CN104173413B

CN104173413B - 雷公藤叶总萜在制备抗类风湿关节炎药物中的应用

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Publication number: CN104173413B
Application number: CN201310204299.8A
Authority: CN
Inventors: 张东明; 侯琦; 李创军; 张天齐; 白金叶
Original assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Current assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Priority date: 2013-05-28
Filing date: 2013-05-28
Publication date: 2020-02-18
Anticipated expiration: 2033-05-28
Also published as: CN104173413A

Abstract

本发明公开了一种具有抗类风湿关节炎活性的有效部位，系由雷公藤叶粉碎后用水和/或醇提取，经萃取、中性氧化铝柱层析、大孔吸附树脂脱色得到的淡黄色油状物或胶状物。本发明所述的有效部位，抗类风湿关节炎成分为雷公藤叶总萜，总萜有效部位重量百分比在50%以上。有效部位的制备工艺具有方法简单，易工业化生产，试剂溶剂无毒性，成本低、含量稳定等优点。

Description

雷公藤叶总萜在制备抗类风湿关节炎药物中的应用

技术领域

本发明涉及雷公藤叶总萜在制备抗类风湿关节炎药物中的应用，属医药技术领域。

背景技术

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritiRA)是一种常见的以慢性、对称性、侵蚀性关节滑膜炎为主要表现的全身性自身免疫性疾病。滑膜炎持久反复发作，可导致关节内软骨和骨的破坏，关节功能障碍，甚至残废。其基本病理改变是滑膜炎和血管翳形成血清、组织中多种细胞因子、抗原抗体和黏附分子等变化，从而破坏骨和软骨，最终导致关节结构的破坏、畸形和功能丧失。在世界范围，RA患病率为0.8%，我国RA患病率为0.3%-0.4%。目前，RA的主要治疗手段是病情缓解型抗风湿药物(DMARDs)疗法，这类药物包括免疫抑制剂，如硫唑嘌呤、氯喹、甲氨蝶呤和青霉胺；甾体激素，如地塞米松等；非甾体抗炎药，如阿司匹林、吲哚美辛、双氯芬酸等；以及生物制剂，如阿达木单抗、依那西普、英利昔单抗和戈利木单抗。这些药物的共同特点是可抑制RA的病理学过程，如青霉胺可降低患者体内T淋巴细胞水平、抑制巨噬细胞功能、降低细胞因子白细胞介素-1(IL．1)和类风湿因子水平以及阻止胶原交联；抗叶酸剂甲氨蝶呤可抑制免疫系统；新型抗体产品阿达木单抗和依那西普等可抑制人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。但是这些药物普遍具有不同程度的不良反应，如非甾体药物严重的胃肠反应等。为了进一步提高药物疗效和降低其毒副作用，抗RA药物的研发仍在继续。

雷公藤是我国传统的抗风湿性药物，临床上用于治疗RA已取得了确切的疗效。在目前国内外的药学研究中，至今未发现比雷公藤免疫抑制活性更强的天然药物。通过对雷公藤的根皮精制制成的制剂雷公藤多苷片广泛应用于包括类风湿性关节炎在内的多种自身性免疫疾病。其主要通过抗炎、免疫抑制及调节作用来抑制风湿。通过考察佐剂性关节炎大鼠的相关指标，发现雷公藤多苷能显著减轻大鼠足跖关节肿胀度，关节炎症指数，减轻踝关节滑膜病理改变，且能预防继发性病变的出现；雷公藤多苷对胶原免疫性关节炎(CIA)模型大鼠也有抗炎和免疫抑制的作用。但是目前雷公藤药材（根皮）主要依靠对野生资源的大量采挖。虽然有种植资源，但是由于生长周期长，而且药用部位为根，生长6-8年的根才能供药用，不利于资源的可持续性利用。本研究组的前期研究表明雷公藤的叶同样具有与雷公藤根相同的抗炎及免疫抑制活性，且在相同剂量下巴豆油耳炎活性实验（抑制率63.1%，P<0.001，）活性比雷公藤根(抑制率28%，P<0.001)和阳性药雷公藤多苷片（抑制率29.9%，P<0.01，）略强。雷公藤叶可以每年采收，并且产量大，因此以雷公藤叶为药材进行抗类风湿有效部位的研发，来源广泛，价格便宜，可实现中药材资源的可持续利用，具有重大现实意义。

发明内容

以雷公藤叶为药材，粉碎后经提取、分离和精制，制备总萜含量50%以上的有效部位，加入药剂上允许的赋形剂，制成片剂、胶囊等口服制剂，用于类风湿患者。雷公藤叶总萜有效部位提取物对小鼠巴豆油耳炎、角叉菜胶诱导的大鼠足肿胀、胶原诱导的大鼠关节炎和佐剂诱导的大鼠关节炎的药效均优于雷公藤多苷片。1.有效部位制备

