CN103351419B - 两步法同时制备长梗冬青苷和紫丁香苷的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种两步法同时制备长梗冬青苷和紫丁香苷的方法，属于天然产物提取分离技术领域，包括以下步骤：1）向救必应药材中加入体积分数为20～70%的乙醇水溶液，回流提取，收集提取液后，静置，过滤，分别收集滤液和滤渣；2）将滤渣干燥，得到长梗冬青苷粗品，将长梗冬青苷粗品纯化后，得到长梗冬青苷；3）将滤液通过大孔吸附树脂进行柱层析分离，以乙醇-水体系作为洗脱剂进行梯度洗脱，对洗脱组分浓缩、干燥，得到紫丁香苷粗品，将紫丁香苷粗品纯化后，得到紫丁香苷。本发明简单易行，分离时间短，分离效率高，产品长梗冬青苷和紫丁香苷纯度均可达到98%以上，适合大规模工业化生产。

Description

两步法同时制备长梗冬青苷和紫丁香苷的方法

技术领域

本发明属于天然产物提取分离技术领域，具体涉及一种两步法同时制备长梗冬青苷和紫丁香苷的方法。

背景技术

救必应为冬青科植物铁冬青Ilex rotunda Thunb.的干燥树皮，始载于《岭南采药录》，又名白木香、羊不吃、白沉香等。铁冬青生长于山下疏林或沟、溪边，分布于江苏、安徽、浙江、江西、福建、台湾、湖南、广东、广西、云南，为我国南方民方常用草药。具有清热解毒，利湿止痛的功效，常用于治疗暑湿发热，咽喉肿痛，湿热泻痢，脘腹胀痛，风湿痹痛，湿疹，疮疖，跌打损伤。

在救必应较多的活性成分中，尤以长梗冬青苷和紫丁香苷含量较高且活性突出。长梗冬青苷又叫具栖冬青苷、救必应甲素，是五环三萜类化合物。分子式C₃₆H₅₈O₁₆，分子量658.86，具有清热解毒，消肿止痛。用于感冒，扁桃体炎，咽喉肿痛，急性胃肠炎，风湿骨痛；外用治跌打损伤，痈疖疮疡，外伤出血，烧烫伤。另有文献报道其具有降总胆固醇和总脂的作用。紫丁香苷又叫丁香苷、刺五加苷B、祖师麻丙素、救必应乙素、救必应甲苷，是苯丙素类化合物，分子式C₁₇H₂₄O₉，分子量372.36，微溶于冷水，稍溶于丙酮，溶于热水、甲醇、乙醇，几乎不溶于乙醚、苯、氯仿，具有抗炎、镇痛和抗肿瘤作用，常用于止血和抗肝毒药。

目前，少有从救必应中同时快速提取长梗冬青苷和紫丁香苷两个成分的报道。单一成分提取工艺较多，一般从救必应、刺五加、雪莲药材中提取纯化得来，多是采用低碳醇或丙酮提取，纯化也多采用萃取或大孔树脂吸附后再硅胶柱分离，过程漫长且目标化合物损失较多，操作步骤繁多且有机试剂特别毒性试剂使用较多，对操作人员危害大，环境污染严重。

专利CN101307079公开了一种从铁冬青中提取分离紫丁香苷的方法，是将药材粉碎成细粉，用苯回流提取，将提取后的药渣晾干，加入丙酮回流提取，浓缩提取液，静置析出，用丙酮洗涤析出物，将析出物用丙酮-甲醇的混合溶液反复重结晶，最后再用甲醇重结晶，即可得到紫丁香苷的白色针晶。此法所用溶剂的毒性较大。

专利CN101033245公开了一种具栖冬青苷的制备方法及应用，是取救必应粗粉，用乙醇回流提取，获得长梗冬青苷且纯度为98％，但损失了紫丁香苷。

综上所述，在提取分离长梗冬青苷和紫丁香苷的过程中，普遍存在长梗冬青苷和紫丁香的流失大、纯化过程漫长、溶剂残留毒性大、成本较高的问题。因此，有必要寻找一种既简便又安全地提取纯化长梗冬青苷和紫丁香苷的方法。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种两步法同时制备长梗冬青苷和紫丁香苷的方法，该方法操作简单、安全有效，制备的长梗冬青苷和紫丁香苷含量大，纯度高。

