CN113773193A - 羊毛脂烷型三萜化合物及其在制备抗炎药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物领域，公开了一种羊毛脂烷型三萜化合物及其在制备抗炎药物中的应用。本发明提供的羊毛脂烷型三萜化合物，其结构式为式(I)或者式(II)所示。本发明还提供了上述的的羊毛脂烷型三萜化合物、其药学上可接受的衍生物或其前药在制备抗炎药物中的应用。本发明提供的抗炎药物含有活性成分和药学上可接受的辅料，所述活性成分为上述的羊毛脂烷型三萜化合物、其药学上可接受的衍生物或其前药。本发明提供的羊毛脂烷型三萜类化合物具有明显的抗RA和/或抗炎活性，从而提供一种新颖且高度有利的预防和治疗风湿、类风湿性关节炎等多种炎症的方式。
Figure DDA0003175524170000011

Description

羊毛脂烷型三萜化合物及其在制备抗炎药物中的应用
技术领域
本发明涉及药物领域，具体地，涉及一种羊毛脂烷型三萜化合物及其在制备抗炎药物中的应用。
背景技术
炎症是机体对于内部和外部刺激产生的一种防御性免疫反应，它能够促进机体对组织进行修复和对外界入侵的病原微生物进行清除，在维持机体稳态方面发挥重要作用。然而炎症反应又好比一把双刃剑，适度可控的炎症反应对机体有益，但当炎症得不到消退形成不可控的慢性炎症时会对机体产生危害。目前发现的与慢性炎症有关的疾病有很多，比如类风湿性关节炎、肥胖症、2型糖尿病、动脉粥样硬化、阿尔茨海默病、红斑狼疮、癌症等。针对慢性炎症引起的疾病，主要的治疗手段是抗炎症治疗。
抗炎药是临床上仅次于抗感染药物的第二大类药物。目前，临床上应用抗炎药物大致可以分为：非甾体抗炎药、甾体类抗炎药。非甾体抗炎药(NSAIDs)具有解热、镇痛、抗炎、抗风湿的作用，其药理作用主要是通过影响花生四烯酸的代谢产物而发挥的。随着NSAIDs需求的日益增多，由其引起的消化道副作用日益突出，尤其在胃肠道。甾体类抗炎药包括氢化可的松、地塞米松、布地缩松等，能从多个环节影响炎症及免疫过程。但是长期大剂量使用糖皮质激素会引起许多不良反应，如：消化系统并发症、诱发或加重感染、医源性肾上腺皮质功能亢进、心血管系统并发症、骨质疏松、肌肉萎缩、伤口愈合迟缓等。鉴于目前的抗炎症药物的疗效和副作用，人们愈来愈重视从天然药物中开发抗炎药物。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺乏天然抗炎药物的问题，提供一种羊毛脂烷型三萜化合物及其在制备抗炎药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种羊毛脂烷型三萜化合物，其结构式为式(I)或者式(II)所示：
Figure BDA0003175524150000021
本发明第二方面提供上述的的羊毛脂烷型三萜化合物、其药学上可接受的衍生物或其前药在制备抗炎药物中的应用。
优选地，所述抗炎药物为用于预防和/或治疗风湿、类风湿性关节炎的药物。
优选地，所述抗炎药物为抑制RA-FLS细胞和/或RAW 264.7细胞表达的抗炎药物。
优选地，所述抗炎药物为口服剂型或者外用剂型。
本发明第三方面提供一种抗炎药物，含有活性成分和药学上可接受的辅料，所述活性成分为羊毛脂烷型三萜化合物、其药学上可接受的衍生物或其前药；所述羊毛脂烷型三萜化合物的结构式为式(I)和/或式(II)所示：
Figure BDA0003175524150000031
优选地，所述抗炎药物为用于预防和/或治疗风湿、类风湿性关节炎的药物。
优选地，所述抗炎药物为抑制RA-FLS细胞和/或RAW 264.7细胞表达的药物。
优选地，所述抗炎药物为口服剂型或者外用剂型。
优选地，所述抗炎药物为外用透皮吸收制剂。
通过上述技术方案，本发明的有益效果为：
本发明提供的羊毛脂烷型三萜类化合物中，式(I)所示的化合物不仅对抑制类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞(RA-FLS)具有明显的细胞毒性，而且能够抑制炎症因子IL-6和TNF-α的生成；式(II)所示的化合物能够明显抑制炎症因子IL-6和TNF-α的释放；本发明所提供的羊毛脂烷型三萜类化合物具有明显的抗RA和/或抗炎活性，从而提供一种新颖且高度有利的预防和治疗风湿、类风湿性关节炎等多种炎症的方式。
