CN102138966B - 藏茵陈提取物及其制备方法、药物组合物和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种藏茵陈提取物，其包含环烯醚萜、山酮和三萜类成分，上述三种成分总含量为20％-80％(重量)。本发明还提供了制备上述藏茵陈提取物的方法。本发明还提供了含有上述藏茵陈提取物的药物组合物。本发明的藏茵陈提取物具有明显利胆作用，对化学物质所致急性肝损伤和阻塞性黄疸的肝功能异常有明显的保护和改善作用。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体而言，涉及一种藏茵陈提取物及其制备方法，包含该藏茵陈提取物的药物组合物和用途。
背景技术
藏茵陈是我国传统藏药，在藏药经典著作《晶珠本草》及《藏药晶镜本草》中均有记载，在藏药中称为“蒂达”，原植物来源主要包括龙胆科植物印度獐牙菜、川西獐牙菜、抱茎獐牙菜、普兰獐牙菜、花锚、扁蕾以及十字花科植物长果糖芥、虎耳草科植物垂头虎耳草等，其中川西獐牙菜(S.mussotii)和抱茎獐牙菜(S.franchetiana)作为藏茵陈原植物被收载于国家卫生部藏药标准或地方标准中。藏茵陈主要功能为清热消炎、利胆退黄，主治各种热病，尤其对肝胆实热性疾病具有独特疗效。
龙胆科獐牙菜属植物是藏茵陈的主要来源，在我国历代中医本草中均无记载。但獐牙菜属植物有多种生理活性，在我国西南少数民族地区长期以来用于治疗肝胆湿热性疾病，亚洲许多国家也用于各种疾病的民间治疗。
藏茵陈(獐牙菜属)主要含环烯醚萜、口山酮和三萜类等成分，其中环烯醚萜和口山酮类成分因其特殊的化学结构和多种生物活性，备受人们的关注；现代药理实验证明，三类成分均具有抗肝炎药理活性。
目前，与藏茵陈提取物相关的专利已有报道，列述如下：
中国专利(200410055462.X)公开了一种从獐牙菜属主要药用植物中提取抗肝炎活性部位的方法，该方法包括如下步骤：(1)粉碎植物，称取植物粉末，放入水或亲水性有机溶剂中，植物粉末与有机溶剂的总量比为1∶2～20，在50-100℃下回流提取2-4次，依次递减溶剂用量，过滤，得合并浓缩液，置室温或0-4℃冷藏12-48小时，离心或过滤，得澄清提取液；(2)使提取液以0.5-3BV/h的流速缓慢流过大孔吸附树脂的树脂柱；(3)用0.5-3BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，得到抗肝炎活性部位。该专利未对提取物的内在质量进行控制，未开展提取物的药效学实验。
中国专利(200710061832.4)公开了一种藏茵陈有效成分的提取方法，它由提取、除杂、浓缩、干燥、粉碎、进一步精制等工艺制备而成，提取方法采用水、乙醇溶剂提取或超声辅助提取；采用离心或大孔树脂等方法进行除杂和精制，可以方便地处理成多种剂型。该专利未对提取物的内在质量进行控制，未开展提取物的药效学实验。
中国专利(200710163097.8)公开了一种藏茵陈提取物，包含獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、芒果苷、异红草苷，所述五种成分的质量比为0.04-0.71∶20-40∶1-15∶1.6-26∶0.01-0.16。在该提取物的制备工艺中，采用了溶剂提取、有机溶剂萃取、树脂吸附分离等方法。该专利还公开了藏茵陈提取物能够改善肝损伤造成的各项指标，促进肝纤维化过程的逆转，较好得预防肝硬化。该专利制备得到的藏茵陈提取物只包含部分环烯醚萜类成分和山酮类成分，未包含三萜类成分，药理实验列述了提取物的改善肝损伤和促进肝纤维化过程的逆转的相关活性，未开展其他方面的药理活性实验。
中国专利(200910078578.8)公开了一种藏茵陈提取物，其中包含总黄酮成分，以该藏茵陈提取物总重为100％计，该总黄酮占该藏茵陈提取物的20-75％；该藏茵陈提取物是通过溶剂提取和有机溶剂萃取获得的，具有治疗肝胆疾病的活性。该专利制备得到的藏茵陈提取物只是包括黄酮类成分。
如上所述，目前关于藏茵陈类药物(包括獐牙菜属药用植物)的中国专利报道的发明、方法所获得的藏茵陈类植物的制品均成分还比较复杂，药效作用特点还不太突出。因此，提供一种质量可控、成分相对明确、药效作用特点突出、符合现代药物要求的獐牙菜抗肝炎提取物，仍是本领域研究的热点和难点之一。
发明内容
