CN101348514B - 一种从面包海星提取的海星皂苷类化合物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种海星皂苷类化合物，分子式为C₅₇H₉₃O₂₈SNa，化学名称为(20R，2R，23S，24S)-6α-O-{β-D-吡喃岩藻糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基-(1→4)-[β-D-吡喃奎诺糖基-(1→2)]-β-D-吡喃奎诺糖基-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖基}-22，23-环氧-20-羟基-24-甲基-5α-胆甾-9(11)-烯-3β-硫酸钠。体外抗肿瘤试验表明，该化合物对C6大鼠恶性胶质瘤细胞以及U87MG、U251MG、BT325和SHG44四种人恶性胶质瘤细胞有明显的抑制作用，而不影响原代培养的人神经胶质细胞生长。该化合物可望用于制备治疗胶质瘤的药物。

Description

一种从面包海星提取的海星皂苷类化合物的用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，是从海洋生物中分离有抗癌活性的化合物，具体地说是从面包海星中提取分离到的一种海星皂苷类化合物及其在制备抗胶质瘤药物中的应用。

背景技术

人胶质瘤是颅内肿瘤中最常见的一种，致残率和死亡率高，5年生存率为20％～30％，在所有胶质瘤中占半数的胶质母细胞瘤患者5年生存率不足5％。目前用以治疗胶质瘤的化疗药物主要有亚硝脲类烷化剂尼莫司汀(ACNU)、卡莫司汀、洛莫司汀以及甲基苄肼、甲氨喋呤、环磷酰胺、替尼泊苷等，但这些药物对恶性胶质瘤的有效率较低，一般小于50％，对生存时间延长不明显，而且很易造成严重的肝脏损害及骨髓抑制，往往因为药物的毒副反应重而不得不放弃化疗：此外，至少半数以上胶质瘤对常用的化疗药物耐药。因此，与对其他肿瘤的治疗相比，目前临床上更缺乏对胶质瘤有效的治疗药物，新型安全高效的化疗药物的开发是治疗该病的迫切需求。

海星(starfish)属棘皮动物门海星纲，现存约1500种，为海生底栖动物，分布广泛。近二十年来，国外关于海星活性化学成分特别是海星甾体皂苷的研究非常活跃，对海星皂苷的研究已导致90余种结构新颖的化合物的发现。这些海星皂苷具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、Na⁺-K⁺-ATP醇抑制、抗溃疡、溶血等多种多样的药理活性。海星皂苷(asterosaponins)为海星甾体皂苷中的一类特定的化合物，其结构特征为：具有Δ⁹⁽¹¹⁾-3β，6α-二羟基甾体母核，并在3位硫酸化，6位糖基化。苷元侧链至少有1个位置被氧化，寡糖基一般由5或6个糖基构成，并具有相似的连接方式和连接位点(汤海峰，易杨华，张淑瑜，等.海星皂苷的研究进展.中国海洋药物，2004，23(6)：48-57和lorizziM，De Mariino S，Zollo F.Steroidal oligoglycosidesfrom the asteroidean.CurrentOrgnic Chem，2001，5(9)：951)。

我国南海生物资源极为丰富，是世界上海星集中分布的海域之一，特别是面包海星(Culcitanovaeguineae)的蕴藏量巨大。我们从采自三亚海域的面包海星中分离鉴定了16种具有生物活性的海星皂苷，包括11种新化合物，这是国内外首次对面包海星中的海星皂苷类化合物进行分离和鉴定。深入的药理研究表明，这些海星皂苷多数具有显著的肿瘤细胞毒性。其中一种新化合物novaeguinosideII对U87MG等多种胶质瘤细胞具有显著细胞毒性并显示了一定选择性，IC50值与临床常用于恶性脑肿瘤治疗的盐酸尼莫司汀接近，但不影响原代培养的人神经胶质细胞生长。该化合物即下述式I所示化合物EHMC。EHMC的化学结构以及对K-562人白血病细胞和BEL-7402人肝癌细胞的细胞毒性已由我们报道(Tang HF(汤海峰)，YiYH，LiL，SunP，Zhang SQ，Zhao YP.Bioactiveasterosaponins from the starfish Culcitanovaeguineae.J Nat Prod,2005，68(3)：337-341)，但其抗胶质瘤活性尚未见有过文献报道和专利申请。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种提取自面包海星的海星皂苷类化合物在制备抗胶质瘤药物方面的应用。

