CN102627683A - 一种具有抗肿瘤作用的三萜皂苷类化合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类三萜皂苷类化合物在治疗肿瘤相关疾病方面的应用，该类化生物结构式如式(I)所示，其中各取代基R¹至R³的定义参见说明书，所述三萜皂苷类化合物可由败酱科黄花败酱等植物中经提取、碱水解、大孔树脂精制等制备工艺获得。本发明所述部分化合物对A549人非小细胞肺癌细胞、SMMC-7721人肝癌细胞、SGC-7901人胃腺癌细胞等11种人肿瘤细胞株有显著的抑制作用，具备广谱抗肿瘤效果，因而可作为药物或药用组合物用于治疗恶性肿瘤。

Description

一种具有抗肿瘤作用的三萜皂苷类化合物

技术领域

本发明涉及一种齐墩果酸型三萜皂苷类化合物及其组合物在治疗肿瘤相关疾病方面的应用，属生物医药领域。

技术背景

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的一种严重疾病，从天然产物中寻找有效的抗肿瘤药物及其先导物是一种行之有效的方法。从毛茛科白头翁属(丁秀娟，中药白头翁化学成分研究，苏州大学硕士学位论文，2010)、银莲花属(曹沛，吴凤锷，丁立生，银莲花属植物的化学及药理研究概况，天然产物研究与开发，2004，581)等传统中药中，已经报道大量具有抗肿瘤活性的三萜皂苷类成分，并发现经水解除去28-位酯糖链的齐墩果酸类成分具有更强的抗肿瘤活性。由于皂苷类成分合成较为困难，从天然植物中寻找其它活性皂苷类资源依然是目前的研究热点。

发明人在对抗肿瘤活性皂苷的系统研究工作中，发现白头翁中含有大量的抗肿瘤活性皂苷成分(Xu QM et al，Antitumor activity of Pulsatilla chinensis(Bunge)Regel saponins in humanliver tumor 7402 cells in vitro and in vivo，Phytomedicine 2012，19：293)，其活性与苷元类别、28-游离羧基、3-糖链中单糖取代基的种类和数量以及连接位置均有关。在进一步的天然活性皂苷系统筛选工作中，首次发现黄花败酱(Patrinia scabiosaefolia)中制备获得的一类皂苷也具有显著的抗肿瘤活性，从而完成了本发明。

发明内容

本发明提供一种如式(I)所示三萜皂苷类化合物：

其药学上可接受的盐，其水合物，其药物前体，或上述任一种的溶剂合物在治疗肿瘤相关疾病方面的应用，特征在于其中：

R¹选自α-OH或β-OH，

R²选自H、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖和葡萄糖基中的1-2个，

R³选自OH或甲基，

并且化合物中至少有1个木糖基。

具体地，该化合物可选自：3-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃木糖齐墩果酸，3-O-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃木糖齐墩果酸，3-O-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃阿拉伯糖齐墩果酸，3-O-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂苷，3-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→4)-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃木糖齐墩果酸，3-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→4)-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖齐墩果酸，及其药学上可接受的盐。

本发明所述化合物及其含有28-糖链的前体皂苷存在于自然界中，可由天然植物中获得，例如毛茛科白头翁属和银莲花属、败酱科植物，其中优选从败酱科植物黄花败酱或山萝卜(Scabiosa tschiliensis)中制备获得，其制备方法可参考已知文献进行，例如：(1)高亮，黄花败酱化学成分研究，苏州大学硕士学位论文，2011；(2)Zheng Q et al，New biologically activetriterpenoid saponins from Scabiosa tschiliensis，J.Nat.Prod.2004，67，604。

为更大限度地获得本发明所述化合物，可对含有该类化合物及其前体的植物皂苷进行水解处理，例如碱水解、酶解或微生物水解，该类水解方法是已知的或文献已报道的，其制备方法可参考已知文献进行，例如：(1)杨世林等，白头翁皂苷类物质的制备方法及其制剂的制备方法与其在制备治疗癌症药物中的应用，申请专利号CN201010624822.9；(2)金凤燮等，酶法水解白头翁皂甙糖基制备低糖基白头翁皂甙的方法，申请专利号CN03133639.6。

本发明提供含有本文所述式(I)化合物的组合物，其中包含至少一种该化合物或其生理学上可接受的盐，及生理学上可接受的载体组成的药物组合物。

本发明同时提供含有本文所述式(I)化合物的药用组合物，其包含将至少一种治疗有效量的药用组合物在治疗肿瘤相关疾病方面的应用的方法，特别是实体瘤，例如肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、胶质瘤、乳腺癌、宫颈癌、白血病、淋巴癌等。

