CN101445545B - 一种从雷公藤叶中分离雷公藤内酯醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从雷公藤叶中分离雷公藤内酯醇的方法，雷公藤叶粉末通过乙醇提取，乙醇提取物先用乙酸乙酯-水体系分配，上相蒸干得到乙酸乙酯萃取物，乙酸乙酯萃取物再用石油醚-甲醇体系分配，下相蒸干得到甲醇萃取物，通过以上两次分配减少了柱层析步骤的上样量。经过简单柱层析，蒸干洗脱剂得到雷公藤内酯醇粗品，用四元两相体系对该粗品进行分配，除去色素等杂质，减少了高速逆流色谱步骤的上样量，最后通过高速逆流色谱精制得到了雷公藤内酯醇精品，其纯度在95％左右，相对干叶子得率在0.008％以上。本方法所涉及到的溶剂不含对环境和人体损害较大的氯代溶剂。
Description
技术领域
本发明涉及植物有效成分提取技术，尤其涉及一种从雷公藤叶子中分离雷公藤内酯醇的方法。
背景技术
雷公藤(Tripterygium Wilfordii Hook.f，简称TWHF)是卫矛科(Celastraceae)雷公藤属木质藤本植物，是雷公藤(Tripterygium)属植物的一种，主要分布于我国长江以南地区和东北长白山区。雷公藤作为一种传统的中药(traditionalChinese medicine，TCM)在中国有数百年的应用历史，最早记录于《神农本草经》，名莽草，在《纲目拾遗》中有详细记载，又称断肠草、山砒霜、南蛇藤，由于毒性大，民间也有用于杀虫、毒鼠等。作为药物，雷公藤的主要药理作用是免疫系统作用、抗炎、抗生育作用。雷公藤提取物在治疗风湿性关节炎，牛皮癣，红斑狼疮等显示出了良好的效果。
雷公藤中的药效成分主要是雷公藤二萜内酯、雷公藤三萜类、雷公藤生物碱等，其中属于二萜内酯的雷公藤内酯醇(Triptolide)，又称雷公藤甲素，被认为是最主要的生理活性成分，因此从雷公藤中提纯雷公藤内酯醇具有重要的价值。1972年Kupchan等(Kupchan SM et al.，J.Am.Chem.Soc.1972.94(20)7194-7195)首次用乙醇提取，乙酸乙酯-水体系分配，再用反复柱层析的方法从雷公藤中分离出了具有免疫活性的雷公藤内酯醇、雷公藤内酯二醇和雷公藤内酯酮。其它提纯雷公藤内酯醇的方法有采用溶剂梯度萃取(Lipsky PE et al.，US Patent5294443，1996)，有乙醇提取后的浸膏分别用氯仿(Ren K et al.，US Patent2004018260，2004)、二氯甲烷(Wiedmann TWT et al.，Patent WO 9513082，1995)和水分配的，再通过多步的柱层析过程得到雷公藤内酯醇纯品。综上，目前提纯雷公藤内酯醇方法是雷公藤提取物经过多次反复柱层析。由于柱层析的不可逆吸附导致雷公藤内酯醇的得率较低。
高速逆流色谱是(high-speed countercurrent chromatography，HSCCC)是20世纪80年代发展起来的一种连续高效的液-液分配色谱分离技术(Ito Y，Journalof chromatography A，2005.1065(2)：145-468)。高速逆流色谱与柱色谱(CC)相比，不存在固体支撑，避免了不可逆吸附，从而避免了样品损失、失活、变性，分离时间短，节省溶剂；与制备高效液相色谱(PHPLC)相比，样品可以直接进样，没有纯度要求，而且样品可以全部回收，上样量大，重复性好，设备操作方便简单。通过以上对高速逆流色谱的了解，高速逆流色谱适用于植物有效成分的提取，特别是适用于植物提取的最后精制纯化步骤。本发明的最后精制过程使用了高速逆流色谱分离技术。
