CN102898496A - 一种齐墩果酸型皂苷的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种齐墩果酸型皂苷的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)选取含有齐墩果酸型皂苷的植物原料，采用水或乙醇-水混合溶剂进行提取，提取液浓缩，过滤，或经水解处理后过滤；(2)所得植物提取液采用大孔树脂进行一次或重复多次吸附，用乙醇-水混合溶媒进行梯度洗脱，收集相应目标产品洗脱部位，浓缩，干燥；(3)所得精制提取物，采用加压柱色谱，以碳十八改性硅胶为填料，适宜比例甲醇-水为流动相进行洗脱，分别收集相应目标产品流份，浓缩，干燥，即可获得纯度大于90％的相应成品。本发明工艺路线经济合理、效率高、能耗低，可实现目标产品的高效制备，溶剂便于回收和循环利用，容易实现工业化生产。

Description

一种齐墩果酸型皂苷的制备方法

技术领域

本发明属于医药和化工技术领域，具体涉及一种天然植物中齐墩果酸型皂苷的制备方法。

技术背景

齐墩果酸型皂苷是一种以齐墩果酸为苷元，3位和28位含有1-2条糖苷链取代基的五环三萜型皂苷。本类成分在多种天然植物中普遍存在，是传统药材甘草、远志、白头翁等植物中的主要有效成份和质量控制指标性成分。近年来，从常春藤、白头翁、银莲花、败酱、山萝卜等多种科属植物中发现大量齐墩果酸型皂苷，具有抗肿瘤、抗血吸虫、抗炎、抗病毒、免疫调节等多种药理活性，因而受到人们的关注。该类型单体皂苷的制备方法，成为其药理活性研究与新药开发的工作基础。

齐墩果酸型皂苷在天然植物中常以多种性质相似的同系物共同存在，并与多酚、糖类等多种成分共存，因而分离纯化工作较为困难。已公开文献中一般均采用醇提、有机溶剂萃取、反复硅胶柱层析、碳十八反相硅胶高压半制备等多种分离技术联用以获得微量单体成分，但该分离方法步骤繁杂、工作量大，效率和得率低下，难以直接作为放大制备工艺。发明人在前期工作中，系统研究了白头翁中的皂苷制备方法，如3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂苷元28-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷(简称PB5，中国专利申请号201010624574.8)、23-羟基齐墩果酸-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(简称PA，中国专利申请号201010624822.9)，银莲花中3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖齐墩果酸皂苷(简称PB7，中国专利申请号201110291139.2)，以及黄花败酱皂苷(中国专利申请号201110171840.0和201210073605.4)等的制备方法，所述方法主要包括选取药材，经乙醇提取(需要时进行碱水解)，大孔树脂精制获得总皂苷，碳十八反相硅胶多重等度洗脱制备等步骤，最终获得相应单体皂苷。上述方法基本实现了目标成分的高效制备，但在规模化放大过程中，还存在一些不足之处：(1)大孔树脂精制工艺中，提取物纯度一般大于50％，但仍含有大量杂质，影响后续反相制备工艺纯化效率，精制产品纯度有待进一步提高；(2)反相柱层析纯化工艺中，多重等度洗脱工艺步骤较繁杂，同时设备自动化程度低、缺乏监测方法，放大制备时工艺可操作性较差。通过系统研究，进一步探索可行的产业化生产工艺，是有待解决的技术难题。

发明内容

本发明的目的是提供一种纯度大于90％、易于实现产业化的齐墩果酸型皂苷制备工艺。

本发明提供的制备齐墩果酸型皂苷的方法包括以下步骤：

(1)选取含有齐墩果酸型皂苷的植物原料，采用水或乙醇-水混合溶剂进行提取，提取液合并，浓缩，过滤，或经水解处理后过滤，得植物提取液；

(2)由(1)所得植物提取液，采用预处理好的大孔树脂进行吸附，再用乙醇-水混合溶媒按0-35％、40-80％、85-100％乙醇进行梯度洗脱，分别收集含有齐墩果酸型皂苷的相应洗脱部位洗脱液，浓缩，或重复多次经大孔树脂吸附和梯度洗脱、分别收集含有齐墩果酸型皂苷的相应洗脱部位，浓缩，干燥，得精制提取物；

