CN101463058B - 羊毛脂烷型三萜化合物海莲酸、其衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一类从中国红树林植物海莲(Bruguiera sexangula)中提取、分离获得的羊毛脂烷型三萜化合物海莲酸(sexangulic acid)、其衍生物及其制备方法和用途。本发明的海莲酸、其衍生物结构式如下所示，当R₁和R₂同时为氢时，即为海莲酸。该化合物及其衍生物经多次体外抗肿瘤活性测试具有明显的抑制肿瘤细胞活性，可望在制备抗癌症药物中应用。本发明可为研制新的治疗各种常见多发癌症药物提供先导化合物，对开发利用中国的海洋生物资源具有重要意义。

Description

羊毛脂烷型三萜化合物海莲酸、其衍生物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体是一类从中国南海红树林植物海莲(Bruguiera sexangula)中分离得到的新的羊毛脂烷型三萜化合物海莲酸(sexangulic acid)、其衍生物及其制备方法和用途。该类化合物对两种肿瘤细胞株A-549人肺腺癌细胞株和HL-60人白血病细胞株具有显著的抑制作用，可作为一类研制新的抗肿瘤药物的先导化合物，也可作为治疗各种临床常见多发癌症的药物。

背景技术

红树林是包括红树科及一些其它不同科属但专一生长于热带和亚热带海岸潮间带的植物。由于生长环境的特殊性，红树林植物中富含结构新颖、具有生物活性的化合物，有很高的药用价值。红树林植物中的单宁有收敛、止血等作用，可用作治疗烧伤、腹泻、外伤等；许多红树林植物可用于消炎解毒，如正红树、老鼠勒可用于治疗蛇伤；此外，一些红树林植物，如正红树、木榄等，也都发现含有抗癌作用的活性成分。因此，开发利用红树林植物的收敛止血药物、消石利尿药物和抗肿瘤药物前景较为乐观。

海莲Bruguiera sexangula是红树科木榄属植物，中国特有种，仅在海南有分布。我国民间用海莲的树叶水煮熬汁口服治疗疟疾。文献报道海莲树皮中的单宁类成分能有效地抑制两种类型的肿瘤：肉瘤180(sarcoma180)和刘易斯肺癌(Lewis lung carcinaoma)。但是，在现有文献中，未见海莲酸及其衍生物以及其活性方面的任何报道。

发明内容

在开发利用我国的海洋生物资源，从中寻找具有生物活性及药用前景的海洋天然产物的过程中，本发明研究人员发现，红树林植物海莲的乙酸乙酯粗提物在体外抗肿瘤筛选实验中对A-549人肺腺癌细胞株及HL-60人白血病细胞株均显示良好的抑制活性。进一步的生物活性跟踪研究，导致了羊毛脂烷型三萜化合物海莲酸的发现。

海莲酸是高度氧化、结构新颖的羊毛脂烷型三萜化合物。体外抗肿瘤生物活性筛选实验表明，海莲酸及其衍生物对A-549人肺腺癌细胞株及HL-60人白血病细胞株显示明显的细胞毒性。

本发明的一个目的在于提供一类从我国红树林植物海莲中提取分离得到的新的羊毛脂烷型三萜化合物海莲酸及其衍生物。

本发明的另一目的是提供上述海莲酸及其衍生物的制备方法。

本发明的还一目的是提供上述羊毛脂烷型三萜化合物海莲酸及其衍生物在制备治疗癌症药物中的应用，尤其是在制备治疗肺癌和/或白血病药物中的应用。

本发明的羊毛脂烷型三萜化合物海莲酸及其衍生物具有如下的化学结构式：

其中，

R₁为氢、C1～C6的烷基或C2～C6的烷酰基；

R₂为氢或C1～C6的烷基。

优选的，

R₁为氢、C1～C4的烷基或C2～C4的烷酰基；

R₂为氢或C1～C4的烷基。

更优选的，

R₁为氢、甲基或乙酰基；

R₂为氢或甲基。

具体的，可以为下述化合物：

上述C1～C6的烷基是指含有1～6个碳原子的直链或支链的烷基，例如：甲基、乙基、丙基、2-甲基丙基、2-乙基丙基、丁基、2-甲基丁基、3-乙基丁基、戊基、4-甲基戊基或己基等；优选含有1～4个碳原子的直链或支链的烷基，更优选甲基。

上述烷酰基是指含有2～6个碳原子的直链或支链的烷酰基，例如：乙酰基、丙酰基、2-甲基丙酰基或丁酰基等；优选含有2～4个碳原子的直链或支链的烷酰基；更优选乙酰基。

本发明提供的海莲酸及其衍生物的制备方法，包括如下步骤：

海莲用醇渗漉提取，减压浓缩提取液得粗浸膏；将该粗浸膏溶于NaCl溶液，混悬均匀后用乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯萃取液得到乙酸乙酯浸膏；