本发明的一个目的在于，提供一种具有显著抗肝炎疗效、成分相对明确、质量可控、符合现代药物要求的藏茵陈提取物；本发明的另一个目的在于，提供一种制备上述藏茵陈提取物的方法；本发明的又一个目的在于，提供一种包含上述藏茵陈提取物的药物组合物；本发明的再一个目的在于，提供上述藏茵陈提取物的用途。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一方面，本发明提供一种藏茵陈提取物，该提取物包含环烯醚萜，其含量为10～50％；山酮，其含量为10～50％；和三萜，其含量为5～20％；以上三种成分的总含量为25-90％(重量)，优选为50％-90％(重量)。
上述藏茵陈提取物中，所述环烯醚萜包括獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、龙胆苦苷；所述山酮包括芒果苷、当药醇苷、1，5，8-三羟基-3-甲氧基山酮和1-三羟基-3，5-二甲氧基山酮；所述三萜包括齐墩果酸、熊果酸。
另一方面，本发明提供上述藏茵陈提取物的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(1)取藏茵陈药材，粉碎或切断，用7-15倍重量的体积浓度为55-95％的醇，优选为乙醇回流提取2-4次，合并提取液，减压浓缩至无醇味，得到浓缩液；
(2)将步骤(1)制备的浓缩液在搅拌状态下加入3-5倍的水，并用NaOH调节pH值为6-8，水沉12-48小时，离心过滤，得到上清液和沉淀；
(3)取步骤(2)获得的上清液，使其以0.5-3BV/h的流速流过预处理好的大孔吸附树脂进行吸附，然后以0.5-3BV/h的流速，先用2-5倍水进行洗脱除杂，然后再用3-8BV的10％-30％乙醇溶液进行洗脱，收集并浓缩至干，获得环烯醚萜类成分，再用3-8BV的50％-80％的乙醇溶液进行洗脱，收集并浓缩至干，获得山酮苷类成分；取步骤(2)获得的沉淀，加入5-30倍石油醚(沸程60-90℃)，进行搅拌或超声提取30-90分钟，过滤，滤液弃去，滤渣挥发石油醚，并粉碎，即得三萜类和山酮苷元类成分；
(4)将步骤(3)获得的环烯醚萜类成分、山酮苷类成分、三萜类和山酮苷元类成分相混合，即得到本发明的药物组合物。
上述步骤(1)中，所述藏茵陈药材包括川西獐牙菜(S.mussotii)和抱茎獐牙菜(S.franchetiana)。
上述步骤(3)中，所述大孔吸附树脂包括HPD-100、HPD-300、AB-8和D-101型大孔吸附树脂。
又一方面，本发明提供一种药物组合物，该药物组合物含有上述藏茵陈提取物以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
本发明的上述药物组合物为固体口服制剂、液体口服制剂或注射剂。
本发明的上述药物组合物为胶囊、颗粒、片剂、滴丸、口服溶液剂、注射用水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。
再一方面，本发明提供上述药物组合物在制备用于预防和/或治疗肝炎，例如黄疸型肝炎的药物中的用途。以下将对本发明进行详细的描述：
本发明提供一种具有较好抗肝炎活性、符合现代中药5类新药要求的藏茵陈提取物，该提取物包含环烯醚萜、山酮和三萜类成分，经紫外分光光度计法和高效液相色谱检测，其可控成分(包括环烯醚萜、山酮和三萜类成分)的含量在20％～80％(重量)之间。
在上述藏茵陈提取物中，所述环烯醚萜、山酮和三萜类成分包括獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、龙胆苦苷、芒果苷、当药醇苷、1，5，8-三羟基-3-甲氧基山酮、1-三羟基-3，5-二甲氧基山酮、齐墩果酸等。
本发明所述的獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、龙胆苦苷、芒果苷、当药醇苷、1，5，8-三羟基-3-甲氧基山酮、1-三羟基-3，5-二甲氧基山酮、齐墩果酸的化学结构式分别如下：
本发明还提供了上述藏茵陈提取物的制备方法，其包括如下步骤：
(1)取藏茵陈药材，粉碎或切断，用7-15倍重量的体积浓度为55-95％的醇回流提取2-4次，合并提取液，减压浓缩至无醇味；
(2)浓缩液在搅拌状态下加入3-5倍水，并用NaOH调pH值为6-8，水沉12-48小时，离心过滤，得到上清液和沉淀；
(3)取上清液，使其以0.5-3BV/h(其中，BV表示树脂床层的体积)的流速流过预处理好的大孔吸附树脂进行吸附，然后以0.5-3BV/h的流速，先用2-5倍水进行洗脱除杂，然后采用3-8BV的10％-30％乙醇溶液进行洗脱，收集并浓缩至干，获得环烯醚萜类成分，再用3-8BV德50％-80％的乙醇溶液进行洗脱，收集并浓缩至干，获得山酮苷类成分；取沉淀，加入5-30倍石油醚(沸程60-90℃)进行搅拌或超声提取30-90分钟，过滤，滤液弃去，滤渣挥发石油醚，并粉碎，即得三萜类和山酮苷元类成分；