(3)由(2)所得精制提取物，采用加压柱色谱，以碳十八改性硅胶为填料，适宜比例甲醇-水为流动相进行洗脱，分别收集含有齐墩果酸型皂苷的相应流份，浓缩，干燥，即可获得纯度大于90％的相应齐墩果酸型皂苷成品。

所述工艺步骤(1)中所述植物原料为白头翁、常春藤、银莲花、败酱、山萝卜等属植物中的任意一种，所述植物原料部位为根、茎、叶、根茎中的任意一种或多种，特征在于该植物中含有文献中已公开的所需齐墩果酸型皂苷目标成分或其前体成分。提取溶剂为水、乙醇-水中的任意一种。所述提取方法可为回流提取、超声提取、微波辅助提取、逆流提取中的任意一种。所述提取液浓缩后，可根据需要采用文献中已公开的碱法或酶法等适当方法进行水解处理(例如中国专利申请号201110291139.2，以及03133639.6)，其中优选碱法水解。

所述工艺步骤(2)中，所述大孔树脂为苯乙烯系或丙烯酸系树脂，其中优选丙烯酸系树脂或非极性苯乙烯系树脂或弱极性苯乙烯系树脂。所述乙醇-水混合溶媒优选按0-30％、50-75％、85-95％乙醇进行梯度洗脱，其中0-30％乙醇部位用于除去水溶性杂质，60-75％和85-95％乙醇两部位用于富集目标皂苷类成分、同时进一步除去其它杂质。所述树脂具体类型和梯度洗脱具体条件和洗脱剂用量可以根据目标产品特性、采用常规方法进一步优化，例如可参考史作清等文献方法(吸附分离树脂在医药工业中的应用.北京：化学工业出版社，2008)进行工艺参数考察优化。所述含有齐墩果酸型皂苷的相应洗脱部位浓缩液可根据需要重复多次进行大孔树脂吸附和梯度洗脱过程。一般地，采用二次大孔树脂制备工艺，精制提取物中总皂苷含量即可达70％以上。

所述工艺步骤(3)中所述加压柱色谱为低压或中压或高压柱色谱，其中优选中压或高压制备色谱；所述填料为碳十八球形改性硅胶，粒径范围5-120μm，其中优选粒径范围10-80μm；所述流动相为甲醇-水，所述洗脱方法优选多重等度洗脱。所述流份可采用在线紫外检测(190-210nm检测范围)或离线的分析液相检测，其中优选在线紫外检测。一般地，根据待制备样品组成特性和液相分析结果，首先选用小于或等于目标成分等度洗脱条件的甲醇-水进行洗脱除去极性较大的杂质，再采用目标成分等度洗脱条件的甲醇-水进行洗脱以除去其它杂质、获得目标成分，最后再采用大于目标成分等度洗脱条件的甲醇-水进行色谱柱再生。通过三次等度洗脱，获得的目标产品纯度一般均大于90％。

本发明通过长期系统研究，所设计的制备技术路线有以下特色和优势：(1)采用优选的大孔树脂和梯度洗脱工艺，结合多次上柱精制技术，高效除去大量水溶性杂质，同时有效富集了富含不同极性齐墩果酸皂苷的组份，简化了后续纯化工艺负担；(2)应用加压反相制备柱色谱多重等度洗脱工序，实现了单体皂苷纯化工序的自动化和可操作性，成功获得纯度大于90％的单体成品；(3)通过提取、大孔树脂精制、反相制备色谱各单元工序的优化和集成应用，成功实现目标高纯度单体成分的高效规模化制备。本发明工艺路线经济合理、效率高、能耗低，可实现目标产品的高效制备，溶剂便于回收和循环利用，容易实现工业化生产。

本发明内容是通过大量实验研究、工艺优化分析完成的，以下述具体实施例进行说明。

具体实施方式

本发明所述的齐墩果酸皂苷是按以下实施例所表示的方法制造，所涉及到的方法是本领域的技术人员能够掌握和运用的技术手段。但以下实施例不得理解为任何意义上的对本领域发明权利要求的限制。