本发明提供一种雷公藤叶总萜有效部位的制备方法，该方法容易操作，收率高，能实现资源的可持续性利用。为了实现上述发明的目的，本发明采用如下的技术方案得到雷公藤叶总萜有效部位：

1).提取方法：将雷公藤叶粉碎成粗粉，用10倍量的80%乙醇回流提取2次，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，至无醇的混悬液，放冷。

2).溶剂萃取：将步骤1）所得的混悬液用体积约为1/2乙酸乙酯萃取3次，萃取液合并，回收乙酸乙酯，残留物干燥得到深褐色至黑色的粗浸膏。

3）乙酸乙酯回流：将步骤2）所得的粗浸膏此粗膏用乙酸乙酯10倍量的乙酸乙酯回流3次，每次1.5小时，抽滤，合并乙酸乙酯提取液。

4）色谱柱层析：将步骤3）所得的滤液通过装有12倍量（乙酸乙酯提取液中所含固体物）的中性氧化铝柱（100至200目），用乙酸乙酯洗脱4个柱体积，收集洗脱液，减压回收乙酸乙酯，干燥得粗品总萜（绿色油状物）。

5）大孔吸附树脂脱色及脱脂：将步骤4）所得绿色油状物用乙醇溶解，用3倍量的大孔树脂拌样，另取3倍量的大孔树脂装柱，用40%乙醇洗脱8个柱体积，蒸干得黄色的油状物。

利用本发明方法得到的有效部位富含萜类化合物。

利用本发明方法得到的有效部位可以用来制备药剂学制剂，例如普通片、分散片、胶囊等。

利用本发明方法得到的有效部位制备所需药物的各种剂型时，可以按照要学领域常规的生产方法制备。

有益技术效果：

1.采用雷公藤叶为原料，资源丰富，不破坏生态，有利于资源的可持续利用。

2.工艺步骤简单，逐步除去雷公藤叶中的糖类、鞣质和油脂类等杂质，最终纯化样品的量较少，有利于操作和节约成本。

3.所使用的溶剂为乙酸乙酯和乙醇，毒性低，安全性强，有利于大规模生产。

附图说明

图1 雷公藤叶总萜对CIA大鼠关节滑膜病理的影响.

A．正常组；B.模型组；C.地塞米松组；D.雷公藤多苷组；E.雷公藤叶总萜(5mg/kg)；F.雷公藤叶总萜(2.5mg/kg)；G.雷公藤叶总萜(1.25mg/kg)

图2 雷公藤叶总萜对AIA大鼠关节滑膜病理的影响.

A.正常组；B.模型组；C.地塞米松组；D.雷公藤多苷组；E.雷公藤叶总萜(5mg/kg)；F.雷公藤叶总萜(2.5mg/kg)；G.雷公藤叶总萜(1.25mg/kg).

具体实施方式

实施例1雷公藤叶总萜有效部位的制备

雷公藤叶5kg，粉碎成粗粉，用80%乙醇回流提取2次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，至无醇的混悬液，放冷（约6000ml），用乙酸乙酯萃取3次（每次3000ml）萃取液合并，回收乙酸乙酯，残留物干燥（粗膏）。此粗膏用乙酸乙酯回流，抽滤，合并滤液。滤液通过中性氧化铝柱，用乙酸乙酯：无水乙醇9：1洗脱，收集洗脱液，减压回收洗脱剂，干燥得黄绿色油状物（100克）。将此油状物用300克D101大孔吸附树脂拌样，另取300克D101大孔吸附树脂上样，用40%乙醇洗脱8个柱体积，合并洗脱液，蒸干得黄色胶状物（1.5克），总萜含量50%以上。

药理实验

实验例1.雷公藤叶总萜有效部位对巴豆油诱导的小鼠耳炎的作用

以地塞米松和雷公藤多苷为阳性药，观察实例1雷公藤叶总萜在对不同浓度下巴豆油诱导的小鼠耳部肿胀的抑制作用。结果表明，与模型组相比，地塞米松组（0.2mg·kg^-1），雷公藤多苷组（200mg·kg^-1）和雷公藤叶总萜高、中、低剂量组（7.5，5，2.5mg·kg^-1）均能抑制巴豆油诱导的小鼠耳部肿胀，只有雷公藤叶总萜低剂量组（2.5mg·kg^-1）未表现显著性差异；雷公藤叶总萜三个剂量组抑制巴豆油诱导的小鼠耳部急性炎症具有剂量依赖关系（附表1）。