附图说明
图1是RA-FLS细胞经不同浓度的化合物A处理后显微镜观察图；
图2是在不同浓度的化合物A作用下RA-FLS细胞的增殖率；
图3是在不同浓度的化合物A作用下RA-FLS细胞的荧光检测图；
图4是在不同浓度的化合物A作用下RA-FLS细胞的细胞凋亡率；
图5是在不同浓度的化合物A作用下RA-FLS细胞中Bax、Caspase-3和GAPDH蛋白的电泳图；
图6是在不同浓度的化合物A作用下RA-FLS细胞的Bax蛋白相对水平；
图7是在不同浓度的化合物A作用下RA-FLS细胞的Caspase-3蛋白相对水平；
图8是在不同浓度的化合物A作用下RAW 264.7细胞的IL-6的分泌情况；
图9是在不同浓度的化合物A作用下RAW 264.7细胞的TNF-α的分泌情况；
图10是在不同浓度的化合物A作用下RA-FLS细胞的IL-6的分泌情况；
图11是在不同浓度的化合物A作用下RA-FLS细胞的TNF-α的分泌情况；
图12是在不同浓度的化合物A作用下RAW 264.7细胞中β-Actin、IκBα、NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白的电泳图；
图13是在不同浓度的化合物A作用下RAW 264.7细胞中NF-κB p65蛋白相对水平；
图14是在不同浓度的化合物A作用下RAW 264.7细胞中IκBα蛋白相对水平；
图15是在不同浓度的化合物A作用下RAW 264.7细胞中p-NF-κB p65蛋白相对水平；
图16是在不同浓度的化合物A作用下RA-FLS细胞中β-Actin、IκBα、NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白的电泳图；
图17是在不同浓度的化合物A作用下RA-FLS细胞中NF-κB p65蛋白相对水平；
图18是在不同浓度的化合物A作用下RA-FLS细胞中IκBα蛋白相对水平；
图19是在不同浓度的化合物A作用下RA-FLS细胞中p-NF-κB p65蛋白相对水平；
图20是在不同浓度的化合物A作用下RA-FLS细胞中MMP-1的含量水平；
图21是在不同浓度的化合物A作用下RA-FLS细胞中MMP-3的含量水平。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
第一方面，本发明提供了一种羊毛脂烷型三萜化合物，其结构式为式(I)或者式(II)所示：
Figure BDA0003175524150000051
Figure BDA0003175524150000061
本发明中，所述羊毛脂烷型三萜类化合物可以是合成的或从各自植物的提取物获得的，具体是从五味子科(Schisandraceae)，具体地从五味子属(Schisandra Michx.)或者南五味子属(KadsuraKaempf.ex Juss.)的植物，更优选来自五味子属的植物。
本发明中，术语羊毛脂烷型三萜类化合物通常是指C-3位主要被羟基或羰基取代，环内双键多在C-8(9)、C-9(11)，C-12位多为OH或OAc取代，侧链主要为24(Z)-烯-26-酸或22，26内酯环。本发明的羊毛脂烷型三萜类化合物具有式(I)或式(II)表示的结构，还包括其药学上可接受的衍生物或其前药。
第二方面，本发明提供了上述的的羊毛脂烷型三萜化合物、其药学上可接受的衍生物或其前药在制备抗炎药物中的应用。
根据本发明，上述羊毛脂烷型三萜类化合物的药学上可接受的衍生物或前药包括其任何药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、无水物以及对映体和以上的混合物，立体异构形式、外消旋体、非对映异构体及其混合物。如本文所用，术语“溶剂化物”是指由溶质形成的各种化学计量的复合物，即由溶质(即羊毛脂烷型三萜类化合物)和溶剂形成。如果溶剂是水，形成的溶剂化物是水合物。适当的药学上可接受的盐是适合给予对象的盐，对象具体可以为哺乳动物，并且药学上可接受的盐可以是用足够的纯度制备并用于制备药物组合物。