实施例1白头翁皂苷PB4和PB5的制备

(1)参考白头翁药材分析结果(参见舒展，中药白头翁化学成分研究2，苏州大学硕士论文，2012)，选取富含白头翁皂苷PB4[化学名：3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖羽扇豆皂苷元28-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷]和PB5的白头翁根茎药材(产地：安徽，批次PC20091101)作为原料。称取1kg白头翁饮片，用8L70％乙醇回流提取2次，每次2h，滤过，合并滤液，减压浓缩至无醇味，加适量水调整药液使每1ml药液相当于1.0g生药，备用。

(2)大孔树脂精制工艺研究

参考文献方法(史作清，施荣富，王春红等.吸附分离树脂在医药工业中的应用.北京：化学工业出版社，2008)，首先采用静态吸附-解吸附法，通过计算吸附量与解吸率来评价树脂，对常用大孔树脂进行筛选。结果见表1。结果表明：十二种树脂对PB4和PB5都能吸附与解吸附，但以丙烯酸系中极性树脂LX17和苯乙烯系XDA-8极性树脂较好。

选用丙烯酸系LX17树脂，采用动态法进一步优化洗脱溶剂梯度条件、系统体积、上样量、饱和吸附量等工艺参数。最终确定工艺为：称取LX-17树脂装柱(按干重计为1350g，1000mm×100mm i.d.，柱体积2.0L/BV)，经预处理后，取(1)中白头翁提取液(稀释为0.4g生药/mL)5500mL上柱，吸附平衡150min后，依次用水6BV，10％乙醇2BV，80％乙醇4BV，90％乙醇2BV洗脱，流速6.5L/h。其中60％乙醇洗脱部位为富含PB4和PB5的精制提取物，经HPLC检测，PB4、PB5含量分别为39.9％、12.5％，转移率分别为92.9％、86.8％。

表1常见型号树脂对PB4和PB5的最大吸附量和解吸率

(3)由(2)所得精制提取物，经聚酰胺柱脱色处理，采用高压动态轴向制备柱色谱(150cm×10cm i.d.，江苏汉邦公司HB-DAC-100型)，以碳十八改性硅胶(10μm，1.8kg，美国Dubke公司)为填料，甲醇-水进行洗脱。制备条件为：样品(12.0g)用65％甲醇100mL溶解上样，依次用65％甲醇洗脱(40min)，100％甲醇洗脱(10min)除杂，再用65％甲醇洗脱(10min)平衡再生柱子，洗脱流速300mL/min，监测波长205nm。分别收集含有齐墩果酸型皂苷的相应流份，浓缩，干燥，即可获得PB4和PB5目标成品。经HPLC检测，PB4、PB5含量分别为97.8％、98.1％，转移率分别为90.3％、85.4％。

实施例2白头翁皂苷PB3和PB7的制备

PB3化学名：3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂苷；PB3和PB7均为白头翁等植物中抗肿瘤主要活性成分。

(1)选取富含白头翁皂苷PB39和PB7前体皂苷的白头翁根茎药材(产地：辽宁，批次PC20111001)作为原料。称取30kg白头翁药材，粉碎为粗粒，用420L 75％乙醇回流提取2次，每次2h，提取液滤过，合并，减压浓缩至无醇味，加水至100L，用NaOH调节并保持pH9-11，煮沸水解6h，用1M HCl调节pH7-9，加水稀释至150L，备用。

(2)大孔树脂精制工艺

选用D101树脂柱(230cm×300mm i.d.，柱体积150L/BV)，经预处理后，取(1)中白头翁提取液上柱，依次用水6BV，35％乙醇2BV，60％乙醇4BV，95％乙醇4BV洗脱，流速1.5-2BV/h。其中60％、95％乙醇洗脱部位分别为富含PB3、PB7的部位，分别收集相应流份，浓缩，干燥，即可获得一次上柱精制的PB3、PB7提取物。经HPLC检测，PB3和PB7提取物中二者含量分别为32.1％、14.5％，转移率分别为90.2％、87.5％。