(5)将以上环烯醚萜类成分、山酮苷类成分、三萜类和山酮苷元类成分混合，即得藏茵陈提取物。
上述藏茵陈药材可以是多种藏茵陈类的药材，优选的是具有法定标准的川西獐牙菜及抱茎獐牙菜。
上述制备方法中，所使用的大孔吸附树脂材料包括HPD-100、HPD-300、AB-8、D-101等型号的大孔树脂。
本发明的藏茵陈提取物可采用如下方法进行分析检测：
高效液相色谱法
色谱条件与系统适应性实验色谱柱为Diamonsil C18(250×4.6mm，5μm)，流速为1ml/min，柱温为35℃，环烯醚萜类成分的流动相为甲醇-0.04％磷酸水(23∶77)，检测波长为237nm；山酮苷类成分的流动相为甲醇-0.04％磷酸水(45∶55)，检测波长为254nm；三萜类成分的流动相为乙腈-甲醇-0.2％冰醋酸水(65∶15∶20)，检测波长为210nm。
对照品溶液的制备精密称取獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、龙胆苦苷、芒果苷、当药醇苷、1，5，8-三羟基-3-甲氧基山酮、1-三羟基-3，5-二甲氧基山酮、齐墩果酸对照品适量，分置25mL量瓶中，均用甲醇溶解并稀释至刻度，即得。
供试品溶液的制备精密称取藏茵陈提取物适量，置50ml量瓶中，加甲醇并稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液即得。
通过以上方法测定本发明制备的藏茵陈提取物中各成分的含量，上述化合物的总和占藏茵陈提取物重量的20％-80％
本发明还提供包含上述藏茵陈提取物以及药学上可接受的载体和/或赋形剂的药物组合物，该药物组合物可以为口服制剂，包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸等。
本发明还提供上述藏茵陈提取物在制备治疗预防和/或治疗肝炎，例如黄疸型肝炎的药物中的用途。本发明的藏茵陈抗肝炎提取物具有明显利胆作用，对化学物质所致急性肝损伤和阻塞性黄疸的肝功能异常有明显的保护和改善作用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明选用资源丰富的藏茵陈为原料药，对于藏药的深入研究、开发与合理应用将产生一定的推动作用；
2、现有技术的制备方法所制备的藏茵陈提取物只包括黄酮类成分，或者只包含部分环烯醚萜类成分和山酮类成分，本发明采用大孔吸附树脂等现代提取方法与手段，不仅可以获得环烯醚萜类成分和山酮类成分，而且还可得到三萜类成分；
3、本发明在一种方法中，将提取液得到的滤液和沉淀同时进行处理，未丢弃任何活性成分，充分利用了原料药；
4、本发明通过一种方法，提取出多种活性成分，降低了成本，节约了资源，本发明的活性成分合并应用，对于肝病可发挥综合的治疗作用(参见实施例9)。
附图说明
图1为四氯化碳诱发的大鼠急性肝损伤病理组织学图，其中a为空白组大鼠肝正常肝脏，b为模型组大鼠肝细胞弥漫性气球样变，c为藏茵陈提取物低剂量组大鼠局部肝细胞轻度气球样变，d为藏茵陈提取物低剂量组大鼠局部肝细胞轻度气球样变，e为藏茵陈提取物高剂量组大鼠局部肝细胞轻度气球样变，f为联苯双酯滴丸组大鼠局部肝细胞轻度气球样，g为茵栀黄颗粒组大鼠局部肝细胞轻度气球样变；
图2为α-异硫氰酸奈酯(ANIT)诱发的大鼠急性肝损伤病理组织学图，其中，其中a为空白组大鼠肝正常肝脏；b为空白组大鼠肝正常肝脏汇管区胆管；c为模型组大鼠胆管上皮坏死管腔阻塞、中央静脉淤血；d为模型组组大鼠局部肝细胞片状坏死；e为藏茵陈提取物低剂量组大鼠局部胆管上皮轻度变性及碎片脱落；f为藏茵陈提取物低剂量组大鼠局部肝细胞散在坏死；g为藏茵陈提取物中剂量组大鼠局部胆管上皮轻度变性及碎片脱落；h为藏茵陈提取物中剂量组大鼠局部肝细胞散在坏死；i为藏茵陈提取物高剂量组大鼠局部胆管上皮轻度变性及碎片脱落；j为藏茵陈提取物高剂量组大鼠局部肝细胞散在变性；k为联苯双酯滴丸组大鼠局部胆管上皮轻度变性及碎片脱落；l为联苯双酯滴丸组大鼠局部肝细胞小片状坏死；m为茵栀黄颗粒组大鼠局部胆管上皮轻度变性及碎片脱落；n为茵栀黄颗粒组大鼠局部肝细胞散在坏死；
以上照片均为HE染色放大10倍。
具体实施方式
以下实施例是为了更详细地说明本发明，并非对本发明构成限制。
实施例1藏茵陈提取物的制备工艺
取川西獐牙菜药材20kg，粉成小段，置于300升提取罐中，加入10倍量90％乙醇，提取三次，每次2小时，收集提取液，减压回收乙醇至无醇味，得到浓缩液；
向上述浓缩液中加入2倍药材量的水，边加水边搅拌，静置24小时，离心过滤，滤液和滤渣分别收集，备用；