本发明是通过以下技术方案来实现：

两步法同时制备长梗冬青苷和紫丁香苷的方法，包括以下步骤：

1）按1g：6～18ml的料液比，向救必应药材中加入体积分数为20～70%的乙醇水溶液，回流提取，收集提取液，浓缩至提取液浓度为0.10～0.25g/mL后，静置，然后过滤，分别收集滤液和滤渣；

2）将滤渣干燥，得到长梗冬青苷粗品，将长梗冬青苷粗品纯化后，得到长梗冬青苷；

3）将滤液通过大孔吸附树脂进行柱层析分离，以乙醇-水体系作为洗脱剂进行梯度洗脱，收集体积分数为10～50%的乙醇水溶液的洗脱组分，对该洗脱组分浓缩、干燥，得到紫丁香苷粗品，将紫丁香苷粗品纯化后，得到紫丁香苷。

步骤1）所述的回流提取次数为1～3次，每次30～120min。

步骤3）所述的大孔吸附树脂的型号为NKA-II、XDA-1、NKA-9或JTY-1。

步骤3）所述的用体积分数为10～50%的乙醇水溶液的梯度洗脱，每个梯度洗脱1～5倍柱体积。

步骤2）和3）所述的纯化采用重结晶或柱层析法对长梗冬青苷粗品及紫丁香苷粗品进行纯化。

所述的重结晶采用的溶剂为甲醇、乙醇、丙酮或它们的水溶液。

所述的重结晶是将长梗冬青苷粗品或紫丁香苷粗品溶于所述的重结晶溶剂中，在50～70℃水浴中使其达到过饱和溶液，再在室温下，静置24～60h后析出结晶，将结晶过滤、干燥，得到纯化的紫丁香苷或长梗冬青苷。

所述的柱层析法采用脱色树脂柱层析法或制备液相色谱法，且柱层析法所用的洗脱剂为体积分数为10～40％的甲醇或乙醇水溶液，制备液相色谱法是以乙腈和水按（10～40）：（60～90）的体积比配成的溶液作为流动相。

步骤1）所述的静置时间为20～30h。

所述的干燥为常压干燥、减压干燥或冷冻干燥。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明以体积分数20～70％的乙醇水溶液作为提取溶剂，对救必应进行提取，将提取液浓缩后过滤，分别回收滤渣和滤液，通过两步法同时制备长梗冬青苷和紫丁香苷，从滤渣中直接提取得到长梗冬青苷粗品，经纯化制得长梗冬青苷，将滤液用大孔吸附树脂进行柱层析分离后，经纯化得到紫丁香苷。这种两步法同时制备救必应中的主要成分的方法，能够充分利用救必应药材，同时从救必应药材中分离得到其两大主要成分长梗冬青苷和紫丁香苷，方法高效合理，与现有技术提到的需要对两种有效成分分别过柱提取的方法相比，本发明方法纯化周期短，试剂用量少，成本低。

本发明简单易行，分离时间短，分离效率高，产品长梗冬青苷和紫丁香苷纯度均可达到98%以上，适合大规模工业化生产。

附图说明

图1为对照品长梗冬青苷和紫丁香苷混合标准品的HPLC图谱；

图2为本发明实施例1制得的长梗冬青苷和紫丁香苷混合样品的HPLC图谱。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

实施例1

两步法同时制备长梗冬青苷和紫丁香苷的方法，包括以下步骤：

1）取1kg干燥的救必应药材，加入12L体积分数为40%的乙醇水溶液，回流提取3次，每次1h，合并提取液，减压浓缩回收乙醇，浓缩至提取液浓度为0.25g/mL，静置24h后，过滤，分别收集滤渣和滤液；

2）将滤渣减压干燥，得到长梗冬青苷粗品，将该粗品加入甲醇溶解后，置于60℃水浴锅中使其达到过饱和溶液，再在室温条件下静置48h，待析出结晶后，将结晶过滤，减压干燥，得到7.4g产品，经与标准品比对试验检测，参见图2，该产品为长梗冬青苷，纯度达到98.1％；

