CN109180632B

CN109180632B - 一种从雷公藤中分离出的化合物的制备方法

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Publication number: CN109180632B
Application number: CN201811253624.9A
Authority: CN
Inventors: 李鹏; 沈少欣; 刘凌雪; 张志强; 马新华; 石冬梅; 吴莺; 张旗
Original assignee: Fujian Medical University
Current assignee: Fujian Medical University
Priority date: 2018-10-25
Filing date: 2018-10-25
Publication date: 2020-10-16
Anticipated expiration: 2038-10-25
Also published as: CN109180632A

Abstract

本发明公开一种从雷公藤中分离出的新化合物及其制备方法和医药用途，化合物的制备方法，包括以下步骤：A、将雷公藤用醇或醇溶液提取后，过滤，收集滤液，再减压浓缩干燥，获得醇提取物；B、将醇提取物加水，并以乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯相蒸干后，得粗品；C、将获得的粗品进行色谱分离纯化，得到纯的式（Ⅰ）化合物：

本发明的化合物能作为治疗肿瘤的药物，其具有杀伤肿瘤细胞的作用，尤其对人口腔癌和肝癌具有较好的疗效。

Description

一种从雷公藤中分离出的化合物的制备方法

技术领域

本发明涉及一种从雷公藤中分离出的具有抗肿瘤作用的新化合物。

本发明还涉及该化合物的制备方法。

本发明还涉及以该化合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。

背景技术

在治疗癌症方面植物药具有较长的使用历史。已将中药用于改善癌症病人的普通状况。自然界提供了许多植物来源的抗癌药物，例如长春花碱、紫杉醇、雷公藤内酯醇等。这些从植物中分离的有效成分表现出良好的抗肿瘤效应，且相对于人工合成的化学药物来说，其毒性较低的优点使这些植物来源的抗癌药物在肿瘤治疗中得到了大量的应用。

雷公藤(TripterygiumWilfordi)为卫矛科植物一年生藤本植物，是我国传统医学中的一种常用中草药。其性温，味苦涩，具有抗炎、免疫抑制、抗生育、抗肿瘤、抗菌、止痛等活性。雷公藤含有多种化学成分，主要是二萜类、三萜类、倍半萜类及生物碱类等，研究表明，生物碱、二萜类等许多成分既是有效成分又是有毒成分。近 30 多年来雷公藤在临床应用上取得了良好效果，药理研究也取得很大进展，是一个有很大发展前景的药物。我们在针对雷公藤抗肿瘤作用的有效成分研究中，分离鉴定了一个新的二萜类化合物，命名为Triptotin B1。药理学实验表明，该化合物具有抗肿瘤活性。针对该化合物经过试验，确定了合理的制备方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种从雷公藤中分离出的具有抗肿瘤作用的新化合物（Triptotin B1）。

本发明的另一个目的在于提供制备该化合物方法。

本发明的再一目的在于提供该化合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。

根据本发明的一方面，提供具有下列化学结构式（Ⅰ）的化合物：

（Ⅰ）。

上述的化合物的制备方法，包括以下步骤：

A）将雷公藤用醇或醇溶液提取后，过滤，收集滤液，再减压浓缩干燥，获得醇提取物；

B）将醇提取物加水，并以乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯相蒸干后，得粗品；

C）将获得的粗品进行色谱分离纯化，得到纯的式（Ⅰ）化合物。

上述步骤C）的粗品进行色谱分离纯化的步骤为：1）将粗品在硅胶上进行柱层析，用体积比为10:1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，获得石油醚-乙酸乙酯洗脱物；2）取石油醚-乙酸乙酯洗脱物再进行硅胶柱层析，用体积比为20:1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，得石油醚-乙酸乙酯洗脱物；3）取石油醚-乙酸乙酯洗脱物经制备型高效液相色谱分离，用体积比为70:30的甲醇-水梯度洗脱，从甲醇-水洗脱部位得到纯的式（Ⅰ）化合物。

本发明上述的化合物或其衍生物在制备治疗肿瘤药物中的用途。

所述的肿瘤为人口腔表皮样癌细胞株KB或人肝癌细胞株HepG2。

本发明含有治疗有效量的上述的化合物或其衍生物的药物组合物。

所述的化合物和/或其衍生物的含量大于50%以上，尤其90%以上

具体地说，本发明的化合物可以人工合成，但优选的是从天然植物中分离提取，以获得天然存在的、低毒性的天然化合物。在本发明的一个优选实施方案中，从中国传统中药雷公藤中分离纯化了本发明的化合物，其制备步骤包括：