称取HPD-100树脂20kg，置于树脂柱中，分别用95％乙醇和水进行预处理，然后加入上面得到的滤液，流速1BV/h，流出液弃去；然后用3BV的水洗脱，流速1BV/h，弃去水洗脱液；然后用8BV的30％乙醇洗脱，流速1BV/h，收集30％乙醇洗脱液，减压浓缩，并进行减压干燥，得到的固体粉末，经高效液相色谱检测，其为环烯醚萜类成分，含量为65％；
然后用5BV的70％乙醇洗脱，流速1BV/h，收集70％乙醇洗脱液；最后用95％乙醇进行树脂再生。将70％乙醇洗脱液减压浓缩，并进行减压干燥，得到的固体粉末，经高效液相色谱检测，其为山酮苷类成分，含量为50％；
取沉淀，加入10倍量石油醚(沸程60-90℃)，超声提取30分钟，过滤，滤液弃去，滤渣挥发石油醚，并粉碎，得到的固体粉末，经高效液相色谱检测，其为三萜类和山酮苷元类成分，含量为30％；
将以上三部分固体粉末混合，即得藏茵陈提取物。
实施例2藏茵陈提取物的制备工艺
取抱茎獐牙菜药材20kg，粉成小段，置于300升提取罐中，加入12倍量80％乙醇，提取2次，每次3小时，收集提取液，减压回收乙醇至无醇味，得到浓缩液；
向上述浓缩液中加入5倍药材量的水，边加水边搅拌，静置12小时，离心过滤，滤液和滤渣分别收集，备用；
称取D-101树脂20kg，置于树脂柱中，分别用95％乙醇和水进行预处理，然后加入上面得到的滤液，流速2BV/h，流出液弃去；然后用5BV的水洗脱，流速1BV/h，弃去水洗脱液；然后用6BV的20％乙醇洗脱，流速1BV/h，收集20％乙醇洗脱液，减压浓缩，并进行减压干燥，得到的固体粉末，经高效液相色谱检测，其为环烯醚萜类成分，含量为40％；
然后用8BV的60％乙醇洗脱，流速2BV/h，收集60％乙醇洗脱液；最后用95％乙醇进行树脂再生。将60％乙醇洗脱液减压浓缩，并进行减压干燥，得到的固体粉末，经高效液相色谱检测，其为山酮苷类成分，含量为35％；
取沉淀，加入20倍量石油醚(沸程60-90℃)，搅拌提取60分钟，过滤，滤液弃去，滤渣挥发石油醚，并粉碎，得到的固体粉末，经高效液相色谱检测，其为三萜类和山酮苷元类成分，含量为15％；
将以上三部分固体粉末混合，即得藏茵陈提取物。
实施例3藏茵陈提取物的制备工艺
取川西獐牙菜药材20kg，粉成小段，置于300升提取罐中，加入15倍量65％乙醇，提取2次，每次1.5小时，收集提取液，减压回收乙醇至无醇味，得到浓缩液；
向上述浓缩液中加入3倍药材量的水，边加水边搅拌，静置36小时，离心过滤，滤液和滤渣分别收集，备用。称取HPD-300树脂20kg，置于树脂柱中，分别用95％乙醇和水进行预处理，然后加入上面得到的滤液，流速3BV/h，流出液弃去；然后用4BV的水洗脱，流速1.5BV/h，弃去水洗脱液；然后用8BV的10％乙醇洗脱，流速1.5BV/h，收集10％乙醇洗脱液，减压浓缩，并进行减压干燥，得到的固体粉末，经高效液相色谱检测，其为环烯醚萜类成分，含量为46％；
然后用6BV的70％乙醇洗脱，流速1.5BV/h，收集70％乙醇洗脱液；最后用95％乙醇进行树脂再生。将70％乙醇洗脱液减压浓缩，并进行减压干燥，得到的固体粉末，经高效液相色谱检测，其为山酮苷类成分，含量为34％；
取沉淀，加入30倍量石油醚(沸程60-90℃)，搅拌提取90分钟，过滤，滤液弃去，滤渣挥发石油醚，并粉碎，得到的固体粉末，经高效液相色谱检测，其为三萜类和山酮苷元类成分，含量为8％；
将以上三部分固体粉末混合，即得藏茵陈抗肝炎提取物。
实施例4藏茵陈提取物的制备工艺
取抱茎獐牙菜药材20kg，粉成小段，置于300升提取罐中，加入8倍量55％乙醇，提取4次，每次1小时，收集提取液，减压回收乙醇至无醇味，得到浓缩液；
向上述浓缩液中加入4倍药材量的水，边加水边搅拌，静置48小时，离心过滤，滤液和滤渣分别收集，备用；
称取AB-8树脂20kg，置于树脂柱中，分别用95％乙醇和水进行预处理，然后加入上面得到的滤液，流速3BV/h，流出液弃去；然后用5BV的水洗脱，流速2BV/h，弃去水洗脱液；然后用6BV的30％乙醇洗脱，流速2BV/h，收集30％乙醇洗脱液，减压浓缩，并进行减压干燥，得到的固体粉末，经高效液相色谱检测，其为环烯醚萜类成分，含量为35％；
然后用8BV的50％乙醇洗脱，流速2BV/h，收集50％乙醇洗脱液；最后用95％乙醇进行树脂再生。将50％乙醇洗脱液减压浓缩，并进行减压干燥，得到的固体粉末，经高效液相色谱检测，其为山酮苷类成分，含量为20％；
取沉淀，加入25倍量石油醚(沸程60-90℃)，超声提取45分钟，过滤，滤液弃去，滤渣挥发石油醚，并粉碎，得到的固体粉末，经高效液相色谱检测，其为三萜类和山酮苷元类成分，含量为10％；