一次上柱精制的PB3、PB7提取物再分别用pH7-9水溶解，采用同一D101树脂柱二次精制。PB3、PB7提取物溶液洗脱条件均调整为依次用水4BV，35％乙醇2BV，95％乙醇4BV洗脱。分别收集90％乙醇洗脱部位相应流份，浓缩，干燥，分别获得二次上柱精制的PB3、PB7提取物。经HPLC检测，PB3、PB7提取物中二者含量分别为51.3％、22.4％，转移率分别为88.4％、92.1％。

(3)由(2)所得二次上柱精制的PB3、PB7提取物，分别经LX2000树脂柱(100cm×8cm i.d.，柱体积1.8L/BV)精制，洗脱条件为依次用水4BV，30％甲醇2BV，100％甲醇4BV洗脱。分别收集100％甲醇洗脱部位流份，浓缩，再采用实施例1所述高压动态轴向制备柱系统，甲醇-水进行洗脱，流速300mL/min，监测波长205nm。制备条件分别为：PB3提取物样品(10.0g)用65％甲醇300mL溶解上样，用65％甲醇洗脱(10min)，75％甲醇洗脱(30min)，用100％甲醇洗脱(10min)除杂，再用65％甲醇洗脱(10min)再生柱子；PB7提取物样品(10.0g)用75％甲醇300mL溶解上样，用75％甲醇洗脱(10min)，85％甲醇洗脱(30min)，用100％甲醇洗脱(10min)除杂，再用75％甲醇洗脱(10min)再生柱子。分别收集含有目标产品的相应流份，浓缩，干燥，即得。经HPLC检测，PB4和PB5产品含量分别为97.8％、98.1％，转移率分别为90.3％、85.4％。

实施例3黄花败酱皂苷BJ26的制备

BJ26化学名：3-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→4)-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃木糖齐墩果酸)28-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖，为黄花败酱、山萝卜等植物中主要成分(参见高亮，黄花败酱化学成分研究，苏州大学硕士学位论文，2011.)。

(1)提取：干燥的黄花败酱全草(产地：云南，批次120801)2.5kg，经10倍量甲醇回流提取2次，每次1.5小时，合并提取液，滤过，减压浓缩回收甲醇，加适量水稀释到12.5L，备用。

(2)精制：选用AB-8树脂柱(100cm×10cm i.d.，柱体积2.0L/BV)，经预处理后，取(1)中提取液上柱，依次用水6BV，20％乙醇3BV，75％乙醇4BV，95％乙醇2BV洗脱，流速1.5-2BV/h。其中75％乙醇洗脱部位为富含BJ26的部位，收集相应流份，浓缩，干燥，即获得一次上柱精制提取物86g。

一次上柱精制提取物再用pH7-9水溶解，采用LX2000树脂柱(100cm×8cm i.d.，柱体积1.8L/BV)精制，洗脱条件为依次用水4BV，30％甲醇3BV，100％甲醇4BV洗脱。收集100％甲醇洗脱部位相应流份，浓缩，干燥，得二次上柱精制提取物。经HPLC检测，该提取物中BJ26含量为62.4％。

(3)由(2)所得二次上柱精制提取物，采用中压反相硅胶柱进行纯化。取精制提取物20g，采用中压柱系统分离，用反相碳十八硅胶装柱(400×70mm i.d.)，样品用70％甲醇100mL溶解后上样，依次用70％甲醇(15min)、74％甲醇(40min)、100％甲醇(10min)等度洗脱，流速150mL/min，紫外210nm检测，收集相应BJ26流份，减压浓缩，干燥，得BJ26共11.4g，纯度为93.5％。

实施例4黄花败酱皂苷BJ26b的制备

BJ26b化学名：3-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→4)-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃木糖齐墩果酸，为黄花败酱中主要抗肿瘤活性成分之一。