A）将雷公藤用醇或醇溶液提取一次或多次，过滤，收集滤液，再减压浓缩干燥，获得醇提取物；

B）将醇提取物加水，以石油醚萃取脱脂后，再以乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯相蒸干，获得粗品。

上述步骤C）的粗品进行色谱分离纯化的步骤包括如下：1）将粗品在硅胶上进行柱层析，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，获得石油醚-乙酸乙酯（体积比10:1）洗脱物；2）取石油醚-乙酸乙酯（体积比10:1）洗脱物再进行硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，得石油醚-乙酸乙酯（体积比20:1）洗脱物；3）取石油醚-乙酸乙酯（体积比20:1）洗脱物经制备型高效液相色谱分离，甲醇-水梯度洗脱，从甲醇-水（体积比70:30）洗脱部位得到纯的化合物（Ⅰ）。

根据本发明的再一方面，提供含有本发明化合物的药物组合物，可以通过将本发明化合物添加药学上可接受的载体或附形剂或可选的其他成分而制成适于临床使用的药物组合物。

根据本发明的再一方面，提供本发明化合物在制备治疗肿瘤药物中的应用，其具有杀伤肿瘤细胞的作用。

所述的肿瘤优选为人口腔表皮样癌细胞株KB和人肝癌细胞株HepG2。

实验表明在含有结构式（Ⅰ）的化合物和/或其衍生物的药物组合物中，其中结构式（Ⅰ）的化合物和/或其衍生物的含量大于50%以上，尤其90%以上，治疗效果较佳。

本发明的有益效果是：肿瘤细胞增殖的抑制作用，本发明的Triptotin B1对KB及HepG2细胞增殖有显著的抑制作用，均表现出明显的量效关系（见图1，图2）。药物作用于KB和HepG2细胞48 h的IC₅₀值分别是9.93 μg/ml和13.13 μg/ml。实验结果表明，本发明的化合物具有抗肿瘤活性。由上可知，本发明的化合物（Ⅰ）——Triptotin B1制备方法简便，工艺条件温和，化合物（1）为黄色晶体，实验证明采用本发明工艺步骤，获得的产品纯度可达98%，明显高于现有技术的步骤。本发明的化合物能作为治疗肿瘤的药物，其具有杀伤肿瘤细胞的作用，尤其对人口腔癌和肝癌具有较好的疗效。

附图说明

图1为本发明化合物（Ⅰ）（作用48h）对KB细胞增殖抑制作用的量效关系曲线。

图2为本发明化合物（Ⅰ）（作用48h）对HepG2细胞增殖抑制作用的量效关系曲线。

具体实施方式

下面通过对本发明实施例的描述，详细说明但不限制本发明。

实施例

实施例1 化合物的制备

材料来源雷公藤（TripterygiumWilfordi）购自桂林三棱生物科技有限公司，该药材的标本样本保藏在福建医科大学药学院。

提取和分离将干的和粉碎的25 kg雷公藤用100 L无水乙醇回流提取3次，每次3h，合并3次提取液，提取液用旋转蒸发器减压浓缩，真空干燥得醇浸膏（1.25kg）。1.25kg醇浸膏加适量水后，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液减压浓缩蒸干得粗品（100g），将粗品在硅胶上进行柱层析，以石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱，得到石油醚-乙酸乙酯（10:1）洗脱部位；取此部位再经硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，得到石油醚-乙酸乙酯（20:1）洗脱部位；取此部位经制备型高效液相色谱分离，甲醇-水梯度洗脱，从70%甲醇洗脱部位得到纯的化合物（Ⅰ）。化合物（Ⅰ）为黄色晶体，经测试纯度达98%。

实施例2 化合物（Ⅰ）的化学结构测定

结构测定用Shimadzu-3100分光光度计测定紫外光谱，在CDCl₃溶液中用BRUKER核磁共振波谱仪记录NMR光谱，用Agilent 6210飞行时间质谱仪测定质谱。

