实验方案中涉及的PSA代表的是白头翁皂苷A。
1祛邪作用
1.1对动物移植性肿瘤的抑制作用
采用7402肝癌裸鼠、MKN45胃癌裸鼠和A549肺癌裸鼠模型，考察白头翁皂苷A(PSA)的体内抗肿瘤作用
分别将接种好的裸鼠，随机分为阳性对照组(环磷酰胺)、溶剂对照组(空白对照)、本发明白头翁皂苷A(PSA)高、中、低三个剂量组(10，20，40mg/kg)，连续腹腔注射给药10天，环磷酰胺隔天给药，连续20天，末次给药24小时后，处死动物，分离腋下肿瘤并称重，计算肿瘤抑制率。按下式计算抑瘤率：抑瘤率(％)＝[(空白对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/空白对照组平均瘤重]×100％。实验结果如下：
(1)对7402肝癌的影响：实验结果显示PSA(10，20，40mg/kg)可显著抑制裸鼠的瘤重，三个剂量抑制率分别为41.76、54.11和63.53％，均在30％以上。结果见表2。
表2白头翁皂苷A(PSA)对7402肝癌裸鼠的影响
*P＜0.05，**P＜0.01与空白对照组相比
(2)对MKN45胃癌裸鼠的影响：PSA(10，20，40mg/kg)对裸鼠瘤重均有一定的抑制作用。抑制率分别为33.14，52.66，70.41％。结果见表3。
表3 白头翁皂苷A(PSA)对MKN45胃癌裸鼠的影响
*P＜0.05，**P＜0.01与空白对照组相比
(3)对A549肺癌裸鼠的影响：第1批实验结果表明PSA(10，20，40mg/kg)对裸鼠瘤重的抑制率分别为30.82％，48.43％和61.64％，与空白对照组均有显著差异。结果见表4。
表4 白头翁皂苷A(PSA)对小鼠Lewis肺癌的影响
**P＜0.01与空白对照组相比
2扶正作用
2.1白头翁皂苷A(PSA)对荷瘤动物免疫功能的影响
实验结果提示白头翁皂苷A(PSA)可明显升高荷瘤小鼠的脾指数、脾淋巴细胞转化率和NK细胞的杀伤活性。
建立H22荷瘤小鼠动物模型，白头翁皂苷A(PSA)(10，20，40mg/kg)腹腔注射给药，连续10天，末次给药24小时后，将动物处死，取荷瘤小鼠胸腺和脾脏，称重，分别计算胸腺指数：[胸腺重(mg)/体重(g)]×10，脾指数：[脾重(mg)/体重(g)]×10。另外一部分采用MTT法做小鼠脾淋巴细胞转化试验和NK细胞活性的测定实验。
(1)对小鼠胸腺指数和脾指数的影响
与空白对照组相比，PSA(20，40mg/kg)能明显提高H22荷瘤小鼠的脾指数和胸腺指数，但环磷酰胺却明显降低脾指数和胸腺指数。提示，环磷酰胺可引起荷瘤小鼠脾和胸腺萎缩。初步说明PSA在发挥抗癌作用的同时可能提高小鼠的免疫力，结果见表7。
表7.白头翁皂苷A(PSA)对H22荷瘤小鼠免疫系统的影响
*P＜0.05，**P＜0.01，与空白对照组相比
(2)对外周血免疫细胞的影响
经计数分析，与空白对照组比较，环磷酰胺组小鼠白细胞总数、淋巴细胞和红细胞显著降低(p＜0.01)，PSA各组小鼠白细胞总数、淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞数有上升的趋势，但无显著差异(p＞0.05)。提示，环磷酰胺明显抑制小鼠免疫细胞，而PSA各组与环磷酰胺的作用明显不同，对小鼠免疫细胞无抑制作用，并有增强免疫功能的趋势。结果见表8。
表8 白头翁皂苷A(PSA)对荷瘤小鼠外周血免疫细胞的影响
*P＜0.05，与空白对照组相比
(3)对脾淋巴细胞转化功能的影响
小鼠脾淋巴细胞经刀豆蛋白刺激后细胞活性显著增高(p＜0.01)，而PSA与刀豆蛋白共刺激后细胞活性更高，与刀豆蛋白组比较差异显著(p＜0.01)。实验结果提示，PSA在体外可提高脾淋巴细胞转化效率，见表9。
表9 白头翁皂苷A(PSA)对H22荷瘤小鼠脾淋巴细胞转化功能的影响( 
n＝4)
**p＜0.05与刀豆蛋白组相比
(4)对NK细胞活性的影响
实验结果表明，PSA(2.5，5.0，10.0μg/ml)组NK活性高于正常对照组，提示PSA显著提高NK细胞的杀伤能力，其作用呈现一定的量效关系，结果见表10。
表10 PSA对NK细胞活性的影响( 
n＝4)
**p＜0.01，*p＜0.05 与空白对照组相比
3增效作用