本发明中所述的应用即提供了一种治疗炎症的方法，该方法包括向对象施用有效量的式(I)和/或式(II)所示的羊毛脂烷型三萜类化合物、其药学上可接受的衍生物或其前药的步骤。术语“有效量”通常指足以产生预防/治疗上的理想结果的剂量，其中所述结果的性质取决于所预防/治疗的具体病症而变化。例如，炎症为类风湿性关节炎，其结果通常是指抑制类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞(RA-FLS)的增殖、减少类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞或改善与类风湿性关节炎有关的症状。本发明的羊毛脂烷型三萜类化合物的有效量取决于对象的种类、体重、年龄和个体情况，以及可由如实验程序如细胞培养或动物实验确定。
优选情况下，本发明所述的抗炎药物为用于预防和/或治疗风湿、类风湿性关节炎的药物。
根据本发明，术语“类风湿性关节炎”(RA)主要指在关节处造成慢性炎症的自身免疫性疾病，在一些情况下也在其他身体部位造成慢性炎症。患有类风湿性关节炎的对象通常有肿胀和疼痛的关节、感觉僵硬和关节功能丧失等症状。
根据本发明，所述抗炎药物除能够针对风湿、类风湿性关节炎进行抗炎作用外，还能够对其它炎症进行相应的预防和治疗作用。相应地，所述抗炎药物可以是抑制RA-FLS细胞表达的药物，也可以是抑制其它细胞表达的药物，例如，抑制RAW 264.7细胞表达的药物。
根据本发明，抑制类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞(RA-FLS)和/或RAW 264.7细胞表达增殖的方法，具体过程包括：将一群RA-FLS细胞和/或RAW 264.7细胞接触如上所述的羊毛脂烷型三萜类化合物、其药学上可接受的衍生物或其前药。本领域中，可以采用MTT分析或流式细胞术分析测量上述的羊毛脂烷型三萜类化合物或抗炎药物对RA-FLS和/或RAW264.7细胞死亡和细胞活力的影响。
本发明中，用于接触RA-FLS细胞和/或RAW 264.7细胞的羊毛脂烷型三萜类化合物的浓度可以为0.1μM至20μM，优选5μM至10μM，具体是5μM、6μM、7μM、8μM、9μM或10μM。
根据本发明，所述抗炎药物可以为口服剂型或者外用剂型。所述外用剂型选自：膏药、巴布剂、软膏剂、乳膏剂、酊剂、凝胶剂、气雾剂、喷雾剂；所述口服剂型选自：片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、溶液剂。优选情况下，所述药物为外用透皮吸收制剂。
第三方面，本发明提供了一种抗炎药物，含有活性成分和药学上可接受的辅料，所述活性成分为羊毛脂烷型三萜化合物、其药学上可接受的衍生物或其前药；所述羊毛脂烷型三萜化合物的结构式为式(I)和/或式(II)所示：
Figure BDA0003175524150000081
优选地，所述抗炎药物为用于预防和/或治疗风湿、类风湿性关节炎的药物。
优选地，所述抗炎药物为抑制RA-FLS细胞和/或RAW 264.7细胞表达的药物。
优选地，所述抗炎药物为口服剂型或者外用剂型。
优选地，所述抗炎药物为外用透皮吸收制剂。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例中，酶标仪采用微孔板检测器(北京恒奥德HAD496/HAD)，旋光值(OR)采用日本JASCO P-1020型旋光仪测定；紫外光谱(UV)采用日本JASCO V-550紫外/可见光谱仪测定；红外光谱(IR)采用日本JASCO FI/IR-480 Plus Fourier Transform型红外光谱仪(KBr压片)测定；圆二色谱(CD)用日本分光Jasco-180圆二色谱仪测定；核磁共振谱(NMR)采用BrukerAV-600型核磁共振仪测定；高分辨质谱(HR-ESI-MS)采用UHPLC-H-CLASS/XEVOG2-XS Q-tof或Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS.型质谱仪测定；分析型高效液相色谱(HPLC)采用Agilent1260型高效液相色谱仪(G1311C四元泵系统和G1315D二极管阵列检测器)；制备型高效液相色谱(PHPLC)采用Agilent 1260型高效液相色谱仪(G1310B单元泵系统和G1365D MWD检测器)。硅胶GF254薄层预制板购自烟台化学工业研究所；柱层析硅胶(100-200目和200-300目)购自青岛海洋化工公司；RP-18柱层析填料(60-80μm)购自Merck公司；Sephadex LH-20柱层析色谱填料购自Amershanm Biosciences公司；分析型HPLC色谱柱采用Cosmosil C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)、制备型HPLC色谱柱采用CosmosilC18色谱柱(20×250mm，5μm)、Cosmosil C18色谱柱(10×250mm，5μm)，氘代试剂为美国CIL公司生产；类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞(RA-FLS)购于丰晖生物公司，RAW264.7细胞购于上海富衡生物科技有限公司，其它化学试剂均为分析纯或色谱纯。
以下实施例中，RA-FLS细胞的培养过程为：取细胞培养瓶，将RA-FLS细胞使用含有100U/mL的青霉素、100μg/mL的链霉素作为双抗，接种至含有10wt.％胎牛血清(FBS)的DMEM/F-12培养基中(接种量为103CFU/孔)，在温度为37℃、CO2浓度为5％的条件下培养，待RA-FLS细胞贴壁，呈对数生长趋势，2-3天传代一次，准备进一步实验；
RAW264.7细胞(小鼠RAW264.7巨噬细胞)的培养过程为：将RAW264.7细胞使用含有100U/mL的青霉素、100μg/mL的链霉素作为双抗，接种至含有10wt.％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中(接种量为103CFU/孔)，在温度为37℃、CO2浓度为5％的条件下培养，待RAW264.7细胞贴壁，呈对数生长趋势，2-3天传代一次，准备进一步实验。
实施例1
(1)取黑老虎干燥根200kg，先用乙醇浸1h，再依次用5倍量、4倍量体积分数为80％的乙醇-水溶液分别进行回流提取2h，过滤收集提取液，在60℃条件下减压浓缩蒸干，得到乙醇浸膏5.3kg；
(2)将3kg乙醇浸膏用5L蒸馏水分散后，依次用5L石油醚、5L氯仿、5L乙酸乙酯和5L正丁醇分别进行3次萃取，得到石油醚萃取部位浸膏181.2g、二氯甲烷萃取部位浸膏1225.5g、乙酸乙酯萃取部位浸膏562.9g、正丁醇萃取部位浸膏655.8g；
(3)将二氯甲烷萃取部位浸膏经硅胶柱进行梯度洗脱，以色谱环己烷-乙酸乙酯混合液(体积比为80:1，20:1，10:1，5:1，1:1，0:1)为洗脱液，得到12个馏分(Fr.A-Fr.J)，将馏分Fr.E(49.5g)经硅胶柱进行梯度洗脱，以色谱环己烷-二氯甲烷混合液(体积比为80:1，20:1，10:1，5:1，1:1，0:1)为洗脱液，得到馏分Fr.E5(2.0g)和馏分Fr.E9(68.7mg)；
(4)将馏分Fr.E5进行硅胶柱层析，用正己烷-氯仿-丙酮混合液(体积比为10:20:1，20:10:1，20:20:1，40:10:1)进行梯度洗脱，将经体积比为20：20：1的正己烷-氯仿-丙酮混合液洗脱得到的提取液纯化，得到100.0mg化合物A；
(5)将馏分Fr.E9(68.7mg)进行半制备液相分离，用甲醇-水系统(体积比为70:30)进行等度洗脱50min，收集保留时间为38.20min到38.26min的馏分，得到5.0mg的化合物B。
化合物A为白色无定形粉末，经高分辨质谱分析得到的HR-ESI-MS谱显示，化合物A的准分子离子峰m/z 437.3417[M-H]-(calcd.for 437.3420,C30H45O2)，可确定化合物A的分子式为C30H46O2，具有8个不饱和度。