乙酸乙酯浸膏经反复硅胶柱层析，后经凝胶Sephadex LH-20纯化得到羊毛脂烷型三萜化合物海莲酸。

具体为：海莲用醇渗漉提取，减压浓缩提取液得粗浸膏。将该粗浸膏溶于0.7～1.5N NaCl溶液，混悬均匀后用乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯萃取液得到乙酸乙酯浸膏；乙酸乙酯浸膏经200-300目硅胶柱层析，分别以石油醚/乙酸乙酯体积比为100∶0→90∶10→80∶20→50∶50→20∶80→10∶90→0∶100梯度洗脱；将其中体积比石油醚/乙酸乙酯10∶90洗脱部分经200-300目硅胶柱层析，分别以氯仿/甲醇体积比为100∶0→95∶5→90∶10梯度洗脱；再将其中体积比氯仿/甲醇95∶5洗脱部分经Sephadex LH-20凝胶柱层析，以体积比氯仿/甲醇1∶1洗脱并纯化，得到海莲酸。

进一步的，海莲酸通过酯化反应、烷基化反应或成醚反应，得到其相应的衍生物。

其中，所述的醇为甲醇或乙醇。

本发明对羊毛脂烷型三萜化合物海莲酸及其衍生物进行了抗肿瘤活性测试，表明上述化合物具有明显的抗肿瘤作用。可用于制备治疗癌症和/或肿瘤的药物。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。

¹H、¹³C NMR用Varian Inova 400型核磁共振仪测定；MS(ESIMS及HRESIMS)用Q-TOF Micro LC-MS-MS型质谱仪测定；所使用的硅胶均为青岛海洋化工厂生产；各种溶剂均由国药集团试剂有限公司生产，均为分析纯。

如无特殊说明，以下实施例中涉及到的液/液之间比值均为体积百分比。

实施例1：

羊毛脂烷型三萜化合物海莲酸的制备

(1)提取：中国红树林植物海莲干重3.1kg，用甲醇5L渗漉提取4次，提取液合并后减压浓缩，所得流浸膏混悬于1000ml 1N NaCl溶液，以乙酸乙酯1000ml反复萃取该混悬液3次，所得萃取液合并后减压浓缩得到乙酸乙酯浸膏41g。

(2)分离：乙酸乙酯浸膏41g经200-300目硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯100∶0→90∶10→80∶20→50∶50→20∶80→10∶90→0∶100梯度洗脱，每个梯度用量1000ml；其中石油醚/乙酸乙酯10∶90洗脱部分421mg，经200-300目硅胶柱层析，以氯仿/甲醇100∶0→95∶5→90∶10梯度洗脱，每个梯度用量200ml；其中氯仿/甲醇95∶5洗脱部分107mg，经Sephadex LH-20凝胶柱层析，以氯仿/甲醇1∶1洗脱并纯化，得到海莲酸20mg。

海莲酸的理化性状如下：白色固体，光学活性[α]_D ²²+38.7°(c，0.60，CHCl₃)；IR谱中显示3423(OH)，1724(COOH)，1639(共轭二烯)，1375，1076，806cm^-1等吸收峰；正离子模式电喷雾质谱给出准分子离子峰m/z 495[M+Na]⁺和967[2M+Na]⁺，高分辨正离子模式电喷雾质谱显示其分子式为C₃₀H₄₈O₄{m/z 495.3445[M+Na]⁺，Δ＝-0.5mmu}。¹H与¹³C NMR数据见表1。同时，通过测定二维H-H相关谱(DQF-COSY)、H-C相关谱(HMQC)、H-C远程相关谱(HMBC)以及H-H核空间偶极相关谱(ROESY)，确定了所有碳原子和氢原子的信号归属及该化合物的化学结构。

表1  海莲酸的核磁共振波谱数据表^a，b

No.

δH，m，Jin Hz

δC，mc

HMBC(H-C)

COSY

ROESY

1a1b2a2b345678

2.14，m1.73，m1.66，m1.37，m4.72，dd，10.2，6.02.42，m2.06，m5.52，m

36.4，t31.8，t75.5，d53.9，s46.4，d28.4，t120.6，d143.2，s

3，5，9，193，5，9，194，104，101，5，28，293，7，19，28，294，85，9，14

2a，2b2a，2b1a，1b，31a，1b，32a，2b6a5，76a，6b

53，30

9101112a12b131415a15b16171819202122a22b2324a24b252627282930

5.49，m2.27，m2.14，m1.97，m1.32，m1.32，m1.62，m0.69，s1.18，s1.48，m0.99，d，6.61.51，m1.16，m1.75，m1.73，m1.64，m1.43，s1.43，m1.77，s0.91，s

146.0，s37.4，s117.1，d38.1，t44.1，s50.7，s28.1，t30.1，t51.3，d16.0，q23.5，q36.6，d18.8，q37.3，t21.6，t45.3，t69.6，s30.4，q29.9，q181.3，s12.4，q25.7，q

8，10，139，14，189，14，1817，3017，3013，2018，2112，14，171，5，913，2117，2221212526，2726，2725，2725，263，4，288，14，15

12a，12b1111161615a，15b16，2017，212020，2320，2322，242323

3019，2018，2918195，17

注：^aVarian Inova 400MHz；溶剂C₅D₅N，化学位移单位ppm，¹H-NMR和¹³C-NMR分别以溶剂中残存的吡啶(δ7.20，7.57，8.73ppm)和氘代吡啶内标(δ_C123.6，135.5，149.9)；^b核磁共振信号的归属是在HMQC、HMBC等二维谱基础上完成的；^c由DEPT谱完成信号归属。