本发明的目的是这样实现的，一种从面包海星提取的海星皂苷类化合物，它的分子式为C₅₇H₉₃O₂₈SNa，式I所示化合物

式I

上述结构其化学名称为(20R，22R，23S，24S)-6α-O-{β-D-吡喃岩藻糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基-(1→4)-[β-D-吡喃奎诺糖基-(1→2)]-β-D-吡喃奎诺糖基-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖基}-22，23-环氧-20-羟基-24-甲基-5α-胆甾-9(11)-烯-3β-硫酸钠(sodium(20R，22R，23S，24S)-6α-O-{β-D-fucopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl-(1→4)-[β-D-quinovopyranosyl-(1→2)]-β-D-quinovo-pyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosyl}-22，23-epoxy-20-hydroxy-24-methyl-5α-cholest-9(11)-en-3β-yl-sulfate)，是从面包海星中提取分离的海星皂苷类化合物，以下简称其为EHMC，其特征是：所述的式I化合物EHMC可以用于制备治疗胶质瘤的药物。

所述的式I化合物EHMC对C6大鼠源性恶性胶质瘤细胞以及U87MG、U251MG、BT325和SHG44四种人源性恶性胶质瘤细胞有明显的抑制作用，半数有效抑制浓度(IC50值)在1.45～322μmol/L之间；并且，在高至50μmol/L浓度时也不影响原代培养的人神经胶质细胞生长。式I化合物EHMC对MKN-28人胃癌和A-549人肺癌细胞的抑制作用非常弱，表明其对胶质瘤具有选择性作用。

以新鲜采集的面包海星为原料，原料经剪碎后，按重量体积比加入3～5倍原料重的95％乙醇，回流提取3次，每次2～4小时；合并提取液，回收溶剂，得乙醇提取物，提取物分散于按重量体积比3倍的水中，分别用和水等体积的石油醚萃取10次，萃取后的水相再分别用与水等体积的正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，浓缩至1/3体积，加等体积的水洗涤1次，以除去盐、多糖强极性成分，将水洗后的正丁醇相蒸干得到总苷提取物。总苷提取物应用硅胶柱层析，以体积比为2:1:0～0:6:1的氯仿-水饱和的正丁醇-甲醇混合溶剂洗脱，得到总海星皂苷。总海星皂苷应用硅胶柱层析和Sephadex LH-20凝胶柱层析纯化，分别用体积比为12:1的正丁醇-甲醇混合溶剂和体积比为2:1的甲醇-水混合溶剂洗脱，合并含式I化合物EHMC的流份，再经高效液相色谱仪分离纯化，体积比为46:54～47:53的甲醇-水混合溶剂为流动相洗脱，得到式I化合物EHMC的纯品。

所述的从面包海星中提取分离式I化合物EHMC的方法，除应用常规的溶剂提取、溶剂萃取和各种色谱分离技术外，在应用硅胶柱层析方法从总苷提取物制备总海星皂苷时，对于包含有EHMC的总海星皂苷的确定是采用如下手段来检查的：以硅胶薄层层析检测，采用体积比为12:3:5的正丁醇-乙酸-水混合溶剂或体积比为80:18:2的氯仿-甲醇-水混合溶剂展开，收集R_f值在0.1～035处显示紫红色斑点的流份，即为总海星皂苷。

所述的式I化合物EHMC在作为药物使用时，可以是单独使用，也可以是与其他成分混合使用。

在临床应用时，以常规的制剂工艺，单独使用或与其他药物配合制备成在临床上可以使用的各种不同剂型的药物，如注射剂、或散剂、或丸剂、或胶囊剂、或片剂、或微囊剂、或软胶囊剂、或膜剂、或膏剂、或酊剂、或颗粒剂、或气雾剂等。