将小鼠分为空白对照组、PSA(20mg/kg)组、环磷酰胺(30mg/kg)组及PSA(20mg/kg)+CTX(30mg/kg)合用组。取H22小鼠腹水，接种于小鼠右侧腋下，接种后随机分组，第2天起腹腔注射给药，每天1次，共10天，各组给药体积均为0.2ml/10g体重，对照组给予相同体积的蒸馏水。末次给药24h后处死动物，取瘤称重。按下式计算抑瘤率：抑瘤率(％)＝[(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重]×100％。
两药合用疗效是否增强，按Burgi修正公式：q＝E(A+B)/[EA+(1-EA)×EB]，算出q值，其中E(A+B)为两药合用疗效发生率；EA和EB分别为A药和B药单用的疗效发生率；q＝0.85～1.15，表示两药作用单纯相加；q＞1.15，表示两药有协同作用；q＜0.85，表示两药作用拮抗。实验结果如下：
PSA(20mg/kg)组单用抑瘤率分别为62.58％。环磷酰胺单用抑瘤率分别为67.48％，两药和用后抑瘤率为73.62％，提示PSA和环磷酰胺合用，两药作用单纯相加。结果见表11。
表11 白头翁皂苷A(PSA)对H22小鼠瘤重的影响
*P＜0.05，**P＜0.01，vs空白对照组相比
4.1PSA对环磷酰胺所致小鼠骨髓抑制的保护作用
与空白对照组相比，环鳞酰胺可引起骨髓有核细胞和DNA含量明显减少，呈明显的骨髓抑制作用(P＜0.01)，而PSA则能有效地保护环磷酰胺所致的骨髓抑制作用，小鼠骨髓DNA含量及有核细胞数量均可明显升高(P＜0.01)，提示，PSA对环鳞酰胺所致骨髓损伤具有一定的保护作用，见表12。
表12 白头翁皂苷A(PSA)对环磷酰胺所致小鼠骨髓抑制的保护作用(n＝8，
)
*P＜0.05，**P＜0.01，vs环磷酰胺组比较
5半数致死量
采用白头翁皂苷A粉末，用蒸馏水配制成所需浓度的溶液，采用清洁级小鼠，由苏州大学实验动物中心提供。急性毒性实验结果表明白头翁皂苷A口服时的半数致死量为1.85g/kg(n＝20)，腹腔注射时的半数致死量为0.152g/kg(n＝20)。
实施例十四、采用实施例二或实施例三或实施例四-1或实施例四-2或实施例四-3或实施例五、实施例九、实施例十、实施例十一中的方法制备的白头翁皂苷A为原料，分别进行抗肿瘤活性组分药效学研究，效果与实施例十类似。
实施例十五、白头翁皂苷类物质在制备治疗癌症药物中的应用，其中：该白头翁皂苷类物质是白头翁皂苷A(Pulsatilla saponin A)，白头翁皂苷A (Pulsatilla saponin A)的化学名为23-羟基齐墩果酸-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷。
实施例十六、皂苷类物质在制备治疗癌症药物中的应用，其中：该白头翁皂苷类物质是水解后会产生白头翁皂苷A(Pulsatilla saponin A)的物质。
实施例十七、白头翁皂苷类物质在制备治疗癌症药物中的应用，其中：该白头翁皂苷类物质是水解后会产生白头翁皂苷A(Pulsatilla saponin A)的物质，该物质是白头翁皂苷A(Pulsatilla saponin A)的化学名为23-羟基齐墩果酸-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷中的皂苷元的第28位的羧基中的氢被脂肪链烷烃基、环链烷烃基、芳香族取代基、酰胺基中的任意一种取代。
实施例十八、白头翁皂苷类物质在制备治疗癌症药物中的应用，其中：该白头翁皂苷类物质是水解后会产生白头翁皂苷A(Pulsatilla saponin A)的物质，该物质是白头翁皂苷A(Pulsatilla saponin A)的化学名为23-羟基齐墩果酸-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷中的皂苷元的第23位的羟基中的氢被酰胺基中的任意一种取代。
实施例十九、白头翁皂苷类物质在制备治疗癌症药物中的应用，其中：该白头翁皂苷类物质是水解后会产生白头翁皂苷A(Pulsatilla saponin A)的物质，该物质是白头翁皂苷A(Pulsatilla saponin A)的化学名为23-羟基齐墩果酸-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷中的皂苷元的第23位的羟基中的氢被酰胺基中的任意一种取代。