本发明从雷公藤内酯醇的溶解特性(雷公藤内酯醇易溶于乙酸乙酯、乙醇、甲醇，难溶于石油醚，基本不溶于水)出发，用几种对环境影响较小的常用溶剂，通过乙醇提取，乙酸乙酯-水体系和石油醚-甲醇体系分配，尽可能地减少了提取过程中雷公藤内酯醇的损失，同时减少了柱层析的上样量降低了成本，通过一次简单柱层析，得到雷公藤内酯醇粗品。为了减少高速逆流色谱的上样量，提高生产效率，将雷公藤内酯醇粗品用高速逆流色谱常用的四元两相溶剂体系进行分配，能够有效地除去一些杂质，富集雷公藤内酯醇。最后通过高速逆流色谱(HSCCC)精制得到纯度95％左右的雷公藤内酯醇，相对干叶子的得率在0.008％以上。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种从雷公藤叶中分离雷公藤内酯醇的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种从雷公藤叶中分离雷公藤内酯醇的方法，包括以下步骤：
(1)将雷公藤叶子磨成粉末，过筛，用乙醇回流提取2～4次，每次提取时间1～3小时，每次每克雷公藤叶粉末用4-6毫升乙醇，然后合并提取液，蒸干乙醇得到乙醇提取物；
(2)乙醇提取物用乙酸乙酯和水搅拌溶解并过滤，每克乙醇提取物需加入饱和了水的乙酸乙酯5-20毫升，加入饱和了乙酸乙酯的水5-20毫升，滤液分层12-24小时，分液，上相蒸干得到乙酸乙酯萃取物；
(3)乙酸乙酯萃取物用60-90℃石油醚和甲醇溶解，每克乙酸乙酯萃取物需加入饱和了60-90℃石油醚的甲醇5-20毫升，加入饱和了甲醇的石油醚5-20毫升，滤液分层1-10小时，分液，下相蒸干得到甲醇萃取物；
(4)甲醇萃取物上硅胶柱层析，每克甲醇萃取物吸附在一克硅胶上，每克甲醇萃取物需硅胶填料50～100克，需用体积比为1∶0.8～1.2的正己烷和乙酸乙酯的混合物250～500毫升洗脱，洗脱液浓缩蒸干得到雷公藤内酯醇粗品；
(5)雷公藤内酯醇粗品用正己烷～乙酸乙酯～乙醇～水所构成的四元两相体系分配，所述正己烷、乙酸乙酯、乙醇和水体积比为7～10∶2～4∶4～6∶4～6，分液，下相蒸干得到四元分配物；
(6)四元分配物上高速逆流色谱进行精制，所用的溶剂体系为正己烷～乙酸乙酯～乙醇～水，所述正己烷、乙酸乙酯、乙醇和水的体积比为3～5∶4～6∶3～5∶4～6，置于分液漏斗中，摇匀、静置分层，平衡后，将上、下相分开。用上相作固定相，下相作流动相，用上相充满整个高速逆流色谱中色谱柱，调整高速逆流色谱主机正转，将下相从柱子的首端泵入柱内进行洗脱，待整个体系建立动态平衡后由进样阀进样；或者下相作为固定相，上相作流动相，用下相充满整个高速逆流色谱中色谱柱，调整高速逆流色谱主机正转，将上相从柱子的尾端泵入柱内进行洗脱；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；根据检测器的谱图分步收集目标物，减压浓缩得到雷公藤内酯醇精品。
本发明的有益效果是：通过乙酸乙酯-水和石油醚-甲醇体系的分配，尽可能多地保留了雷公藤内酯醇，同时有效减少了柱层析步骤的上样量；用正己烷(或者环己烷或者正庚烷或者60-90℃的石油醚)～乙酸乙酯～乙醇(或者甲醇)～水构成的四元两相体系对该粗品进行分配，有效减少了高速逆流色谱步骤的上样量；此外本方法所涉及的溶剂不含对环境影响较大的氯代溶剂，相对环保。
具体实施方式