本发明的特点是：

目前临床上缺乏有效治疗胶质瘤的药物，虽然本发明人从面包海星中分离鉴定的一种海星皂苷类化合物EHMC同时也可以抑制K-562人白血病细胞和BEL-7402人肝癌细胞生长，但相比于开发为抗白血病和抗肝癌药物，开发其显著的抗胶质瘤作用并应用于临床治疗胶质瘤更具有重要的现实意义。而且，该化合物对于MKN-28人胃癌、A-549人肺癌等其他肿瘤细胞的抑制作用非常弱，表明它对胶质瘤的抑制作用具有一定选择性。

式I化合物EHMC的结构为本发明人所发现和报道，但它的抗胶质瘤作用未见任何文献报道和专利申请，它对多种人和鼠恶性胶质瘤细胞株的显著抑制作用以及不抑制正常神经胶质细胞生长的作用表明其可以作为新的高效低毒的抗胶质瘤药物进行研究开发。

具体实施方式

以新鲜采集的面包海星为原料，原料经剪碎后，按重量体积比加入3～5倍原料重的95％乙醇，回流提取，共提取3次，每次2～4小时。合并提取液，回收溶剂，得乙醇提取物，提取物分散于按重量体积比3倍的水中，分别用和水等体积的石油醚萃取10次，萃取后的水相再分别用与水等体积的正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，浓缩至1/3体积，加等体积的水洗涤1次，以除去盐、多糖等强极性成分，将水洗后的正丁醇相蒸干得到总苷提取物。总苷提取物应用硅胶柱层析，以体积比为2:1:0～0:6:1的氯仿-水饱和的正丁醇-甲醇混合溶剂洗脱，硅胶薄层层析检测，采用体积比为12:3:5的正丁醇-乙酸-水混合溶剂或体积比为80:18:2的氯仿-甲醇-水混合溶剂展开，收集Rf值在0.1～0.35处显示紫红色斑点的流份，即为总海星皂苷。总海星皂苷应用硅胶柱层析和SephadexLH-20凝胶柱层析纯化，分别用体积比为12:1的正丁醇-甲醇混合溶剂和体积比为2:1的甲醇-水混合溶剂洗脱，合并含式I化合物EHMC的流份，再经高效液相色谱仪分离纯化，体积比为46:54～47:53的甲醇-水混合溶剂为流动相洗脱，得到式I化合物EHMC的纯品。

下面结合具体实施例来说明本发明的实质。应理解，这些实施例使本发明所说的式I化合物EHMC的用途得以证实，而不用于限制本发明的范围。下述实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：化合物的提取和分离1

制备实施例化合物的原料为采用潜水和拖网手段采集自海南三亚海域的面包海星，原料重68公斤，共85个面包海星，经剪碎后，加入210升浓度为95％的乙醇进行回流提取，共提取3次，每次2小时。合并提取液，减压回收溶剂(减压回收即本行业通常所采用的抽滤方法，下同)，得乙醇提取物3.1公斤。提取物分散于10升水中，用石油醚萃取10次，每次10升。萃取后的水相再用正丁醇萃取3次，每次10升，合并正丁醇萃取液，浓缩至约3升，加3升的水洗涤1次，将水洗后的正丁醇相蒸干得到总苷提取物145克。将总苷提取物进行硅胶柱层析，以氯仿-水饱和的正丁醇-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，洗脱液的体积比分别为2:1:0(取下层作为洗脱液)，0:1:0和0:6:1，按500mL为一个流份接收，并用硅胶薄层层析检测(薄层展开溶剂采用体积比为12:3:5的正丁醇-乙酸-水混合溶剂，显色剂为体积比为1:4的硫酸-甲醇溶液，喷显色剂后于105℃加热显色)，收集Rf值在0.1～0.35处显示紫红色斑点的流份，即为总海星皂苷，共5.9克。总海星皂苷进行硅胶柱层析，用体积比为12:1的正丁醇-甲醇混合溶剂洗脱，按100毫升为1个流份接收，薄层层析检测，合并含如下式I化合物EHMC的第19～25流份，减压蒸干溶剂后再采用SephadexLH-20凝胶柱(Pharmacia公司)进行柱层析，用体积比为2:1的甲醇-水混合溶剂洗脱，按10毫升为一个流份接收，薄层层析检测，合并含如下式I化合物EHMC的第35～40流份和第41～44流份，分别减压蒸干溶剂后得到0.32克样品C和0.24克样品D。样品C经高效液相色谱仪(安捷伦公司)分离纯化(高效液相色谱条件为：杜邦Zorbax300SB-C18色谱柱250mm×9.4mm，47％甲醇为流动相，流速1.5mL/min，室温，示差折光检测器检测)，得到如下式I化合物EHMC的纯品33.0毫克；样品D经高效液相色谱仪(安捷伦公司)分离纯化(高效液相色谱条件为：杜邦Zorbax300SB-C₁₈色谱柱250mm×9.4mm，46％甲醇为流动相，流速1.9mL/min，室温，示差折光检测器检测)，得到如下式I化合物EHMC的纯品9.1毫克。