化合物A经核磁共振分析的1H NMR数据见表1、13C NMR数据见表2，其1D和2D NMR数据显示，化合物A是一个典型的3，4-seco羊毛脂烷型三萜酸，根据1H NMR、13C NMR、1H-1HCOSY、HSQC、HMBC和ROESY谱图的信息，确定化合物A的H3-19的甲基是被认定为β构型，且H3-19与H-9有NOE相关，提示H-9也为β构型。另外，由于没有在H-22和H-23之间没有观察到NOE相关，说明在C-22和C-23之间的双键是反式构型，在1H NMR中耦合常数为15.0Hz也可以确定。化合物A的绝对构型是通过ECD确定的，其绝对构型确定为5S，9S，10S，13R，14R，17R，20R。因此，化合物A被鉴定为结构式如式(I)所示：
Figure BDA0003175524150000111
化合物B为白色无定形粉末，经高分辨质谱分析得到的HR-ESI-MS谱显示，化合物B的准分子离子峰m/z 453.3406[M-H]-(calcd.for 453.3374,C30H45O4)，可确定化合物B的分子式为C30H46O3，具有8个不饱和度。化合物B经核磁共振分析的1H NMR数据见表1、13C NMR数据见表2，综合分析其NMR数据，发现化合物B具有3，4-仲羊毛脂烷型三萜骨架；通过ROESY谱确定，化合物B的H3-19的甲基是被认定为β构型，且H3-19与H-9有NOE相关，提示H-9也为β构型。因此，化合物B被鉴定为结构式如式(II)所示：
Figure BDA0003175524150000121
表1
位置 化合物A 化合物B
1 2.31m 1.71m
2 1.60m；1.72m 2.23m；2.27m
5 2.08d(6.0) 2.82m
6 1.98m；2.26m -
7 5.31d(3.0) 5.92d(2.5)
9 2.58m 3.17m
11 1.55m；1.64m 1.73m
12 1.66m；1.85m 1.55m；1.64m
15 1.44m 1.79m；1.90m
16 1.20m；1.80m 1.32m；2.01m
17 1.54m 1.56m
18 0.78s 0.81s
19 0.86s 0.97s
20 2.11m 1.40m
21 1.00d(6.6) 0.91d(6.5)
22 5.42dd(15.0,8.5) 1.05m；1.45m
23 6.16dd(15.0,10.8) 1.88m；2.05m
24 5.75dd(10.8,0.7) 5.09t(6.9)
26 1.75s 1.61s
27 1.74s 1.69s
28 4.88brs；4.82brs 4.85brs；5.03brs
29 1.80s 1.87s
30 1.03s 1.11s
表2
位置 化合物A 化合物B 位置 化合物A 化合物B
1 29.0t 28.5t 16 28.7t 27.7t
2 28.9t 28.5t 17 53.0d 52.5d
3 179.2s 177.9s 18 22.0q 21.7q
4 149.9s 141.1s 19 24.2q 22.8q
5 45.5d 61.4d 20 40.7d 35.7d
6 29.8t 200.2s 21 20.4q 18.3q
7 117.9d 123.7d 22 138.7d 35.9t
8 146.7s 175.3s 23 124.4d 25.0t
9 38.8d 40.3d 24 125.4d 124.9d
10 36.5s 42.0s 25 132.9s 131.2s
11 18.7t 17.8t 26 26.1q 17.7q
12 33.9t 33.1t 27 18.4q 25.7q
13 43.8s 43.1s 28 112.1t 114.5t
14 51.8s 53.3s 29 26.1q 26.3q
15 34.2t 32.8t 30 27.6q 25.1q
实施例2