将以上三部分固体粉末混合，即得藏茵陈提取物。
实施例5藏茵陈提取物的制备
取实施例1所制备的藏茵陈提取物14g和淀粉40g，混合均匀，用85％乙醇制粒，60℃干燥，整粒，装胶囊，即制得含有藏茵炎提取物的胶囊剂型的药物组合物。
实施例6藏茵陈抗肝炎片的制备
取实施例2所制备的藏茵陈提取物8g和蔗糖40g，混合均匀，制粒，干燥，即制得含有藏茵炎提取物的颗粒剂型的药物组合物；或将制得的颗粒经进一步压片，即制得含有藏茵陈抗肝炎提取物的片剂剂型的药物。
实施例7藏茵陈抗肝炎颗粒的制备
取实施例3制得的藏茵陈提取物250g，葡萄糖100g，糊精200g，以稀淀粉糊为粘合剂制粒，分装，即得。
实施例8藏茵陈抗肝炎滴丸的制备
取实施例4所制备的藏茵陈提取物20g，混合均匀，加入40g熔融的聚乙二醇6000中，搅拌均匀，保温90℃状态下倒入滴丸装置中，以30d/min的滴速滴入10℃的液体石蜡中，制成滴丸，即制得含有藏茵陈抗肝炎的滴丸剂型的药物。
实施例9
本实施例用于证明本发明藏茵陈提取物的药效。
一.药效筛选试验
1.材料和方法
1.1动物
Wistar大鼠，中国医学科学院实验动物研究所生产，许可证编号：SCXK(京)2005-0013。
1.2试验样品
样品1，为藏茵陈药材经90％乙醇提取后得到的提取物(藏茵陈醇提物)；样品2，为本发明实施例1的藏茵陈提取物；样品3，为在发明实施例1分离纯化过程中舍弃的部分(无效部位)。
1.3试验方法
Wistar大鼠，雄性，250-400g，禁食12h后，腹腔注射25％乌拉坦麻醉，固定，腹部切口，做胆总管插管，术后稳定30min后，收集1h空白胆汁，然后经十二指肠给药。藏茵陈醇提物、有效部位、无效部位均为10.8g生药/kg，阳性药(熊去氧胆酸)为0.12g/kg。
给药后每小时收集1次胆汁，共5h。胆汁以1ml注射器测量各次胆汁量并记录。以各时间点与给药前的胆汁量差值进行t-检验。
2.结果
试验数据如表1、表2所示。
表1藏茵陈利胆试验各组大鼠胆汁流量(x±sd)(n＝10)
注：与对照组比较*P＜0.05 **P＜0.01
表2大鼠各时间点胆汁流量变化(x±sd)(n＝10)
注：与对照组比较*P＜0.05 **P＜0.01
试验结果表明，样品1和样品2均能明显增加大鼠胆汁流量，尤其是在前3个小时内具有非常显著的差异，有效部位在第4小时仍然能够明显增加胆汁流量。5h内收集的胆汁总量也证明醇提物与有效部位能增加大鼠胆汁流量。以各时间点的胆汁增量为指标统计也能看出，以上两样品与对照组比较，胆汁流量增加明显。
二.药效学实验
1.试验材料
1.1受试药物：藏茵陈提取物，实施例1所制备的；茵栀黄颗粒，鲁南厚普制药有限公司生产，批号081231K；复方胆通胶囊，江西仁丰药业有限公司生产，批号090526；联苯双酯滴丸，北京协和药厂生产，批号0810015。
1.2仪器：BECKMAN COULTERTM-CX4全自动生化分析仪，美国贝克曼库尔特有限公司生产；BA-310S电子天平，日本Sartorius生产；樱花滑走式切片机，日本大和光机工业株式会社生产；樱花PS-52伸展机，日本大和光机工业株式会社生产；樱花RH-12EP脱水机，日本大和光机工业株式会社生产；樱花DRS-601-A自动染色机，日本大和光机工业株式会社生产；Nikon 8oi显微镜及病理图文分析系统，日本Nikon公司生产。
1.3检测试剂：ALT(谷丙转氨酶)：批号：712393，AST(谷草转氨酶)批号：712209，ALP(碱性磷酸酶)批号：710683，TBIL(总胆红素)批号：801433，均购自美国贝克曼库尔特有限公司。
1.4实验动物：大鼠，品系：SD，雌鼠180～200g，雄鼠190～210g，SPF级，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(京)-2006-0009。
雄鼠220～250g，SPF级，由天津市山川红实验动物科技有限公司提供，许可证号：SCXK(津)-2009-001。
2方法与结果
2.1藏茵陈提取物对大鼠胆汁分泌的影响