本发明从雷公藤内酯醇的溶解特性(雷公藤内酯醇易溶于乙酸乙酯、乙醇、甲醇，难溶于石油醚，基本不溶于水)出发，用几种对环境影响较小的常用溶剂，通过乙醇提取，乙酸乙酯-水体系和石油醚-甲醇体系分配，尽可能地减少了提取过程中雷公藤内酯醇的损失，同时减少了柱层析的上样量降低了成本，通过一次简单柱层析，得到雷公藤内酯醇粗品。
为了减少高速逆流色谱的上样量，提高生产效率，将雷公藤内酯醇粗品用高速逆流色谱常用的四元两相溶剂体系进行分配，能够有效地除去一些杂质，富集雷公藤内酯醇。最后通过高速逆流色谱(HSCCC)精制得到纯度95％左右的雷公藤内酯醇，相对干叶子的得率在0.008％以上。
本发明从雷公藤叶子中分离纯化雷公藤内酯醇的方法，包括以下步骤：
1、将干燥的雷公藤叶子磨成粉末，过40-200目筛，用乙醇回流(60-70℃)提取2～4次，每次提取时间为1～3小时，每次每克雷公藤叶粉末用4-6毫升乙醇，然后合并提取液，蒸干乙醇得到乙醇提取物。
2、乙醇提取物用乙酸乙酯和水搅拌溶解并过滤，每克乙醇提取物需加入饱和了水的乙酸乙酯5-20毫升，加入饱和了乙酸乙酯的水5-20毫升，滤液分层12-24小时，分液，上相蒸干得到乙酸乙酯萃取物；
3、乙酸乙酯萃取物用60-90℃石油醚(或者正己烷或者正庚烷)和甲醇溶解，每克乙酸乙酯萃取物需加入饱和了60-90℃石油醚的甲醇5-20毫升，加入饱和了甲醇的石油醚5-20毫升，滤液分层1-10小时，分液，下相蒸干得到甲醇萃取物；
4、甲醇萃取物上60-100目硅胶柱层析，每克甲醇萃取物吸附在一克硅胶上，每克甲醇萃取物需硅胶填料50～100克，需用体积比为1∶0.8-1.2的正己烷(或者60-90℃石油醚)和乙酸乙酯的混合物250～500毫升洗脱，洗脱液浓缩蒸干得到雷公藤内酯醇粗品；
5、雷公藤内酯醇粗品用正己烷(或者环己烷或者正庚烷或者60-90℃的石油醚)～乙酸乙酯～乙醇(或者甲醇)～水所构成的四元两相体系分配，其体积比为7～10∶2～4∶4～6∶4～6，分液，下相蒸干得到四元分配物；
6、四元分配物上高速逆流色谱进行精制，所用的溶剂体系为正己烷(或者正庚烷或者60-90℃的石油醚)～乙酸乙酯～乙醇(或者甲醇)～水，其体积比为3～5∶4～6∶3～5∶4～6，置于分液漏斗中，摇匀、静置分层，平衡后，将上、下相分开。用上相作固定相，下相作流动相，用上相充满整个高速逆流色谱中色谱柱，调整高速逆流色谱主机正转，将下相从柱子的首端泵入柱内进行洗脱，待整个体系建立动态平衡后由进样阀进样；或者下相作为固定相，上相作流动相，用下相充满整个高速逆流色谱中色谱柱，调整高速逆流色谱主机正转，将上相从柱子的尾端泵入柱内进行洗脱；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；根据检测器的谱图分步收集目标物，减压浓缩得到雷公藤内酯醇精品。
高速逆流色谱可以采用上海同田生化公司的TBE1000高速逆流色谱。
下面根据实施例详细说明本发明，本发明的目的和效果将变得更加明显。
实施例1
200g干燥的雷公藤叶子磨成粉末，先用乙醇搅拌回流提取三次，每次提取1小时，每次乙醇用量为800毫升，合并乙醇提取液，浓缩蒸干得到乙醇提取物。将乙醇提取物用250毫升饱和了水的乙酸乙酯和250毫升饱和了乙酸乙酯的水溶解、过滤、并静置分层24小时，乙酸乙酯相浓缩蒸干得到乙酸乙酯萃取物。将乙酸乙酯萃取物用250毫升饱和了甲醇的石油醚和250毫升饱和了石油醚的甲醇溶解静置分层10小时，分液，甲醇相蒸干得到甲醇萃取物。甲醇萃取物上硅胶柱层析，用体积比1∶1的正己烷和乙酸乙酯洗脱，收集全部洗脱液浓缩蒸干得雷公藤内酯醇粗品克。