3）将步骤1）得到的滤液采用NKA-II大孔吸附树脂(0.6L，ID5cm×H65cm)进行柱层析分离，先用2倍树脂体积、体积分数为5%乙醇水溶液除杂，再用3倍树脂体积、体积分数为40%乙醇水溶液洗脱，将40%乙醇洗脱部分浓缩，干燥，得紫丁香苷粗品。将紫丁香苷粗品用乙醇溶解，置于60℃水浴锅中使其达到过饱和溶液，再于室温静置，放置48h，待析出结晶后，过滤，常压下干燥，得到2.0g产品，纯度达到98.4％。

参见图1～2，本发明制备的长梗冬青苷和紫丁香苷的HPLC图谱如图2所示，与图1的标准品的HPLC图谱比对，可见，由本发明制得的长梗冬青苷和紫丁香苷与标准品的出峰时间几近相同，紫丁香苷的出峰时间在8.8min左右，长梗冬青苷的出峰时间在25.7min左右，均与标准品接近。可见本发明方法能够同时分离得到长梗冬青苷和紫丁香苷，且分离得到的产品纯度高。

实施例2

两步法同时制备长梗冬青苷和紫丁香苷的方法，包括以下步骤：

1）取2kg干燥的救必应药材，加入12L体积分数为30%的乙醇水溶液，回流提取3次，每次1.5h，合并提取液，减压浓缩回收乙醇，浓缩至提取液浓度为0.20g/mL，静置24h后，过滤，分别收集滤渣和滤液；

2）将滤渣减压干燥，得到长梗冬青苷粗品，将该粗品加入甲醇溶解后，置于70℃水浴锅中使其达到过饱和溶液，再在室温条件下静置48h，待析出结晶后，将结晶过滤，减压干燥，得到13.1g产品，纯度达到98.1％；

3）将步骤1）得到的滤液采用经预处理的XDA-1大孔吸附树脂(1.2L，ID8cm×H50cm)进行柱层析分离，上样后，先用2倍树脂体积、体积分数为10%乙醇水溶液除杂，再用3倍树脂体积、体积分数为30%乙醇水溶液洗脱，将30%乙醇洗脱部分浓缩，干燥，得紫丁香苷粗品。将紫丁香苷粗品用10%的乙醇水溶液溶解，通过已处理好的D900脱色树脂柱，然后用30%乙醇进行洗脱，洗脱2倍柱体积，收集流出液，回收溶剂，减压干燥，得到4.2g产品，经与标准品比对试验检测为紫丁香苷，纯度达到98.1%。

实施例3

两步法同时制备长梗冬青苷和紫丁香苷的方法，包括以下步骤：

1）取2.5kg干燥的救必应药材，加入18L体积分数为40%的乙醇水溶液，回流提取3次，每次1h，合并提取液，减压浓缩回收乙醇，浓缩至提取液浓度为0.10g/mL，静置24h后，过滤，分别收集滤渣和滤液；

2）将滤渣减压干燥，得到长梗冬青苷粗品，将该粗品加入甲醇溶解后，置于50℃水浴锅中使其达到过饱和溶液，再在室温条件下静置48h，待析出结晶后，将结晶过滤，减压干燥，得到16.2g产品，纯度达到98.4％；

3）将步骤1）得到的滤液采用NKA-II大孔吸附树脂(1.5L，ID8cm×H60cm)进行柱层析分离，上样后，先用2倍树脂体积、体积分数为5%乙醇水溶液除杂，再用3倍树脂体积、体积分数为50%乙醇水溶液洗脱，将50%乙醇洗脱部分浓缩，干燥，得紫丁香苷粗品。将紫丁香苷粗品用甲醇溶解，置于60℃水浴锅中使其达到过饱和溶液，再于室温静置，放置48h，待析出结晶后，过滤，冷冻干燥，得到4.8g产品，纯度达到98.5%。

实施例4

两步法同时制备长梗冬青苷和紫丁香苷的方法，包括以下步骤：

1）取1kg干燥的救必应药材，加入18L体积分数为20%的乙醇水溶液，回流提取3次，每次0.5h，合并提取液，减压浓缩回收乙醇，浓缩至提取液浓度为0.15g/mL，静置20h后，过滤，分别收集滤渣和滤液；