式I

上述结构其化学名称为(20R，2R，23S，24S)-6α-O-{β-D-吡喃岩藻糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基-(1→4)-[β-D-吡喃奎诺糖基-(1→2)]-β-D-吡喃奎诺糖基-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖基}-22，23-环氧-20-羟基-24-甲基-5α-胆甾-9(11)-烯-3β-硫酸钠(sodium(20R，22R，23S，24S)-6α-O-{β-D-fucopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl-(1→4)-[β-D-quinovopyranosyl-(1→2)]-β-D-quinovo-pyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosyl}-22，23-epoxy-20-hydroxy-24-methyl-5α-cholest-9(11)-en-3β-yl-sulfate)，是从面包海星中提取分离的海星皂苷类化合物，简称其为EHMC。

实施例2：化合物的提取和分离2

采用潜水和拖网手段采集自海南三亚海域的面包海星作为原料，原料重100公斤，共129个面包海星，经剪碎后，加入400升浓度为95％的乙醇进行回流提取，共提取3次，每次4小时。合并提取液，减压回收溶剂，得乙醇提取物4.8公斤。提取物分散于15升水中，用石油醚萃取10次，每次15升。萃取后的水相再用正丁醇萃取3次，每次15升，合并正丁醇萃取液，浓缩至约5升，加5升的水洗涤1次，将水洗后的正丁醇相蒸干得到总苷提取物220克。将总苷提取物进行硅胶柱层析，以氯仿-水饱和的正丁醇-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，洗脱液的体积比分别为2:1:0(取下层作为洗脱液)，0:1:0和0:6:1，按750mL为一个流份接收，并用硅胶薄层层析检测(薄层展开溶剂采用体积比为80:18:2的氯仿-甲醇-水混合溶剂，显色剂为体积比为1:4的硫酸-甲醇溶液，喷显色剂后于105℃加热显色)，收集Rf值在0.1～035处显示紫红色斑点的流份，即为总海星皂苷，共9.1克。总海星皂苷进行硅胶柱层析，用体积比为12:1的正丁醇-甲醇混合溶剂洗脱，按150毫升为1个流份接收，薄层层析检测，合并含实施例1式I化合物EHMC的第20～26流份，减压蒸干溶剂后再采用Sephadex LH-20凝胶柱(Pharmacia公司)进行柱层析，用体积比为2:1的甲醇-水混合溶剂洗脱，按15毫升为一个流份接收，薄层层析检测，合并含实施例1式I化合物EHMC的第35～41流份和第42～45流份，分别减压蒸干溶剂后得到0.50克样品C和0.37克样品D。样品C经高效液相色谱仪(安捷伦公司)分离纯化(高效液相色谱条件为：杜邦Zorbax300SB-C₁₈色谱柱250mm×9.4mm，47％甲醇为流动相，流速1.7mL/min，室温，示差折光检测器检测)，得到实施例1式I化合物EHMC的纯品50.2毫克；样品D经高效液相色谱仪(安捷伦公司)分离纯化(高效液相色谱条件为：杜邦Zorbax300SB-C₁₈色谱柱250mm×9.4mm，46％甲醇为流动相，流速2.0mL/min，室温，示差折光检测器检测)，得到实施例1式I化合物EHMC的纯品14.1毫克。