取健康雄性大鼠50只，体重220～250g，随机分为5组，每组10只。设空白对照组：给予生理盐水5ml/kg，阳性对照药复方胆通胶囊0.6g/kg(以胆通含量计算)。藏茵陈提取物高剂量组1.4g/kg、中剂量组0.70g/kg和低剂量组0.35g/kg。给药体积均为5ml/kg。各试验组动物均于试验前16小时禁食不禁水。每只大鼠麻醉前预先灌胃5％葡萄糖溶液5ml/kg一次，再以20％乌拉坦溶液按1.0g/5ml/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定，在剑突下沿腹正中线切口约2cm，打开腹腔，找到胃幽门部。翻转十二指肠，在十二指肠降部肠系膜中找到白色有韧性的胆管。在胆管下穿2根丝线，结扎乳头部，向肝脏方向作“V”型切口。插入磨钝的5号头皮针即可见有淡黄绿色胆汁流出，结扎固定，用刻度试管收集胆汁。手术后用盐水棉覆盖创面，待稳定20分钟后，即开始收集给药前30、60分钟的胆汁流量(求其均值作为给药前胆汁流量)，然后经十二指肠分别给每鼠注入生理盐水、复方胆通胶囊和藏茵陈提取物高、中、低三个剂量的混悬药液。分别收集给药后30、60、90、120分钟胆汁流量。将给药后各时间点胆汁流量与给药前胆汁流量进行自身比较(t检验)，将各给药组胆汁总流量与对照组进行组间比较(t检验)，并计算给药后胆汁流量增加百分率。结果见表3。
表3藏茵提取物对大树胆汁分泌的影响
注：与给药前组比较：*：P＜0.05；**：P＜0.01；与空白对照组比较：##：P＜0.05
结果表明，藏茵陈提取物1.40、0.70、0.35g/kg三个剂量组术后给药一次，其中1.40g/kg剂量组在给药后90、120分钟时胆汁流量与给药前比较均有显著性增加(P＜0.05)，且胆汁总流量与空白对照组比较也有明显增加(P＜0.01)。该药0.70/kg和0.35g/kg两个剂量组在给药后各时间点的胆汁流量与给药前自身比较，胆汁总流量与空白对照组比较均未见有显著性增加。从该药给药后最高胆汁流量增加百分率及胆汁总流量可见随剂量的增加有增加，呈现一定的量效关系。
2.2藏茵陈提取物对CCl4致急性肝损伤大鼠的降酶作用影响
2.2.1分组与造模：取健康大鼠70只，体重180～210g，雌雄各半，随机分为7组，设正常组，模型组，均给予生理盐水10ml/kg，阳性对照药茵栀黄颗粒5.04g/kg，阳性对照药联苯双酯滴丸150mg/kg，藏茵陈提取物高剂量组1.4g/kg、中剂量组0.70g/kg和低剂量组0.35g/kg。给药体积均为10ml/kg。各组大鼠预先按体重灌胃给予上述剂量，连续7天。除正常组外，模型组与给药组分别在给药的第1、4、7天同时皮下注射15％CCl4液体石蜡溶液1ml/kg。在末次给药后各组动物禁食不禁水16小时以上。于次日上午经股动脉采血，3000rpm/min离心20min，制备血清。
2.2.2检测指标：测定每只大鼠血清的AIT、AST、AIP和TBIL，同时剖取各组大鼠肝脏和脾脏，称取肝脏和脾脏湿重，计算各组大鼠的肝脏指数和脾脏指数，进行统计学检测(t检验)。结果见表4和表5。
2.2.3病理组织学检测：取每只大鼠同叶肝组织用10％甲醛溶液固定，经石蜡包埋，常规制片、HE染色后进行病理形态学检查。
2.2.4检测结果：从表4结果可见，藏茵陈提取物高、中、低三个剂量连续灌胃给药7天，对CCl4致急性肝损伤大鼠体重及肝脾指数无明显影响，与模型组比较无显著性差异。从表5结果可见，该药三个剂量对CCl4致急性肝损伤大鼠的肝功能均有明显的改善作用。低剂量组0.35g/kg即可明显降低ALT与AST值，与模型组比较有显著性差异(P＜0.05)。高剂量组的降酶作用优于对照药联苯双酯，与对照药茵栀黄的作用相近。但对照药和各给药组未见对ALP和TBIL有明显的作用。提示该药主要对CCl4所致急性肝细胞损伤有一定的保护作用。
表4 藏茵陈提取物对CCl4致急性肝损伤大鼠体重及肝脾指数的影响(X±SD，n＝10)
表5 藏茵陈提取物对CCl4致急性肝损伤大鼠肝功能的影响(X±SD，n＝10)
注：与模型组比较：*：P＜0.05；**：P＜0.01
2.2.5病理组织学镜下观察结果：正常组动物肝组织结构及肝细胞形态无明显异常，肝小叶结构清晰，肝细胞索放射状排列规则。模型组部分动物肝脏可见肝细胞弥漫性浊肿及气球样变，病变范围占整个肝小叶1/3-2/3，部分动物肝细胞弥漫性浊肿及气球样变病变范围累及绝大部分视野，超过肝小叶2/3，间质炎细胞浸润；藏茵陈提取物各剂量组动物与阳性药组动物大部分肝组织结构基本正常，结构清晰，部分或少部分肝细胞出现球球样变或胞浆内脂肪滴，病变范围散在，未超过肝小叶1/3，间质散在炎细胞浸润。见病理组织学彩色照片。
2.3藏茵陈提取物对α-异硫氰酸奈酯(ANIT)致急性肝损伤大鼠的影响
2.3.1分组与造模：取健康大鼠70只，体重180～210g，雌雄各半，随机分为7组，设正常组，模型组，均给予生理盐水10ml/kg，阳性对照药茵栀黄颗粒5.04g/kg，阳性对照药联苯双酯滴丸150mg/kg，藏茵陈抗肝炎提取物高剂量组1.4g/kg、中剂量组0.70g/kg和低剂量组0.35g/kg。给药体积均为10ml/kg。各组大鼠预先按体重灌胃给予上述剂量，连续7天。在给药第5天时，除正常组外，模型组与给药组分别在当日给药后3小时再灌胃给予ANIT 70mg/5ml/kg。48小时后，将禁食16小时的各组大鼠经股动脉采血，3000rpm/min离心20min，制备血清。