(1)将上述获得的RA-FLS细胞培养液移除原有培养基得到培养细胞(约5×106个)，用1×PBS清洗2次，每个细胞培养瓶中加入含0.02wt.％乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化液500μL，置于温度为37℃、CO2浓度为5％的培养箱中培养2min使细胞消化，再加入500μL含有10wt.％胎牛血清(FBS)的DMEM/F-12(1：1)培养基，将细胞终止消化，充分混匀后，转移至1mL的EP管中，再以800rpm转速离心5min，弃除上清液得到消化细胞，将消化细胞与1mL含有10wt.％FBS的DMEM/F-12(1：1)培养基混合，使得消化细胞重悬，再用含有10wt.％FBS的DMEM培养基稀释，制成细胞浓度为1×104CFU/mL的细胞混悬液备用；
(2)将孔板设置为5大组，两个大组为药物处理组，且分别与实施例1获得的化合物A和化合物B相对应(每个药物处理组包括药物终浓度为1、2、4、6、8、16、20μM的七个小组)，其余大组分别为对照组、甲氨蝶呤(MTX)药物组(包括MTX终浓度分别为5、1、0.1μM的三个小组)和空白组(只加入含MTT的培养液100μL/孔)；将上述细胞混悬液用以每孔100μL移到药物处理组、甲氨蝶呤对照组和对照组所对应的孔中，再将孔板放置在CO2培养箱中，在温度为37℃、CO2浓度为5％的条件下培养24h，细胞贴壁生长至孔板的85％时，将培养基移除，用1×PBS清洗2次，加入含有1wt.％FBS的DMEM/F-12(1：1)培养基；药物处理组分别加入对应的化合物A或化合物B，根据其分子量和质量，通过摩尔浓度计算公式，加入相应体积，使其在100μL体系中的终浓度为1、2、4、6、8、16、20μM，MTX对照组加入MTX使得MTX终浓度为5、1、0.1μM，每个小组均设置6个复孔对照组中不添加药物；将药物处理组、MTX对照组和对照组处理好的细胞于温度为37℃、CO2浓度为5％的培养箱中培养48h；
(3)先观察药物处理组RA-FLS细胞的生长状态，在倒置相差显微镜下放大20倍观察到大量RA-FLS细胞皱缩，变成圆形并漂浮在表面(结果见图1)；随后，弃去培养液，将各个孔中的RA-FLS细胞用含10％噻唑蓝(MTT)的无血清DMEM/F-12(1：1)培养基孵育4h后，弃上清液，每孔加入100μL的DMSO，在摇床上避光震荡10min，使结晶物充分溶解，在酶标仪上于492nm处检测OD值，与对照组对比，比较不同化合物对RA-FLS细胞的抑制作用。
根据以下公式计算出细胞存活率，绘制浓度-细胞存活率标准曲线，计算出各药物(化合物A和化合物B)对RA-FLS细胞的IC50值，并以IC50值小于20μM的化合物为有较好的抗RA活性。
细胞存活率＝(药物处理组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100％。
经计算得出，化合物A显著抑制了RA-FLS细胞的增殖，其IC50值为8.16μM；化合物A对应的IC50值小于20μM，具有较好的抗RA活性。
实施例3
利用实施例1获得的化合物A重复实施例2中的步骤(1)和步骤(2)，对RA-FLS细胞进行处理，弃去培养基，并加入含CCK-8的培养基，每孔中含有10μL的CCK-8和90μL的细胞培养液，放入培养箱中继续培养45min，待颜色变为橙色后，将孔板取出，在酶标仪上于450nm波长检测OD值。CCK-8试验结果显示，化合物A以浓度依赖性方式抑制了RA-FLS细胞的增殖，结果见图2。
实施例4
(1)取上述对数生长期的RAW264.7细胞培养液移除原有培养基得到培养细胞(约5×106个)，用1×PBS清洗2次，每个细胞培养瓶中加入500μL含0.25wt.％乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶细胞消化液，并放置于温度为37℃、CO2浓度为5％的培养箱中培养消化4min，再加入1mL含有10wt.％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基终止消化，收集细胞，转移至1.5mL的EP管中，再以800rpm转速离心5min，移除上清得到消化细胞，将消化细胞与1mL含有10wt.％FBS的DMEM培养基混合，使得消化细胞重悬，再用10mL含有10wt.％FBS的DMEM培养基制成细胞浓度为1×105CFU/mL的单细胞悬液；