雷公藤内酯醇粗品用正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水分配所构成四元两相体系，其体积比为8∶2∶5∶5(40毫升∶10毫升∶25毫升∶25毫升)，分液，下相蒸干得到雷公藤内酯醇富集物。雷公藤内酯醇富集物用高速逆流色谱精制，所用的两相溶剂体系为正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水，其体积比为4.5∶5∶4.5∶5，上相为固定相下相为流动相，仪器操作条件为转速500r/min，流速5mL/min，收集含雷公藤内酯醇部分浓缩蒸干得到雷公藤内酯醇精品17.3毫克，经HPLC检测其纯度为98.7％。
实施例2
200g干燥的雷公藤叶子磨成粉末，先用乙醇搅拌回流提取三次，每次提取2小时，每次乙醇用量为1000毫升，合并乙醇提取液，浓缩蒸干得到乙醇提取物，将乙醇提取物用500毫升饱和了水的乙酸乙酯和500毫升饱和了乙酸乙酯的水溶解、过滤、并静置分层12小时，乙酸乙酯相浓缩蒸干得到乙酸乙酯萃取物。将乙酸乙酯萃取物用300毫升饱和了甲醇的石油醚和300毫升饱和了石油醚的甲醇溶解静置分层2小时，分液，甲醇相蒸干得到甲醇萃取物。甲醇萃取物上硅胶柱层析，用体积比1∶1.2的正己烷和乙酸乙酯洗脱，收集全部洗脱液浓缩蒸干得雷公藤内酯醇粗品。雷公藤内酯醇粗品用正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水分配所构成四元两相体系，其体积比为10∶3∶6∶6(50毫升∶15毫升∶30毫升∶30毫升)，分液，下相蒸干得到雷公藤内酯醇富集物。雷公藤内酯醇富集物用高速逆流色谱精制，所用的两相溶剂体系为60-90℃石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水，其体积比为4∶5∶4∶5，仪器操作条件为转速500r/min，流速5mL/min，收集含雷公藤内酯醇部分浓缩蒸干得到雷公藤内酯醇精品。收集含雷公藤内酯醇部分浓缩蒸干得到雷公藤内酯醇精品16.1毫克，经HPLC检测其纯度为95.4％。
实施例3
200g干燥的雷公藤叶子磨成粉末，先用乙醇搅拌回流提取三次，每次提取3小时，每次乙醇用量为1200毫升，合并乙醇提取液，浓缩蒸干得到乙醇提取物，将乙醇提取物用150毫升饱和了水的乙酸乙酯和150毫升饱和了乙酸乙酯的水溶解、过滤、并静置分层18小时，乙酸乙酯相浓缩蒸干得到乙酸乙酯萃取物。将乙酸乙酯萃取物用150毫升饱和了甲醇的石油醚和150毫升饱和了石油醚的甲醇溶解静置分层8小时，分液，甲醇相蒸干得到甲醇萃取物。甲醇萃取物上硅胶柱层析，用体积比1∶0.8的正己烷和乙酸乙酯洗脱，收集全部洗脱液浓缩蒸干得雷公藤内酯醇粗品。雷公藤内酯醇粗品用正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水分配所构成四元两相体系，其体积比为10∶4∶4∶6(50毫升∶20毫升∶20毫升∶30毫升)分配，分液，下相蒸干得到雷公藤内酯醇富集物。雷公藤内酯醇富集物用高速逆流色谱精制，所用的两相溶剂体系为正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水，其体积比为3.5∶5∶3.5∶5，上相为固定相下相为流动相，仪器操作条件为转速500r/min，流速5mL/min，收集含雷公藤内酯醇部分浓缩蒸干得到雷公藤内酯醇精品17.4毫克，经HPLC检测其纯度为94.3％。