2.3.2检测指标：测定每只大鼠血清的AIT、AST、AIP和TBIL，同时剖取各组大鼠肝脏和脾脏，称取肝脏和脾脏湿重，计算各组大鼠的肝脏指数和脾脏指数，进行统计学检测(t检验)。结果见表6、表7。
2.3.3病理组织学检测：取每只大鼠同叶肝组织用10％甲醛溶液固定，经石蜡包埋，常规制片、HE染色后进行病理形态学检查。
2.3.4检测结果：从表6结果可见，藏茵陈提取物高、中、低三个剂量连续灌胃给药7天，对ANIT致急性肝损伤大鼠体重及肝脾指数无明显影响，与模型组比较无显著性差异。从表7结果可见，该药三个剂量对ANIT致急性肝损伤大鼠的肝功能均有明显的改善作用。低剂量组0.35g/kg即可明显降低ALT、AST和TBIL值，与模型组比较均有显著性差异(P＜0.05和0.01)，高、低剂量呈现一定的量效关系。尤其对ANIT所致TBIL值升高有明显的抑制作用，且该作用优于对照药茵栀黄和联苯双酯的作用。但各给药组未见对ALP有明显的作用。提示该药对ANIT致急性肝细胞病变导致的阻塞性黄疸有明显的改善作用。
表6 藏茵陈提取物对ANIT致急性肝损伤大鼠体重及肝脾指数的影响(X±SD，n＝10)
表7 藏茵陈提取物对ANIT致急性肝损伤大鼠肝功能的影响(X±SD，n＝10)
注：与模型组比较：*：P＜0.05；**：P＜0.01
2.3.5病理组织学镜下观察结果：正常组动物肝组织结构及肝细胞形态无明显异常，肝小叶结构清晰，肝细胞索放射状排列规则，肝内小叶间胆管结构未见异常。模型组动物肝细胞索排列较紊乱，大部分中央静脉淤血，肝内小叶间胆管上皮肿胀增生、变性坏死，坏死碎屑脱落致使管腔部分完全或部分不完全性阻塞，可见多处面积较大的肝细胞片状及网状坏死，汇管区大量炎细胞浸润。藏茵陈提取物各剂量组动物与阳性药组动物大部分肝组织结构基本正常，结构清晰，肝细胞索排列较规则，肝内小叶间部分胆管上皮轻度肿胀增生、轻度变性坏死，少量坏死碎屑脱落致使管腔不完全性阻塞，可见面积较小的肝细胞坏死灶或散在肝细胞变性坏死，局部中央静脉轻度淤血及汇管区炎细胞浸润。阳性药联苯双酯滴丸作用与藏茵陈抗肝炎提取物低剂量相当，茵栀黄颗粒作用与藏茵陈提取物高剂量基本一致。见病理组织学彩色照片。
3.小结
3.1藏茵陈提取物1.40g/kg给药一次，在给药后90～120分钟时胆汁流量及胆汁总流量有显著性增加。该药0.70/kg和0.35g/kg两个剂量组在给药后各时间点的胆汁流量未见有显著性增加。从该药给药后最高胆汁流量增加百分率及胆汁总流量可见随剂量的增加而增加，呈现一定的量效关系。
3.2藏茵陈提取物高、中、低三个剂量连续灌胃给药7天，对CCl4致急性肝损伤大鼠体重及肝脾指数无明显影响，这是因CCl4模型依据剂量和时间不同，对肝脏损伤程度不同。本试验大鼠急性肝损伤模型的造模周期短，故主要表现在肝功能血清酶指标的升高1。该药三个剂量均可明显降低ALT与AST值，对CCl4致急性肝损伤大鼠的肝功能均有明显的改善作用，高剂量组的降酶作用优于对照药联苯双酯，但各给药组未见对ALP和TBIL有明显的作用。病理检查结果：藏茵陈抗肝炎提取物各剂量组动物大部分肝组织结构基本正常，结构清晰，部分或少部分肝细胞出现球球样变或胞浆内脂肪滴，病变范围散在，未超过肝小叶1/3，间质散在炎细胞浸润。提示该药对CCl4所致急性肝细胞损伤有一定的保护作用。
3.3藏茵陈提取物高、中、低三个剂量连续灌胃给药7天，对ANIT致急性肝损伤大鼠体重及肝脾指数无明显影响，这也是因大鼠造模周期仅为48小时，肝组织的病理改变还未能完全形成所致。该药三个剂量均可明显降低ALT、AST和TBIL值，高、低剂量呈现一定的量效关系。尤其对ANIT所致TBIL值升高有明显的抑制作用，且该作用优于对照药茵栀黄和联苯双酯的作用，恰与该药的利胆作用结果一致。但各给药组未见对ALP有明显的作用。病理检查结果：藏茵陈提取物各剂量组动物大部分肝组织结构基本正常，结构清晰，肝细胞索排列较规则，肝内小叶间部分胆管上皮轻度肿胀增生、轻度变性坏死，少量坏死碎屑脱落致使管腔不完全性阻塞，可见面积较小的肝细胞坏死灶或散在肝细胞变性坏死，局部中央静脉轻度淤血及汇管区炎细胞浸润。均较模型组动物肝组织病变有显著差别，表明该药对化学物质致急性肝损伤大鼠的肝组织有明显的保护作用。提示该药对ANIT致急性肝细胞病变导致的阻塞性黄疸有明显的改善作用。
以上结果表明，藏茵陈提取物具有明显利胆作用，对化学物质所致急性肝损伤和阻塞性黄疸的肝功能异常均有明显和改善作用，对化学物质致急性肝损伤大鼠的肝组织有明显的保护作用。