化合物（1）的理化性质本发明化合物（Ⅰ）为黄色晶体；¹H-NMR（CDCl₃，500MHz）：δ4.25(1H，dd，J=5.2，13.6 Hz，H-1)，δ2.80(1H，m，H-2)，δ2.60(1H，m，H-2’)，δ2.39(1H，m，H-4)，δ1.29(1H，m，H-5)，δ1.98(1H，m，H-6)，δ1.58(1H，m，H-6’)，δ2.74(1H，m，H-7)，δ2.25(1H，m，H-7’)，δ6.24(1H，s，H-12)，δ2.98(1H，m，H-15)，δ1.11(3H，d，J=6.8Hz，H-16)，δ1.06 (3H，d，J=6.9Hz，H-17)，δ1.16(3H，d，J=6.6Hz，H-18)，δ1.57(3H，s，H-19)；¹³C-NMR（CDCl₃，125MHz）：δ84.4(C-1), 40.5 (C-2)，206.7(C-3)，45.2(C-4)，43.9(C-5)，20.0(C-6)，23.7(C-7)，131.2(C-8)，147.5(C-9)，37.5(C-10)，93.7(C-11)，133.2(C-12)，147.1(C-13)，184.8(C-14)，26.5(C-15)，21.5(C-16)，21.4(C-17)，12.0(C-18)，13.1(C-19)；ESI-MS：m/z331.17[M-H]^-1。

从HMBC谱图及HSQC谱图数据，并结合上述理化数据，确证本化合物（Ⅰ）的结构式如下：

实施例3 化合物（1）抗癌作用的生物学实验及分析

1、材料和方法

细胞系和试剂用人口腔表皮样癌细胞株KB和人肝癌细胞株HepG2。将这些细胞在含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中培养，置37℃，5%饱和湿度的CO₂培养箱中培养。

细胞增殖分析取对数生长期的KB及HepG2细胞以1×10⁵/ml的初始浓度分别接种于96孔培养板中，每孔180 μl，实验组加入不同浓度药物20 μl/孔，细胞对照组加含等量浓度DMSO的无血清培养液，空白对照组为180 μl RPMI 1640加20 μl无药溶剂，每组3个复孔。KB、KBv200及HepG2细胞分别孵育48 h后，加入5 mg/ml的MTT 20 μl/孔，37℃孵育4 h后离心（2000 rpm，10分钟），小心吸去上清，加150 μl/孔DMSO混匀，各组均于570 nm波长处测定各孔的OD值，计算细胞生长抑制率，抑制率=(1-药物处理孔平均OD值/细胞对照孔平均OD值)×100%。以药物浓度为横轴，抑制率值为纵轴绘制细胞增殖抑制量效关系曲线。用Logit法计算48 h时药物浓度的IC₅₀值，实验重复3次，取平均值。图1为本发明化合物（Ⅰ）（作用48h）对KB细胞增殖抑制作用的量效关系曲线。图2为本发明化合物（Ⅰ）（作用48h）对HepG2细胞增殖抑制作用的量效关系曲线。

、结果

肿瘤细胞增殖的抑制作用 Triptotin B1对KB、及HepG2细胞增殖有显著的抑制作用。药物作用于KB细胞48 h IC₅₀值是9.93μg/ml；作用于KBv200细胞48 h的IC₅₀值是12.12μg/ml；作用于HepG2细胞48 h的IC₅₀值是13.13μg/ml。实验结果表明，本发明的化合物具有抗肿瘤活性。

Claims

1.一种从雷公藤中分离出的化合物的制备方法，包括以下步骤：

A、将雷公藤用醇或醇溶液提取后，过滤，收集滤液，再减压浓缩干燥，获得醇提取物；

B、将醇提取物加水，并以乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯相蒸干后，得粗品；

C、将获得的粗品进行色谱分离纯化，得到纯的式（Ⅰ）化合物；

上述步骤C的粗品进行色谱分离纯化的步骤为：1）将粗品在硅胶上进行柱层析，用体积比为10：1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，获得石油醚-乙酸乙酯洗脱物；2）取石油醚-乙酸乙酯洗脱物再进行硅胶柱层析，用体积比为20：1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，得石油醚-乙酸乙酯洗脱物；3）取石油醚-乙酸乙酯洗脱物经制备型高效液相色谱分离，用体积比为70：30的甲醇-水梯度洗脱，从甲醇-水洗脱部位得到纯的式（Ⅰ）化合物；

（Ⅰ）。