上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种从雷公藤叶中分离雷公藤内酯醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将雷公藤叶磨成粉末，过筛，用乙醇回流提取2～4次，每次提取时间1～3小时，每次每克雷公藤叶粉末用4-6毫升乙醇，然后合并提取液，蒸干乙醇得到乙醇提取物；
(2)乙醇提取物用乙酸乙酯和水搅拌溶解并过滤，每克乙醇提取物依次加入饱和了水的乙酸乙酯5-20毫升和饱和了乙酸乙酯的水5-20毫升，滤液分层12-24小时，分液，上相蒸干得到乙酸乙酯萃取物；
(3)乙酸乙酯萃取物用60-90℃石油醚和甲醇溶解，每克乙酸乙酯萃取物依次加入饱和了60-90℃石油醚的甲醇5-20毫升和饱和了甲醇的石油醚5-20毫升，滤液分层1-10小时，分液，下相蒸干得到甲醇萃取物；
(4)甲醇萃取物上硅胶柱层析，每克甲醇萃取物吸附在一克硅胶上，每克甲醇萃取物需硅胶填料50～100克，需用体积比为1∶0.8～1.2的正己烷和乙酸乙酯的混合物250～500毫升洗脱，洗脱液浓缩蒸干得到雷公藤内酯醇粗品；
(5)雷公藤内酯醇粗品用正己烷～乙酸乙酯～乙醇～水所构成的四元两相体系分配，所述正己烷、乙酸乙酯、乙醇和水体积比为7～10∶2～4∶4～6∶4～6，分液，下相蒸干得到四元分配物；
(6)四元分配物上高速逆流色谱进行精制，所用的溶剂体系为正己烷～乙酸乙酯～乙醇～水，所述正己烷、乙酸乙酯、乙醇和水的体积比为3～5∶4～6∶3～5∶4～6，置于分液漏斗中，摇匀、静置分层，平衡后，将上、下相分开；用上相作固定相，下相作流动相，用上相充满整个高速逆流色谱中色谱柱，调整高速逆流色谱主机正转，将下相从柱子的首端泵入柱内进行洗脱，待整个体系建立动态平衡后由进样阀进样；或者下相作为固定相，上相作流动相，用下相充满整个高速逆流色谱中色谱柱，调整高速逆流色谱主机正转，将上相从柱子的尾端泵入柱内进行洗脱；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；根据检测器的谱图分步收集目标物，减压浓缩得到雷公藤内酯醇精品。
2.根据权利要求1所述从雷公藤叶中分离雷公藤内酯醇的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述雷公藤叶粉末过40-200目筛。
3.根据权利要求1所述从雷公藤叶中分离雷公藤内酯醇的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述60-90℃石油醚用正己烷或正庚烷替换。
4.根据权利要求1所述从雷公藤叶中分离雷公藤内酯醇的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述甲醇萃取物上60-100目硅胶柱层析，所述正己烷用60-90℃石油醚替换。
5.根据权利要求1所述从雷公藤叶中分离雷公藤内酯醇的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，所述正己烷用环己烷、正庚烷或60-90℃的石油醚替换。
6.根据权利要求1所述从雷公藤叶中分离雷公藤内酯醇的方法，其特征在于，所述步骤(6)中，所述正己烷用正庚烷或60-90℃的石油醚替换。
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