Claims (12)
1.一种藏茵陈提取物，该提取物包含环烯醚萜，其含量为10～50%；
酮，其含量为10～50%；和三萜，其含量为5～20%；以上三种成分的总含量为20重量%-80重量%；其中，所述藏茵陈提取物的制备方法包括如下步骤：
（1）取藏茵陈药材，粉碎或切断，用7-15倍重量的质量浓度为55-95％的醇，回流提取2-4次，合并提取液，减压浓缩至无醇味，得到浓缩液；
（2）将步骤（1）制备的浓缩液在搅拌状态下加入3-5倍的水，并用NaOH调节pH值为6-8，水沉12-48小时，离心过滤，得到上清液和沉淀；
（3）取步骤（2）获得的上清液，使其以0.5-3BV/h的流速流过预处理好的大孔吸附树脂进行吸附，然后以0.5-3BV/h的流速，先用2-5倍水进行洗脱除杂，然后再用3-8BV的10%-30%乙醇溶液进行洗脱，收集并浓缩至干，获得环烯醚萜类成分，再用3-8BV的50%-80%的乙醇溶液进行洗脱，收集并浓缩至干，获得
酮苷类成分；取步骤（2）获得的沉淀，加入5-30倍沸程60-90℃的石油醚，进行搅拌或超声提取30-90分钟，过滤，滤液弃去，滤渣挥发石油醚，并粉碎，即得三萜类和
酮苷元类成分；
（4）将步骤（3）获得的环烯醚萜类成分、
酮苷类成分、三萜类和
酮苷元类成分相混合，即得到藏茵陈提取物。
2.根据权利要求1所述的藏茵陈提取物，其特征在于，该提取物中所述环烯醚萜、
酮和三萜的总含量为50重量%-80重量%。
3.根据权利要求1所述的藏茵陈提取物，其特征在于，所述环烯醚萜包括獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、龙胆苦苷；所述酮包括芒果苷、当药醇苷、1,5,8-三羟基-3-甲氧基
酮和1-三羟基-3,5-二甲氧基酮；所述三萜包括齐墩果酸、熊果酸。
4.一种权利要求1至3中任一项所述的藏茵陈提取物的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
（1）取藏茵陈药材，粉碎或切断，用7-15倍重量的质量浓度为55-95％的醇，回流提取2-4次，合并提取液，减压浓缩至无醇味，得到浓缩液；
（2）将步骤（1）制备的浓缩液在搅拌状态下加入3-5倍的水，并用NaOH调节pH值为6-8，水沉12-48小时，离心过滤，得到上清液和沉淀；
（3）取步骤（2）获得的上清液，使其以0.5-3BV/h的流速流过预处理好的大孔吸附树脂进行吸附，然后以0.5-3BV/h的流速，先用2-5倍水进行洗脱除杂，然后再用3-8BV的10%-30%乙醇溶液进行洗脱，收集并浓缩至干，获得环烯醚萜类成分，再用3-8BV的50%-80%的乙醇溶液进行洗脱，收集并浓缩至干，获得
酮苷类成分；取步骤（2）获得的沉淀，加入5-30倍沸程60-90℃的石油醚，进行搅拌或超声提取30-90分钟，过滤，滤液弃去，滤渣挥发石油醚，并粉碎，即得三萜类和
酮苷元类成分；
（4）将步骤（3）获得的环烯醚萜类成分、
酮苷类成分、三萜类和
酮苷元类成分相混合，即得到藏茵陈提取物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的醇为乙醇。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述藏茵陈药材为川西獐牙菜（S.mussotii）或抱茎獐牙菜（S.franchetiana）。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述大孔吸附树脂为HPD-100、HPD-300、AB-8或D-101型大孔吸附树脂。
8.一种药物组合物，该药物组合物含有权利要求1至3中任一项所述的藏茵陈提取物以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为固体口服制剂、液体口服制剂或注射剂。
10.根据权利要求8或9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为胶囊、颗粒、片剂、滴丸、口服溶液剂、注射用水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。
11.权利要求1至3中任一项所述的藏茵陈提取物在制备用于预防和/或治疗肝炎的药物中的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述肝炎为黄疸型肝炎。
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