表1 雷公藤叶总萜对巴豆油诱导的小鼠耳肿胀的作用

注：与模型组比较，^1）P<0.05，^2）P<0.01。

实验例2、雷公藤叶总萜有效部位对角叉菜胶诱导的大鼠足肿胀的作用

以地塞米松和雷公藤多苷为阳性药，观察实例1雷公藤叶总萜在对不同浓度下对角叉菜胶诱导的大鼠足肿胀的抑制作用。结果表明，与模型组相比，地塞米松组（0.2mg·kg^-1）在致炎后1～24h，雷公藤多苷组（200mg·kg^-1）在致炎后2～5h，雷公藤叶总萜高、中、低剂量组（7.5，5，2.5mg·kg^-1）在致炎后1-5h均抑制角叉菜胶诱导的大鼠足肿胀，呈剂量依赖性。雷公藤叶总萜高、中剂量组（7.5，5mg·kg^-1）在注射致炎后2～4h与模型组相比具有显著性差异，雷公藤叶总萜高剂量组（7.5mg·kg^-1）抑制水平优于同期雷公藤多苷组（200mg·kg^-1）（附表2）。

表2 雷公藤叶总萜对角叉菜胶诱导的大鼠足肿胀的作用

注：与模型组比较，^1）P<0.05，^2）P<0.01，^3）P<0.001。

实验例3 雷公藤叶总萜有效部位对胶原诱导的大鼠关节炎的作用

A原发肿胀

以地塞米松和雷公藤多苷为阳性药，观察实例1雷公藤叶总萜在对不同浓度下对胶原诱导的大鼠关节炎的抑制作用。以注射侧足的周长表征原发足肿胀程度。与CIA模型相比，雷公藤叶总萜高、中、低剂量组（5，2.5，1.25mg·kg^-1）在给药12-4d都抑制原发足肿胀。雷公藤叶总萜高剂量组（5mg·kg^-1）在给药15～24d表现出显著性差异，同期抑制效果优于雷公藤多苷组（10mg·kg^-1）；雷公藤叶总萜中、低剂量组（2.5，1.25mg·kg^-1）在给药18～21d表现出显著性差异，同期抑制效果优于雷公藤多苷组（10mg·kg^-1）（附表3）。

表3 雷公藤叶总萜对CIA大鼠原发足肿胀的作用

注：与模型组比较，¹⁾P<0.05，²⁾P<0.01，³⁾P<0.001；与空白组比较，⁶⁾P<0.001。

B继发肿胀

以注射足对侧足的周长表征继发足肿胀程度。与CIA模型相比，雷公藤叶总萜高、中、低剂量组（5，2.5，1.25mg·kg^-1）在给药12-24d都抑制继发足肿胀。雷公藤叶总萜高、低剂量组（5，1.25mg·kg^-1）在给药12-15d表现出显著性差异，同期抑制效果优于雷公藤多苷组（10mg·kg^-1）。（附表4）。

表4 雷公藤叶总萜对CIA大鼠继发足肿胀的作用

注：与模型组比较，¹⁾P<0.05，²⁾P<0.01,³⁾P<0.001；与空白组比较⁵⁾P<0.01，⁶⁾P<0.001。

C滑膜组织病理切片观察

注射侧足踝关节制备石蜡切片，常规HE染色，镜下检查滑膜组织发现(附图1)：正常组未见滑膜增生和炎性浸润；模型组滑膜组织炎症改变明显，水肿，小血管扩张，中性粒细胞及淋巴细胞浸润；地塞米松组（0.2mg·kg^-1）未见滑膜增生和炎性改变；雷公藤多苷组（10mg·kg^-1）滑膜组织增生，轻度炎性改变；雷公藤叶总萜高剂量组（5mg·kg^-1）滑膜组织局部轻度炎性改变；雷公藤叶总萜中剂量组（2.5mg·kg^-1）滑膜组织增生，轻度炎性改变；雷公藤叶总萜低剂量组（1.25mg·kg^-1）滑膜组织增生，伴少量淋巴细胞浸润。

实验例4、雷公藤叶总萜有效部位对佐剂诱导的大鼠关节炎的作用

A足肿胀

以地塞米松和雷公藤多苷为阳性药，观察实例1雷公藤叶总萜在对不同浓度下对佐剂诱导的大鼠关节炎的抑制作用。以注射足周长表征原发足肿胀程度，以对侧足表征继发足肿胀情况。与AIA模型相比，雷公藤叶总萜高、中、低剂量组（5，2.5，1.25mg·kg^-1）在给药9～15d对原发足肿胀和继发足肿胀均有抑制作用；TZT-5高剂量组（5mg·kg^-1）对双侧足肿胀的抑制作用在给药9～12d表现出显著性差异，同期抑制效果优于雷公藤多苷组（10mg·kg^-1）；雷公藤叶总萜中剂量组（2.5mg·kg^-1）在给药9d对继发肿胀的抑制作用表现出显著性差异，同期抑制效果优于雷公藤多苷组（10mg·kg^-1）。（附表5）。