体外MTT抗肿瘤试验表明，本发明所述药用组合物中的部分化合物对A549人非小细胞肺癌细胞、SMMC-7721人肝癌细胞、SGC-7901人胃腺癌细胞等11种人肿瘤细胞株有明显的抑制作用，具备广谱抗肿瘤效果。体内药效学实验表明，本发明所述药用组合物中的部分化合物对SMMC-7721肝癌模型小鼠有显著抑瘤作用。已有文献报道，齐墩果酸皂苷类成分的共同抗肿瘤作用途径一般是通过诱导细胞凋亡、提高肿瘤细胞中Caspase-3表达作用和影响细胞脂代谢导致坏死而对癌细胞产生作用。

本发明内容是通过系统研究和大量创造性实验完成的，以下述具体实施例进行说明。

具体实施方式

本发明所述的芍药苷和白芍苷是按以下实施例所表示的方法制造，所涉及到的方法是本领域的技术人员能够掌握和运用的技术手段。但以下实施例不得理解为任何意义上的对本领域发明权利要求的限制。

实施例1：黄花败酱皂苷的制备

本部分制备工艺参照发明人相关文献进行：高亮，黄花败酱化学成分研究，苏州大学硕士学位论文，2011。

干燥的黄花败酱全草2.5kg，经8倍量75％乙醇回流提取3次，每次8小时，合并提取液，200目筛滤过，所得滤液经减压浓缩回收甲醇，得流浸膏2.5kg；流浸膏分散于蒸馏水中，用等体积的乙酸乙酯萃取6次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩，得乙酸乙酯部位(PE)浸膏81g；乙酸乙酯萃取后的水溶液浓缩到约5L，上样于HPD-450大孔树脂柱，用蒸馏水洗脱，再以80％乙醇洗脱，收集80％乙醇洗脱液，减压浓缩，得水部位(PM)浸膏44g。

乙酸乙酯部位浸膏经减压硅胶柱(硅胶H)，以氯仿-甲醇系统溶剂梯度(100∶0～70∶30)洗脱，收集各馏分并以薄层板检测跟踪合并相似组分；经减压浓缩回收溶剂，制得11部分(PE1～11)。经反复硅胶柱(200-300目)层析、反相硅胶柱层析和半制备色谱分离，由PE7得到化合物P21；由PE9得到化合物P22；由PE10得到化合物P23。

水部位浸膏经减压硅胶H柱，以氯仿-甲醇系统溶剂梯度(85∶15～0∶100)洗脱，收集各馏分，减压浓缩，合并为7个部分(PM1～7)。PM1经反相硅胶柱层析，MeOH-H₂O(60∶40→100∶0)梯度洗脱，凝胶柱层析纯化，得化合物P29；由PM3得化合物P24；PM4经反相硅胶柱层析，MeOH-H₂O(80∶20→70∶30)梯度洗脱，pHPLC制备分离纯化，得化合物P28；PM5经pHPLC制备分离纯化，得化合物P25；由PM6得化合物P27；由PM7经Sephadex LH-20柱层析纯化得到化合物P26。

结构鉴定：采用1D和2D-NMR、HRESIMS等波谱学技术，和已知物数据对照，鉴定各化合物依次为：齐墩果酸3-O-β-D-吡喃木糖苷(P21)、齐墩果酸3-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃木糖苷(P22)、3-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃木糖齐墩果酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯苷(P23)、3-O-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖齐墩果酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯苷(P24)、3-O-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃木糖齐墩果酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷(P25)、3-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→4)-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃木糖齐墩果酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷(P26)、3-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→4)-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖齐墩果酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷(P27)、3-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂苷元28-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷(P28)、3-O-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂苷元28-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷(P29)。

实施例2：碱水解法制备齐墩果酸类化合物

称取约50mg实施例1所得各化合物(P24-P29)，用10ml 0.1M NaOH溶液溶解，90℃水浴回流水解12小时，用1M HCl溶液中和至pH 6-7，上CHP20柱，依次用水、30％甲醇、甲醇洗脱各100ml洗脱，收集甲醇洗脱流分，减压浓缩使干燥，得到产物15-25mg。

各化合物经上述碱水解制备工艺，分别获得28-糖链水解后的6个齐墩果酸皂苷衍生物，依次为3-O-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖齐墩果酸(P24b)、3-O-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃木糖齐墩果酸(P25b)、3-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→4)-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃木糖齐墩果酸(P26b)、3-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→4)-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖齐墩果酸(P27b)、3-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂苷元(P28b)、3-O-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂苷元(P29b)。