2）将滤渣减压干燥，得到长梗冬青苷粗品，将长梗冬青苷粗品用制备液相色谱法进行纯化，色谱条件为：DAC-HB50动态轴向压缩制备柱；紫外检测器，检测波长210nm，流动相为乙腈：水=40：60（体积比），收集对应流分液后，浓缩、干燥，得到9.3g产品，纯度达到99.4%。

3）将步骤1）得到的滤液采用NKA-9大孔吸附树脂(0.7L，ID5cm×H65cm)进行柱层析分离，上样后，先用2倍树脂体积、体积分数为5%乙醇水溶液除杂，再用5倍树脂体积、体积分数为10%乙醇水溶液洗脱，将10%乙醇洗脱部分浓缩，干燥，得紫丁香苷粗品。将紫丁香苷粗品用甲醇溶解，置于60℃水浴锅中使其达到过饱和溶液，再于室温静置，放置48h，待析出结晶后，过滤，冷冻干燥，得到2.3g产品，纯度达到98.1%。

实施例5

两步法同时制备长梗冬青苷和紫丁香苷的方法，包括以下步骤：

1）取1kg干燥的救必应药材，加入15L体积分数为70%的乙醇水溶液，回流提取1次，提取2h，将提取液减压浓缩回收乙醇，浓缩至提取液浓度为0.23g/mL，静置30h后，过滤，分别收集滤渣和滤液；

2）将滤渣减压干燥，得到长梗冬青苷粗品，将该粗品采用D900脱色树脂柱层析法，以10～40%的甲醇水溶液为洗脱剂进行洗脱，收集的洗脱液经浓缩、干燥，得到6.3g产品，纯度达到98.5%；

3）将步骤1）得到的滤液采用XDA-1大孔吸附树脂(0.6L，ID5cm×H65cm)进行柱层析分离，上样后，先用2倍树脂体积、体积分数为5%乙醇水溶液除杂，再用1倍树脂体积、体积分数为20%乙醇水溶液洗脱，将20%乙醇洗脱部分浓缩，干燥，得紫丁香苷粗品，将紫丁香苷粗品用甲醇水溶液溶解，置于60℃水浴锅中使其达到过饱和溶液，再于室温静置，放置48h，待析出结晶后，过滤，冷冻干燥，得到2.5g产品，纯度达到98.3%。

实施例6

两步法同时制备长梗冬青苷和紫丁香苷的方法，包括以下步骤：

1）取1kg干燥的救必应药材，加入16L体积分数为40%的乙醇水溶液，回流提取2次，每次1.5h，合并提取液，减压浓缩回收乙醇，浓缩至提取液浓度为0.20g/mL，静置24h后，过滤，分别收集滤渣和滤液；

2）将滤渣常压干燥，得到长梗冬青苷粗品，将该粗品加入丙酮溶解后，置于65℃水浴锅中使其达到过饱和溶液，再在室温条件下静置48h，待析出结晶后，将结晶过滤，减压干燥，得到7.3g产品，纯度达到98.2%；

3）将步骤1）得到的滤液采用JTY-1大孔吸附树脂(0.6L，ID5cm×H65cm)进行柱层析分离，上样后，先用2倍树脂体积、体积分数为5%乙醇水溶液除杂，再用1倍树脂体积、体积分数为30%乙醇水溶液洗脱，将30%乙醇洗脱部分浓缩，干燥，得紫丁香苷粗品，将紫丁香苷粗品用制备液相色谱法进行纯化，色谱条件为：DAC-HB50动态轴向压缩制备柱；紫外检测器，检测波长265nm，流动相为乙腈：水=10：90（体积比），收集对应流分液后，浓缩、干燥，得到3.8g产品，纯度达到99.2%。

实施例7

两步法同时制备长梗冬青苷和紫丁香苷的方法，包括以下步骤：

1）取1kg干燥的救必应药材，加入12L体积分数为45%的乙醇水溶液，回流提取3次，每次提取1h，合并提取液，减压浓缩回收乙醇，浓缩至提取液浓度为0.16g/mL，静置24h后，过滤，分别收集滤渣和滤液；