化合物的结构鉴定

实施例1式I化合物EHMC为白色结晶性粉末，分子式为C₅₇H₉₃O₂₈SNa，熔点为215～216℃，

+3°(c0.132，MeOH)，，Liebermann-Burchard和Molish反应均为阳性。

对化合物进行酸水解和糖衍生物的分析，具体方法为：取1.0mg样品，溶于2mol/LCF₃COOH1mL，置2mL安瓿中，充氮气，封管，于烘箱中120℃加热反应2h，40℃减压蒸干，反复加MeOH(1mL×3)后减压抽干以除去CF₃COOH，残渣以CH₂Cl₂/H₂O(5mL/5mL)分配，水层以5mLCH₂Cl₂洗涤1次，蒸干，0.8mL无水吡啶溶解至10mL反应瓶中，加入2mgNH₂OH·HCl，90℃水浴振荡反应30min，冷却至室温后加入醋酐0.8mL，再于90℃振摇反应1h，减压蒸干，反复加CH₂Cl₂(1mL×3)后减压蒸干，溶于CHCl₃0.3mL，取1μL进行GC/MS分析。单糖对照品L-阿拉伯糖、D-岩藻糖、D-奎诺糖、D-葡萄糖各10mg，分别溶于1mL无水吡啶，按相同衍生方法制备糖腈乙酸酯，作为GC分析时的对照。GC/MS分析采用FinniganVoyagerGC/MS联用仪，配DB-5石英毛细管色谱柱(30m×0.25mm，0.25μm)。柱温：150℃，保持2min；升温至300℃(15℃/min)，保持10min。汽化温度：250℃。进样量1μL。载气(流量)：N₂(1mL/min)，分流比：30:1，延迟：2min。MS检测器：E1电离源，电离电压70eV，源温：200℃。MS标准库：NBS，NIST库。GC/MS对比分析表明：实施例1式I化合物EHMC含有4种糖基：D-葡萄糖(t_R＝8.010min)，D-岩藻糖(t_R＝6.351min)，L-阿拉伯糖(t_R＝6.260min)，D-奎诺糖(t_R＝6.251min)，组成比约为1:1:1:2。

对化合物进行甲基化、酸水解和糖基分析，具体方法为：取真空干燥4h的样品(2.2mg)加入1mLDMSO中，快速加入刚磨好的NaOH粉40mg，充氮气后加盖密封，并在超声波作用下溶解20min，再加入0.3mLCH₃l，避光室温放置30min后，加入4mL水中止反应，以CHCl₃5mL萃取，CHCl₃层用H₂O洗涤(3mL×3)，减压蒸干，溶于2mol/LCF₃COOH0.75mL中，充氮气，封管120℃水解2h。水解液加入CHCl₃/H₂O(2mL/2mL)分配，水层用1.5mLCHCl₃洗涤后减压蒸干，残渣反复加入H₂O(0.7mL×2)和MeOH(1mL)后减压蒸干以除去CF₃COOH。然后加入0.5mol/L氨水0.5mL和NaBH₄4mg，25℃反应4h，滴加1mol/L醋酸至无气泡产生，60℃以下减压蒸干，再反复加入0.1％盐酸甲醇(2mL×3)和甲醇(2mL)后减压蒸干，以除尽硼酸根离子。残渣于105℃加热20min以除尽水分，加入醋酐0.5mL和吡啶0.5mL，封管，100℃加热45min乙酰化。乙酰化物以CHCl₃/H₂O(1.5mL/1.5mL)分配，CHCl₃层相继以H₂O1mL，饱和NaHCO₃溶液1mL，H₂O1mL洗涤，然后减压浓缩至干，加0.3mL CHCl₃溶解后取1μL进行GC/MS分析。GC/MS分析条件与检测前述糖衍生物的条件相同。可以检测到5种部分甲基化糖醇乙酸酯，分别对应于实施例1式I化合物EHMC的寡糖链中的不同连接位置的糖基：3-linked glucose(1，3，5-tri-O-acetyl-2，4，6-tri-O-methylglucitol，t_R＝7.430min，m/z：233，189，161，129，117，101，87，43)，2-linked arabinose(1，2，5-tri-O-acety-3，4-di-O-methylarabinitol，t_R＝6.976minm/z:189，129，117，101，87，43)，2，4-linked quinovose(1，2，4，5-tetra-O-acetyl-3-O-methylquinovitol，t_R＝6.318minm/z：03，189，143，129，117，101，87，43)，terminal fucose(1，5-di-O-acetyl-2，3，4-tri-O-methylfocitol，t_R＝5.743min，m/z：175，161，131，117，115，101，89，72，43)，terminal quinovose(1，5-di-O-acety1-2，3，4-tri-O-methylquinovitol，t_R＝5.484min，m/z：175，161，131，117，115，101，89，72，43)。