(1)提取：取实施例3制备BJ26产品10g，用100ml 0.1M NaOH溶液溶解，煮沸水解6h，用1M HCl溶液中和至pH 6-7，备用。

(2)精制：选用AB-8树脂柱(60cm×20mm i.d.，柱体积100mL/BV)，经预处理后，取(1)中提取液上柱，依次用水6BV，30％乙醇3BV，95％乙醇2BV洗脱，收集95％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，即获得一次上柱精制提取物8.8g。

一次上柱精制提取物再用pH7-9水溶解，采用LX2000树脂柱(60cm×20mm i.d.，柱体积100mL/BV)精制，洗脱条件为依次用水4BV，30％甲醇3BV，100％甲醇4BV洗脱。收集100％甲醇洗脱部位相应流份，浓缩，干燥，得二次上柱精制提取物7.5g。经HPLC检测，该提取物中BJ26b含量为84.3％。

(3)由(2)所得二次上柱精制提取物，采用低压反相硅胶柱(23cm×40mm i.d.，80μm粒径C18)进行纯化。取精制提取物样品，用80％甲醇20mL溶解后上样，依次用80％甲醇(150mL)、87％甲醇(800mL)、100％甲醇(100min)等度洗脱，TLC和HPLC检测，收集相应BJ26b流份，减压浓缩，干燥，得BJ26b共6.3g，纯度为96.2％。

Claims (9)

1.一种齐墩果酸型皂苷的制备方法，其特征在于所述的制备方法步骤如下：

(1)选取含有齐墩果酸型皂苷的植物原料，采用水或乙醇-水混合溶剂进行提取，提取液合并，浓缩，过滤，或经水解处理后过滤，得植物提取液；

(2)由(1)所得植物提取液，采用预处理好的大孔树脂进行吸附，再用乙醇-水混合溶媒按0-35％、40-80％、85-100％乙醇进行梯度洗脱，分别收集含有齐墩果酸型皂苷的相应洗脱部位洗脱液，浓缩，或重复多次经大孔树脂吸附和梯度洗脱、分别收集含有齐墩果酸型皂苷的相应洗脱部位洗脱液后浓缩，干燥，得精制提取物；

(3)由(2)所得精制提取物，采用加压柱色谱，以碳十八改性硅胶为填料，适宜比例甲醇-水为流动相进行洗脱，分别收集含有齐墩果酸型皂苷的相应流份，浓缩，干燥，即可获得纯度大于90％的相应齐墩果酸型皂苷成品。

2.根据权利要求1所述齐墩果酸型皂苷的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中植物原料为白头翁、常春藤、银莲花、败酱、山萝卜等属植物中的任意一种，所述植物原料部位为根、茎、叶、根茎中的任意一种或多种。

3.根据权利要求1所述齐墩果酸型皂苷的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中所述提取液浓缩后，可采用碱法或酶法等适当方法进行水解处理。

4.根据权利要求1所述齐墩果酸型皂苷的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中所述大孔树脂为苯乙烯系或丙烯酸系树脂，其中优选丙烯酸系树脂。

5.根据权利要求1所述齐墩果酸型皂苷的制备方法，其特征在于其制备方法步骤(2)中所述乙醇-水混合溶媒优选按0-30％、50-75％、85-95％乙醇进行梯度洗脱。

6.根据权利要求1所述齐墩果酸型皂苷的制备方法，其特征在于其制备方法步骤(2)中所述含有齐墩果酸型皂苷的相应洗脱部位可重复多次进行大孔树脂吸附和梯度洗脱过程。

7.根据权利要求1所述齐墩果酸型皂苷的制备方法，其特征在于其制备方法步骤(3)中所述加压柱色谱优选中压或高压柱色谱，所述碳十八球形改性硅胶优选粒径范围10-80μm。

8.根据权利要求1所述齐墩果酸型皂苷的制备方法，其特征在于其制备方法步骤(3)中所述流动相为甲醇-水，所述洗脱方法优选多重等度洗脱。

9.根据权利要求1所述齐墩果酸型皂苷的制备方法，其特征在于其制备方法步骤(3)中所述含有齐墩果酸型皂苷的流份优选在线紫外检测，检测波长在190-210nm范围。