实验例1：齐墩果酸皂苷化合物的体外抗肿瘤作用考察

采用MTT法，测试8个化合物的抗肿瘤活性；11种人肿瘤细胞株包括A549人非小细胞肺癌细胞，SMMC-7721人肝癌细胞，BEL-7402人肝癌细胞，HL-60人原髓细胞白血病细胞，K562人慢性髓原白血病细胞，SGC-7901人胃腺癌细胞，Eca-109人食管癌细胞，Caco-2人结直肠癌细胞，MCF-7人乳腺癌细胞，Hela人宫颈癌细胞，U251人胶质瘤细胞，均购于上海中国科学院细胞生物研究所。化合物P21、P22、P24b-P29b，均配制为80、40、20、10、5μg/L。取对数生长期细胞株细胞，用胰酶消化后配制成浓度为1×10⁶个/mL的细胞悬液，接种于96孔酶标板中，每孔100μl。24h后加含不同药物及相应溶媒对照的新鲜培养液，对照组以等体积溶媒替代样品的培养液，空白组加等体积的不含细胞的培养液，每孔50μl，每组设5个平行孔。在上述条件下培养48h，其后每孔加入5mg/mL MTT 10μl，继续培养4h后，每孔加50μl DMSO溶解，用微型振荡器振荡混匀后，于酶标仪上测定OD值，实验重复3次，取平均值，计算抑制率。

抑制率(％)＝[(1-样品组OD值/对照组OD值)]×100％

结果：采用MTT法，对8个化合物进行了抗肿瘤活性筛选，结果显示8个化合物对11种人肿瘤细胞株均有抑制作用，一般均小于50μg/L；其对SMMC-7721肝癌细胞IC₅₀范围为3.2-38.7μg/L，其中P26b(IC₅₀3.2μg/L)活性最强，P21(IC₅₀38.7μg/L)活性较弱。

实验例2：齐墩果酸皂苷化合物对动物移植性肿瘤的抑制作用考察

采用SMMC-7721肝癌小鼠模型，考察5个化合物(P24b-P27b、P29b)的体内抗肿瘤作用。将接种SMMC-7721肝癌的小鼠，随机分为阳性对照组(环磷酰胺15mg/kg)、溶剂对照组(空白对照)、各化合物剂量组(5mg/kg)，连续腹腔注射给药10天，末次给药24小时后，处死动物，分离腋下肿瘤并称重，计算肿瘤抑制率。按下式计算抑瘤率：

抑瘤率(％)＝[(空白对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/空白对照组平均瘤重]×100％

实验结果见表1。

表1齐墩果酸皂苷类化合物对SMMC-7721肝癌小鼠的抑制作用(n＝10，

)

结果表明，5个测试化合物P24b-P27b、P29b(5mg/kg)均可显著抑制小鼠的瘤重，抑制率范围为54.2-71.9％，均在50％以上，与阳性对照药环磷酰胺相近。

Claims (10)

1.一种式(I)所示的三萜皂苷类化合物：

其药学上可接受的盐，其水合物，其药物前体，或上述任一种的溶剂合物在治疗肿瘤相关疾病方面的应用，特征在于其中：R¹选自OH，R²选自H、葡萄糖、阿拉伯糖和木糖基中的1-2个，R³选自OH或甲基。

2.根据权利要求1的化合物，其中R¹选自α-OH或β-OH。

3.根据权利要求1的化合物，其中R²选自H、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖和葡萄糖基中的1-2个，并且化合物中至少有1个木糖基。

4.根据权利要求1的化合物，其中所述化合物选自：

3-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃木糖齐墩果酸，

3-O-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃木糖齐墩果酸，

3-O-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃阿拉伯糖齐墩果酸，

3-O-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂苷，

3-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→4)-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃木糖齐墩果酸，

3-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→4)-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖齐墩果酸，及其药学上可接受的盐。

5.根据权利要求1的化合物，特征在于所述化合物由败酱科植物中制备获得。

6.根据权利要求5的化合物，特征在于所述化合物由败酱科植物中前体皂苷经水解获得。

7.根据权利要求6的化合物，特征在于所述化合物由败酱科植物中前体皂苷经碱水解获得。

8.一种药用组合物，其包含至少一种根据权利要求1的式(I)化合物或其生理学上可接受的盐，及生理学上可接受的载体。

9.根据权利要求8的药用组合物，其包含将至少一种治疗有效量的药用组合物在治疗肿瘤相关疾病方面的应用的方法。

10.根据权利要求9的方法，其中所述肿瘤相关疾病是实体瘤。