通过高分辨质谱和核磁共振谱特别是二维核磁共振谱的综合解析，确定了该化合物的结构。其波谱数据如下：

ESI-MS(正离子模式)m/z：1304[M+Na+H]⁺，1303[M+Na]⁺，755[3×146+132+162+Na]⁺，663[1/2M+Na]⁺，609[2×146+132+162+Na]⁺，463[132+146+162+Na]⁺；MS/MS(m/z1303)m/z：1303[M+Na]⁺，1183[M+Na-NaHSO₄]⁺，1038[1183-147]⁺，889[1183-2×146]⁺，725[1183-Fuc-Ara-Qui1l-2×16]⁺，593[3×146+132+Na]⁺，447[2×146+132+Na]⁺。ESI-MS(负离子模式)m/z：1257[M-Na]^-；MS/MS(m/z1257)m/z：1257[M-Na]^-，1157[M-Na-100]^-(cleavage of C₂₂-C₂₃)，1111[M-Na-146]^-，979[M-Na-146-132]^-，965[M-Na-2×146]^-，865[1157-2×146]^-，833[M-Na-2×146-132]^-，687[M-Na-3×146-132]^-，525[M-Na-3×146-132-162]^-，507[525-H₂O]^-。HRESI-MS(正离子模式)m/z：1304.5416[M+Na+H]⁺(计算值C₅₇H₉₄O₂₈SNa₂：1304.5438)，1303.5353[M+Na]⁺(计算值C₅₇H₉₃O₂₈SNa₂：1303.5369)。IR(KBr)cm^-1：3441(OH)，1641(C＝C)，1242，1213(sulfate)，1063(C-O)。其¹H和¹³C核磁共振数据以及重要的HMBC相关信号见表1。

表1实施例1式I化合物EHMC的¹H和¹³C核磁共振数据^a以及重要的HMBC相关信号(测试溶剂：氘代吡啶)

^a核磁数据经由¹H-¹H COSY，TOCSY，HSQC和HMBC谱的分析得以确定。^b括号内为偶合常数(Hz)。^c多重性由DEPT谱确定。^d在HMBC谱中可以检测到6-H和Glc C-1的相关信号。^eGlc：葡

萄糖，Ara：阿拉伯糖，Qui：奎诺糖(其中，Quil连接于Glc的3位，QuiII连接于Quil的2位)，Fuc：岩藻糖。

化合物体外抗胶质瘤作用的研究

对实施例1式I化合物EHMC进行了体外抗胶质瘤试验，试验所采用的细胞株分别为：C6大鼠源性恶性胶质瘤细胞以及U87MG、U251MG、BT325和SHG44等4种人恶性胶质瘤细胞。为测试实施例1式I化合物EHMC对胶质瘤的选择性以及对正常神经细胞的毒性，另取MKN-28人胃癌和A-549人肺癌细胞株以及原代培养的人神经胶质细胞同时测定实施例1式I化合物EHMC的细胞毒性。采用常规的MTT法测试。