(2)将孔板设置为5大组，两个大组为药物处理组，且分别与实施例1获得的化合物A和化合物B相对应(每个药物处理组包括药物终浓度为1、2、4、6、8、16、20μM的七个小组)，其余大组分别为对照组、甲氨蝶呤(MTX)对照组(包括MTX终浓度分别为5、1、0.1μM的三个小组)和空白组(只加入含MTT的培养液100μL/孔)；将上述单细胞悬液以每孔100μL均匀接种到药物处理组、甲氨蝶呤对照组和对照组所对应的孔中，再将孔板放置在CO2培养箱中，在温度为37℃、CO2浓度为5％的条件下培养，待细胞贴壁良好后，移除培养基，用1×PBS清洗一次，各孔加入100μL含有1wt.％FBS的DMEM培养基；药物处理组分别加入对应的化合物A或化合物B，根据其分子量和质量，通过摩尔浓度计算公式，加入相应体积，使其在100μL体系中的终浓度为1、2、4、6、8、16、20μM，MTX对照组加入MTX使得MTX终浓度为5、1、0.1μM，每个小组均设置6个复孔，对照组中不添加药物；将药物处理组、MTX对照组和对照组处理好的孔板于温度为37℃、CO2浓度为5％的培养箱中培养20h；
(3)除对照组外其余各组均加入脂多糖(LPS)使其终浓度为100ng/mL，再置于温度为37℃、CO2浓度为5％的培养箱诱导4h，共计用药物处理细胞24h，收集细胞上清液，以转速3000rpm离心10min，小心吸取上清液，将上清液利用炎性细胞因子TNF-α、IL-6的ELISA试剂盒说明书进行检测，在酶标仪上于450nm波长检测OD值，根据标准曲线计算出IC50值。
经计算得出，化合物A和化合物B均能够明显抑制细胞上清液中的TNF-α和IL-6的释放，化合物A和化合物B对炎性细胞因子TNF-α的IC50值分别为1.42μM、21.41μM，对炎性细胞因子IL-6的IC50值分别为1.47μM、8.15μM。
实施例5
将上述获得的RA-FLS细胞培养液移除原有培养基得到培养细胞(约5×106个)，接种到6孔板中，用实施例1获得的化合物A(浓度分别为0、5、10、20μM)孵化48h后，加入500μL不含有EDTA的胰酶消化液，将细胞消化后收集并置于1.5mL的EP管中，将细胞悬液用高速离心机在温度为4℃转速为2000rpm的条件下离心5min，弃除上清液得到消化细胞，将消化细胞用1×PBS清洗2次，去掉PBS液，收集5×105个细胞，加入500μL的结合缓冲液(BindingBuffer)使细胞重悬，再加入5μL Annexin V-FITC(细胞凋亡检测试剂)，将其与细胞充分混匀后，加入5μL碘化丙啶(PI)，将其进一步混匀得到细胞处理液，在室温条件下，避光反应10min，反应后的1h内用流式细胞仪的观察和检测。
将上述的细胞处理液吸取进入专用的流式管，用流式细胞仪在激发波长Ex＝488nm、发射波长Em＝530nm处进行检测，Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道(FL1)检测，PI红色荧光(流式Ex＝488nm、Em≥630nm)通过FL3通道进行检测，使用经凋亡诱导处理的正常细胞作为对照组，进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。
流式细胞仪的检测结果显示，与对照组相比，化合物A(5、10、20μM)处理后，RA-FLS细胞的凋亡率明显升高，结果见图3和图4。经Western blot分析证实，化合物A处理使得RA-FLS细胞中Bax和Caspase-3水平的表达增加，结果见图5至图7。
实施例6
利用实施例1获得的化合物A分别重复实施例2和实施例4中的步骤(1)和步骤(2)，对RA-FLS细胞和RAW 264.7细胞进行处理，以LPS(终浓度为100ng/mL)诱导RA-FLS细胞和RAW 264.7细胞分别作为模型组，诱导温度为37℃、CO2浓度为5％、诱导时间为4h；