实施例二十、白头翁皂苷类物质在制备治疗癌症药物中的应用，其中：所涉及的癌症是胃癌、肝癌、肺癌中的任意一种。
实施例二十一、白头翁皂苷类物质在制备治疗癌症药物中的应用，其中：所述药物包括口服液、片剂、胶囊、涂剂、巴布剂、喷雾剂和注射剂等各种剂型。
实施例二十二、白头翁皂苷类物质在制备治疗癌症药物中的应用，其中：所述药物还包括各种单方和复方制剂。
实施例二十二、白头翁皂苷类物质在制备治疗癌症药物中的应用，其中：
在上述实施例一至二十一每一例中涉及到的有关二氯甲烷-甲醇梯度洗脱的技术内容如下：其中：采用二氯甲烷和甲醇(5∶5-10∶0)的混合液进行梯度洗脱，梯度洗脱液依次有五组，其体积配比分别为
第一组二氯甲烷5份∶甲醇5份；
第二组二氯甲烷6份∶甲醇4份；
第三组二氯甲烷7份∶甲醇3份；
第四组二氯甲烷8份∶甲醇2份；
第五组二氯甲烷10份∶甲醇0份。
实施例二十三、白头翁皂苷类物质在制备治疗癌症药物中的应用，其中：
在上述实施例一至二十一每一例中涉及到的有关二氯甲烷-甲醇梯度洗脱的技术内容如下：其中：采用三氯甲烷和甲醇(5∶5-10∶0)的混合液进行梯度洗脱，梯度洗脱液依次有五组，其体积配比分别为
第一组三氯甲烷5份∶甲醇5份；
第二组三氯甲烷6份∶甲醇4份；
第三组三氯甲烷7份∶甲醇3份；
第四组三氯甲烷8份∶甲醇2份；
第五组三氯甲烷10份∶甲醇0份。
Claims (2)
1.一种白头翁皂苷A的制备方法，其特征在于：将白头翁药材粉碎成粗粉，用50-95％乙醇浸泡0.5-2h，6-12倍量加热回流提取2-3次，每次1-3h，过滤，合并滤液；上述滤液于50-70℃减压浓缩至0.5-1.0g生药材/mL，0-4℃冷藏过夜，析胶，滤过，滤渣上减压硅胶柱，上样后依次用二氯甲烷-甲醇或三氯甲烷-甲醇梯度洗脱，以白头翁皂苷A作为对照品TLC检测，合并相应流份；上述流份于50-70℃减压蒸干，适量乙醇溶解，滤过，减压回收乙醇至含醇量为10-40％之间，0-4℃冷藏过夜，析胶，滤过，滤液中加入适量的聚酰胺，搅拌0.5-4h，静置4-12h，滤过，滤液中再加入适量的活性炭，搅拌0.5-4h，静置4-12h，滤过，滤液用喷雾干燥法进行干燥，收集喷干粉，以10-40％乙醇重结晶，即得；
其中白头翁皂苷A的化学名为23-羟基齐墩果酸-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷。
2.一种白头翁皂苷A的制备方法，其特征在于：将白头翁药材粉碎成粗粉，用50％乙醇浸泡0.5h，12倍量加热回流提取3次，每次1.5h，过滤，合并滤液。上述滤液于70℃减压浓缩至1.0g生药材/mL，0-4℃冷藏过夜，析胶，滤过，收集滤渣，晾干，乙醇溶解，加入滤渣量的60-100目硅胶拌匀，常温干溶剂，研匀，干法上样，减压硅胶，60-100目，硅胶用量为滤渣量的20倍，柱层析，用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，以白头翁皂苷A作为对照品TLC检测，合并相应流份；上述流份于70℃减压蒸干，适量乙醇溶解，滤过，减压回收至含醇量为20％，0-4℃冷藏过夜，析胶，滤过，滤液中加入生药量5％聚酰胺，搅拌0.5-4h，静置4-12h，滤过，滤液中再加入生药量2％的活性炭，搅拌0.5-4h，静置4-12h，滤过，滤液用喷雾干燥法进行干燥，收集喷干粉，以20％乙醇重结晶，即得；采用上述方法制备白头翁皂苷A的得率为0.05-0.1g/kg药材，经HPLC检测纯度为98.2％，其中：白头翁皂苷A Pulsatilla saponin A的化学名为23-羟基齐墩果酸-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷；色谱条件：色谱柱：Diamonsil C18色谱柱4.6mm×250mm，5μm；流动相：甲醇-水为75∶25；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；进样量20ml；ELSD检测器：SHIMADZU ELSD-LTII型检测器；检测温度：40℃；ELSD载气：高纯氮气：载气压力：0.35MPa。
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