具体方法为：根据细胞生长速率，将处于对数生长期的细胞以4000个细胞/孔接种于96孔培养板，贴壁生长24小时后，弃去原培养液，加入用DMEM培养液配制好的含不同浓度本发明化合物的溶液200μL，每个浓度设3个复孔，并设盐酸尼莫司汀(ACNU)阳性对照、生理盐水对照和无细胞调零孔。细胞在37℃、5％CO₂-95％O₂条件下培养48小时，然后加入PBS溶解的浓度为10mg/mL的MTT(Sigma公司)20μL，在同样条件下孵育4小时。最后，每孔加入200μL的二甲基亚砜，混匀。将96孔板置酶标仪上测定各孔在490nm处的吸光度(OD)值。按下式计算被测物对细胞生长的抑制率：

细胞抑制率＝(1—治疗组OD值/对照组OD值)×100％

半数有效抑制浓度IC₅₀值采用Logit法计算。试验结果见表2。

表2实施例1式I化合物EHMC对5种恶性胶质瘤细胞、2种其他肿瘤细胞以及原代培养的人神经胶质细胞的抑制作用(IC₅₀值，μmol/L)

可见，实施例1式I化合物EHMC对4种人恶性胶质瘤细胞和1种大鼠源性恶性胶质瘤细胞均有显著抑制作用，IC₅₀值与临床常用于恶性脑肿瘤治疗的盐酸尼莫司汀接近，但对其他2种肿瘤细胞的抑制作用非常弱，表明其对胶质瘤具有选择性作用。实施例1式I化合物EHMC不影响原代培养的人神经胶质细胞生长(IC₅₀值>50μmol/L)，具体试验中发现，既使在实施例1式I化合物EHMC为50μmol/L浓度时，对神经胶质细胞的抑制率也只有9.0％(P>0.05)，但阳性对照盐酸尼莫司汀在50μmol/L浓度时的抑制率可达26.8％(P<0.05)，可见，实施例1式I化合物EHMC对正常神经胶质细胞基本无毒性，可用于制备治疗胶质瘤的药物。

药物的制备

注射剂配方：2mg EHMC，50mmol/L磷酸缓冲液，pH7.0，总体积1mL。制法：取实施例1式I化合物EHMC10mg，加50mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)5mL，在无菌条件下完全溶解，分别经过G3和G6玻砂过滤器过滤，灌封于1mL安瓿中，100℃灭菌30分钟，得5支。

口服制剂配方：5毫克EHMC，50毫克甘露醇，100毫克可溶性淀粉。制法：取实施例1式I化合物EHMC5毫克，加50毫克甘露醇和100毫克可溶性淀粉，充分混匀后制粒，所制颗粒包装即得颗粒剂；所制颗粒装于空胶囊壳中，即得胶囊剂；所制颗粒直接压片，包薄膜衣，即得片剂。

Claims (1)

1.一种从面包海星提取的海星皂苷类化合物在制备抗胶质瘤的药物中的应用，其特征在于，所述化合物的化学结构式如下：

上述式I结构的化学名称为(20R，22R，23S，24S)-6α-O-{β-D-吡喃岩藻糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基-(1→4)-[β-D-吡喃奎诺糖基-(1→2)]-β-D-吡喃奎诺糖基-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖基}-22，23-环氧-20-羟基-24-甲基-5α-胆甾-9(11)-烯-3β-硫酸钠(sodium(20R，22R，23S，24S)-6α-O-{β-D-fucopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl-(1→4)-[β-D-quinovopyranosyl-(1→2)]-β-D-quinovopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosyl}-22，23-epoxy-20-hydroxy-24-methyl-5α-cholest-9(11)-en-3β-yl-sulfate)，以下简称其为EHMC，所述的从面包海星提取的海星皂苷类化合物可以单独使用或与其他药物配合制备成在临床上使用的注射剂、或散剂、或丸剂、或胶囊剂、或片剂、或微囊剂、或膜剂、或膏剂、或酊剂、或颗粒剂、或气雾剂。