2）将滤渣减压干燥，得到长梗冬青苷粗品，将该粗品加入丙酮溶解后，置于65℃水浴锅中使其达到过饱和溶液，再在室温条件下静置48h，待析出结晶后，将结晶过滤，减压干燥，得到7.8g产品，纯度达到98.2%；

3）将步骤1）得到的滤液采用NKA-II大孔吸附树脂(0.6L，ID5cm×H65cm)进行柱层析分离，上样后，先用2倍树脂体积、体积分数为5%乙醇水溶液除杂，再用1倍树脂体积、体积分数为35%乙醇水溶液洗脱，将35%乙醇洗脱部分浓缩，干燥，得紫丁香苷粗品，将紫丁香苷粗品用乙醇水溶液溶解，置于60℃水浴锅中使其达到过饱和溶液，再于室温静置，放置48h，待析出结晶后，过滤，减压干燥，得到2.7g产品，纯度达到98.5%。

综上所述，本发明的两步法同时制备长梗冬青苷和紫丁香苷的方法，简便又安全地提取从救必应药材中提取纯化得到了长梗冬青苷和紫丁香苷，解决了现有技术中普遍存在的长梗冬青苷和紫丁香苷的流失大、纯化过程漫长、溶剂残留毒性大、成本较高的问题。本发明主要具有以下优点：

1、本发明能充分利用救必应药材，对其两大主要成分长梗冬青苷和紫丁香苷进行高效合理的分离。

2、该方法简单易行，周期短，可实现大规模的产业化生产。

3、产品得率高，纯度高，长梗冬青苷和紫丁香苷的纯度均大于98%。

Claims (6)

1.两步法同时制备长梗冬青苷和紫丁香苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)按1g：6～18ml的料液比，向救必应药材中加入体积分数为40～70％的乙醇水溶液，回流提取，收集提取液，浓缩至提取液浓度为0.10～0.25g/mL后，静置，然后过滤，分别收集滤液和滤渣；

2)将滤渣干燥，得到长梗冬青苷粗品，将长梗冬青苷粗品纯化后，得到长梗冬青苷；

3)将滤液通过大孔吸附树脂进行柱层析分离，以乙醇-水体系作为洗脱剂进行梯度洗脱，收集体积分数为10～50％的乙醇水溶液的洗脱组分，对该洗脱组分浓缩、干燥，得到紫丁香苷粗品，将紫丁香苷粗品纯化后，得到紫丁香苷；

步骤2)和3)所述的纯化采用重结晶或柱层析法对长梗冬青苷粗品及紫丁香苷粗品进行纯化；

所述的重结晶采用的溶剂为甲醇、乙醇、丙酮或它们的水溶液，将长梗冬青苷粗品或紫丁香苷粗品溶于所述的重结晶溶剂中，在50～70℃水浴中使其达到过饱和溶液，再在室温下，静置24～60h后析出结晶，将结晶过滤、干燥，得到纯化的紫丁香苷或长梗冬青苷；

所述的柱层析法采用脱色树脂柱层析法或制备液相色谱法，且柱层析法所用的洗脱剂为体积分数为10～40％的甲醇或乙醇水溶液，制备液相色谱法是以乙腈和水按(10～40)：(60～90)的体积比配成的溶液作为流动相。

2.根据权利要求1所述的两步法同时制备长梗冬青苷和紫丁香苷的方法，其特征在于，步骤1)所述的回流提取次数为1～3次，每次30～120min。

3.根据权利要求1所述的两步法同时制备长梗冬青苷和紫丁香苷的方法，其特征在于，步骤2)所述的大孔吸附树脂的型号为NKA-II、XDA-1、NKA-9或JTY-1。

4.根据权利要求1所述的两步法同时制备长梗冬青苷和紫丁香苷的方法，其特征在于，步骤3)所述的用体积分数为10～50％的乙醇水溶液的梯度洗脱，每个梯度洗脱1～5倍柱体积。

5.根据权利要求1所述的两步法同时制备长梗冬青苷和紫丁香苷的方法，其特征在于，步骤1)所述的静置时间为20～30h。

6.根据权利要求1所述的两步法同时制备长梗冬青苷和紫丁香苷的方法，其特征在于，所述的干燥为常压干燥、减压干燥或冷冻干燥。