将药物处理组和模型组的孔板上清液移除，收集上清液中的细胞，再用刮刀将6孔板底部的细胞刮干净，收集至1.5mL的EP管中，再用PBS清洗3次，每个EP管中加入1mL蛋白裂解液，在冰上裂解30min以提取细胞蛋白；将细胞蛋白用BCA定量试剂盒进行浓度测试，然后加入Loading buffer上样缓冲液在100℃变性10min，通过SDS-PAGE凝胶电泳，转膜、一抗孵育、二抗孵育、显影，用免疫印迹试验(Western blot法)检测RA-FLS细胞或RAW 264.7细胞中Bax(1:1000，CST)，Caspase-3(1:1000，CST)，IκBα(1:1000,CST)，NF-κB p65(1:1000，CST)，p-NF-κB p65(1:1000，CST)，β-Actin(1:5000，CST)蛋白的表达水平，结果见图12至图19。
NF-κB信号通路在促炎因子的表达过程中十分重要，经Western blot法检测结果显示，与模型组比较，化合物A能抑制LPS诱导的RA-FLS细胞和RAW 264.7细胞中p-NF-κBp65蛋白表达，上调IκBα蛋白表达，从而抑制NF-κB信号通路。
实施例7
利用实施例1获得的化合物A分别重复实施例2和实施例4中的步骤(1)和步骤(2)，对RA-FLS细胞和RAW 264.7细胞进行处理，以LPS(终浓度为100ng/mL)诱导RA-FLS细胞和RAW 264.7细胞分别作为模型组，诱导温度为37℃、CO2浓度为5％、诱导时间为4h；
采用ELISA试剂盒检测化合物A对LPS诱导的RA-FLS细胞和RAW264.7细胞进行处理时，TNF-α和IL-6的分泌情况，结果见图8至图11，以评价化合物A对炎症细胞因子的影响。结果显示，与模型组相比，化合物A处理均能抑制RA-FLS细胞和RAW 264.7细胞中IL-6和TNF-α的分泌。
大量研究表明，基质金属蛋白酶(MMPs)是与类风湿性关节炎(RA)密切相关的重要炎症介质，采用ELISA试剂盒检测化合物A对LPS诱导的RA-FLS细胞进行处理时，细胞上清中MMP-1或MMP-3水平。结果显示，与模型组比较，化合物A治疗能够显著降低MMP-1和MMP-3水平，结果见图20和图21，化合物A有效抑制了LPS诱导的RA-FLS细胞中MMPs的表达。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种羊毛脂烷型三萜化合物，其特征在于，其结构式为式(I)或者式(II)所示：
Figure FDA0003175524140000011
2.权利要求1所述的羊毛脂烷型三萜化合物、其药学上可接受的衍生物或其前药在制备抗炎药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗炎药物为用于预防和/或治疗风湿、类风湿性关节炎的药物。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗炎药物为抑制RA-FLS细胞和/或RAW264.7细胞表达的药物。
5.根据权利要求2至4中任意一项所述的应用，其特征在于，所述抗炎药物为口服剂型或者外用剂型。
6.一种抗炎药物，其特征在于，含有活性成分和药学上可接受的辅料，所述活性成分为羊毛脂烷型三萜化合物、其药学上可接受的衍生物或其前药；所述羊毛脂烷型三萜化合物的结构式为式(I)和/或式(II)所示：
Figure FDA0003175524140000021
7.根据权利要求6所述的抗炎药物，其特征在于，所述抗炎药物为用于预防和/或治疗风湿、类风湿性关节炎的药物。
8.根据权利要求6所述的抗炎药物，其特征在于，所述抗炎药物为抑制RA-FLS细胞和/或RAW 264.7细胞表达的药物。
9.根据权利要求6至8中任意一项所述的抗炎药物，其特征在于，所述抗炎药物为口服剂型或者外用剂型。
10.根据权利要求9所述的抗炎药物，其特征在于，所述抗炎药物为外用透皮吸收制剂。
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