表5.雷公藤叶总萜对AIA大鼠足肿胀的作用

注：与模型组比较，¹⁾P<0.05，²⁾P<0.01,³⁾P<0.001；与空白组比较⁶⁾P<0.001。

BAI评分

与AIA模型相比，雷公藤叶总萜高、中、低剂量组（5，2.5，1.25mg·kg^-1）在给药9～15d降低AIA大鼠的AI评分；雷公藤叶总萜高剂量组（5mg·kg^-1）在给药12～15d表现出显著性差异，同期抑制效果优于雷公藤多苷组（10mg·kg^-1）；雷公藤叶总萜中剂量组（2.5mg·kg^-1）在给药15d表现出显著性差异，同期抑制效果优于雷公藤多苷组（10mg·kg^-1）。（附表6）。

表6.雷公藤叶总萜对AIA大鼠AI评分的作用

注：与模型组比较，^1）P<0.05，^2）P<0.01,^3）P<0.001

C滑膜组织病理切片观察

注射侧足踝关节制备石蜡切片，常规HE染色，镜下检查滑膜组织发现（附图2）：正常组未有增生及炎性症状；模型组滑膜组织炎症改变明显；地塞米松组（0.2mg·kg^-1）局部轻微炎性改变；雷公藤多苷组（10mg·kg^-1）轻微炎性改变；雷公藤叶总萜高剂量组（5mg·kg^-1）轻度炎性改变；雷公藤叶总萜中剂量组（2.5mg·kg^-1）轻度炎性改变；雷公藤叶总萜低剂量组（1.25mg·kg^-1）局部滑膜组织增生，伴小血管充血，少量炎性细胞浸润。

Claims

1.一种具有抗类风湿性关节炎的雷公藤叶总萜有效部位，其特征在于，该有效部位是从雷公藤叶中制备，有效部位的活性成分为一组萜类化合物，总萜含量占提取物的重量的百分比在50％以上；制备该有效部位按如下步骤：

1).提取：将雷公藤叶粉碎成粗粉，用10倍量的80％乙醇回流提取2次，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，至无醇的混悬液，放冷；

2).溶剂萃取：将步骤1)所得的混悬液用体积为1/2乙酸乙酯萃取3次，萃取液合并，回收乙酸乙酯，残留物干燥得到深褐色至黑色的粗浸膏；

3)乙酸乙酯回流：将步骤2)所得的粗浸膏用10倍量的乙酸乙酯回流3次，每次1.5小时，抽滤，合并乙酸乙酯提取液；

4)色谱柱层析：将步骤3)所得的滤液通过装有12倍量的中性氧化铝柱，用乙酸乙酯洗脱4个柱体积，收集洗脱液，减压回收乙酸乙酯，干燥得粗品总萜；其中，中性氧化铝是乙酸乙酯提取液中所含固体物的12倍量，所述中性氧化铝柱为100至200目；

5)大孔吸附树脂脱色及脱脂：将步骤4)所得粗品总萜用大孔树脂层析柱层析，用40％乙醇洗脱8个柱体积，蒸干得黄色的油状物或胶状物为雷公藤叶总萜。

2.根据权利要求1的雷公藤叶总萜有效部位，其特征在于，所述的总萜化合物主要由单萜和二萜组成，其中单萜的含量不低于总萜的25％，二萜含量不低于20％。

3.根据权利要求1所述的雷公藤叶总萜有效部位，其特征在于，步骤1)所述的雷公藤叶为8月份或9月初采集的雷公藤叶。

4.根据权利要求1所述的雷公藤叶总萜有效部位，其特征在于，步骤5)所述的大孔树脂为D101型吸附树脂、AB-8型吸附树脂、XAD-2型吸附树脂、HP20型吸附树脂、SP825型吸附树脂、SP700型吸附树脂、CHP20P型吸附树脂或者SP70型吸附树脂；树脂用量为样品量的3-10倍。

5.一种具有抗类风湿性关节炎的药物组合物，其特征在于，含有有效剂量的权利要求1-4任一项所述的雷公藤叶总萜的有效部位和药剂学上允许的赋形剂。

6.根据权利要求5的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合为普通片、胶囊和颗粒剂。

7.根据权利要求6的药物组合物，其特征在于，含有的总萜的有效部位按有效部位提取物计为0.2-5mg/片。