实施例2：

海莲酸衍生物的制备

1、海莲酸甲酯(R₁为氢、R₂为甲基)的制备

称取海莲酸2.0mg于25mL圆底烧瓶中，加入溶有1mg CH₂N₂的乙醚溶液2mL，室温反应18h，减压除去乙醚和CH₂N₂，得海莲酸甲酯(R₁＝H、R₂＝CH₃)。

2、3-乙酰氧基海莲酸(R₁为Ac、R₂为氢)的制备

称取海莲酸2.0mg于25mL圆底烧瓶中，加入无水吡啶和乙酸酐各1.5mL，室温反应18h，减压除去吡啶和乙酸酐，得3-乙酰氧基海莲酸(R₁＝Ac、R₂＝H)。

试验性实施例：

羊毛脂烷型三萜化合物海莲酸的抗肿瘤活性测试

测试原理：MTT法活细胞的线粒体中存在与NADP相关的脱氢酶，可将黄色的MTT(3-(4，5-dimethylthiazol-2-y1)-2，5-diphenyltetrazolium bromide)还原为不溶性的蓝紫色甲臢(Formazan)，死细胞此酶消失，MTT不被还原。用三联液溶解甲臢后可用酶标仪在570nm处检测光密度值。光密度值与活细胞数成正比。

实验方法：MTT法按不同肿瘤生成速率，将一定数量处于对数生长期的A-549，HL-60肿瘤细胞90μl/孔分别接种于96孔培养板内，培养24小时后加入药液10μl/孔(即海莲酸溶解于培养基中)，对每个细胞株，每个浓度均为三个复孔。肿瘤细胞在37℃、5％CO₂条件下培养48小时后，加MTT(Sigma)液5mg/ml用生理盐水配制20μl/孔；继续培养4小时后，加入三联液(10％SDS-5％异丁醇-0.01mol/L HCl)50μl/孔，于CO₂培养箱中过夜。然后在570nm用酶标仪测定OD值。

实验结果见表2。

表2  抗肿瘤活性测试实验结果

羊毛脂烷型三萜

对肿瘤细胞的抑制率(％)

A-549

HL-60

10-4M

10-5M

10-6M

10-7M

10-8M

10-4M

10-5M

10-6M

10-7M

10-8M

海莲酸

95.9

95.9

95.7

90.0

84.3

72.8

44.2

65.2

46.6

27.0

经多次体外抗肿瘤活性实验表明，海莲酸具有显著的抗肿瘤作用。因此，可以用来治疗癌症，尤其是肺癌和白血病。

Claims (9)

1.一类羊毛脂烷型三萜化合物海莲酸或其衍生物，其特征在于所述海莲酸或其衍生物的结构式如下：

其中，

R₁为氢或C2～C6的烷酰基；

R₂为氢或C1～C6的烷基。

2.根据权利要求1所述的海莲酸或其衍生物，其特征在于，

其中，

R₁为氢或C2～C4的烷酰基；

R₂为氢或C1～C4的烷基。

3.根据权利要求2所述的海莲酸或其衍生物，其特征在于，

其中，

R₁为氢或乙酰基；

R₂为氢或甲基。

4.根据权利要求3所述的海莲酸或其衍生物，其特征在于，具体为：

5.权利要求1所述的羊毛脂烷型三萜化合物海莲酸或其衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

海莲用醇渗漉提取，减压浓缩提取液得粗浸膏；将该粗浸膏溶于NaCl溶液，混悬均匀后用乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯萃取液得到乙酸乙酯浸膏；

乙酸乙酯浸膏经反复硅胶柱层析，后经凝胶Sephadex LH-20纯化得到羊毛脂烷型三萜化合物海莲酸；

进一步，海莲酸通过酯化反应或烷基化反应，得到其相应的衍生物。

6.根据权利要求5所述的海莲酸或其衍生物的制备方法，其特征在于，所述醇为甲醇或乙醇。

7.根据权利要求5所述的海莲酸或其衍生物的制备方法，其特征在于，所述NaCl溶液为0.7～1.5N。

8.根据权利要求5所述的海莲酸或其衍生物的制备方法，其特征在于，其中的乙酸乙酯浸膏经200-300目硅胶柱层析，分别以石油醚/乙酸乙酯体积比为100∶0→90∶10→80∶20→50∶50→20∶80→10∶90→0∶100梯度洗脱；将其中体积比石油醚/乙酸乙酯10∶90洗脱部分经200-300目硅胶柱层析，分别以氯仿/甲醇体积比为100∶0→95∶5→90∶10梯度洗脱；再将其中体积比氯仿/甲醇95∶5洗脱部分经Sephadex LH-20凝胶柱层析，以体积比氯仿/甲醇1∶1洗脱并纯化，即得海莲酸。

9.权利要求1至4任意一项所述的羊毛脂烷型三萜化合物海莲酸或其衍生物在制备治疗肺癌和/或白血病药物中的应用。