CN104324089A - 各种成分比例稳定均一的大黄总蒽醌及其组合物用于乙型病毒性肝炎的退黄治疗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种各种成分比例稳定均一的大黄总蒽醌及其组合物用于乙型病毒性肝炎的退黄治疗。

Description

各种成分比例稳定均一的大黄总蒽醌及其组合物用于乙型病毒性肝炎的退黄治疗

技术领域：

本发明涉及一种中药提取物制剂的治疗用途，特别涉及一种各种成分比例稳定均一的大黄总蒽醌及其组合物用于乙型病毒性肝炎的退黄治疗。 

背景技术：

大黄为常用中药之一，系蓼科多年生草本植物掌叶大黄、唐古特大黄或药用大黄的干燥根和根茎。 

大黄味苦，性寒，具有泻下攻击，清热泻火，凉血解毒，逐瘀通经之功效。现代化学研究证明大黄的主要化学成分为蒽醌类化合物；大黄有效成分的提取分离方法主要有：煎煮法(水提法):煎煮法为大黄有效成分的传统提取方法，由于游离蒽醌类的极性小，故用煎煮法对游离蒽醌类成分的提取效果不佳；而其结合蒽醌苷类极性较其苷元较大，故可用水提取。醇提法:由于大黄中活性成分的极性分布很广，因此就总蒽醌类的提取而言，醇提法的效率要明显高于煎煮法。目前较常用的醇提法有乙醇回流法和渗漉法。 

大黄化学成分复杂，化学结构已被阐明的至少已有136种，但其主要成分为蒽醌类化合物，总含量在2％～5％，其中游离的羟基蒽醌类化合物只占1/10～1/5，主要为大黄酚、大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚和大黄酸等，为大黄的主要抗菌成分。结合性蒽醌衍生物为游离蒽醌的葡萄糖苷(即大黄酚葡萄糖苷、大黄素葡萄糖苷、芦荟大黄素葡萄糖苷、大黄酸葡萄糖苷等)和双蒽酮苷类，系大黄的主要泻下成分，其中双蒽酮苷为:番泻苷A、B、C、D、E等。番泻苷A与番泻苷B互为异构体；番泻苷C与番泻苷D互为异构体。此外尚含有大黄素、芦荟大黄素和大黄酚的双葡萄糖苷。大黄亦含有鞣质类化合物约5％，其中有没食子酰葡萄糖、没食子酸、d-儿茶素及大黄四聚素等，为收敛止血有效成分。 

大黄及大黄总蒽醌的药物作用在许多文献中有报道，主要的作用有： 

(1)疖肿及口腔炎，(2)下腿溃疡(臁疮)，(3)肠胀气，(4)传染性湿疹样皮炎，(5)咳嗽(6)急性胃十二指肠出血，(7)慢性肾功能不全，(8)拔牙术后出血(9)烧伤， (10)急性坏死性小肠炎致肠麻痹，(11)胆道蛔虫，(12)急性黄疸型肝炎，(13)胃癌出血，(14)急性胰腺炎，(15)乳蛾(急性化脓性扁桃体炎)，(lS)流行性腮腺炎，(17)新生儿不吃奶，(18)慢性前列腺炎，(19)鼻出血，(20)慢性便秘，(21)小儿厌食症，(22)肝性脑病，(23)脑出血急性期，(24)胆道出血，(25)脑外伤性颅内出血，(26)高脂血症，(27)慢性肾功能衰竭，(28)急性胆囊炎，(29)急性肠梗阻，(30)阑尾脓肿，(31)张力性水疱，(32)腹膜后血肿，(33)带状疱疹，(34)排卵功能失调，(35)急性淋病，(36)银屑病，(37)急性软组织损伤，(38)甲沟炎，(39)淋巴结核，(40)老年单纯性肥胖症，(41)中风便秘，(42)癃闭，(43)预治大面积烧伤并发症，(44)重型肝炎，(45)流行性出血热消化道出血。 

总之，大黄及其蒽醌提取物具有多种多样的药物作用，是近年来研究最多的中药之一。 

用大黄制备的药物已经上市多年，现有的大黄制剂有新清宁片和新清宁胶囊，其主要成分是熟大黄。具有清热解毒。活血化瘀，缓下功效。用于内结实热，喉肿，牙痛，目赤，便秘，下痢，感染性炎症，发烧等证。 

因大黄的主要活性成分为大黄总蒽醌，因此以大黄总蒽醌作为药物成分以及相应的提取分离方法多有报道，大黄总蒽醌提取自大黄的根茎，其颜色形状为棕黑色浸膏或棕色粉状结晶，是游离蒽醌、结合蒽醌、蒽酮、糖、鞣质等混合物。 

已经上市的大黄总蒽醌制剂有大黄总蒽醌胶囊，其主要成分为大黄提取物。【功能主治】用于治疗湿热型黄疸肝炎。 

中国专利申请号：200810107381.8申请日：2008-11-13公开了一种治疗湿热型黄疸肝炎大黄总蒽醌胶囊的制备方法,其中大黄总蒽醌胶囊的主要成份为大黄总蒽醌，并按大黄总蒽醌18％-22％,淀粉78％-82％的配比进行制备 

本发明人对大黄总蒽醌制剂的适应症进行了研究，意外的发现，本发明的大黄总蒽醌制剂可以用于乙型病毒性肝炎的退黄治疗，并取得了令人满意的效果。 

发明内容：

本发明提供一种大黄总蒽醌制剂的新的治疗应用，本发明所述大黄总蒽醌包括任何一种方法制备的大黄蒽醌物质，包括游离蒽醌、结合蒽醌、蒽酮、糖、鞣质等或它们的混合物。特别包括以下中国专利中提及的大黄总蒽醌、大黄蒽醌或大黄蒽醌类衍生物： 

本发明所述大黄总蒽醌，最优选的是采用以下方法制备的大黄总蒽醌： 

其制备方法如下：步骤1， 

取大黄1000g，照中国药典2010年版一部附录I0流浸膏剂与浸膏剂项下的渗漉法，用乙醇作溶剂，浸渍48小时后，以每公斤药粉每分钟1～1.5ml的速度缓缓 渗漉，收集初漉液5000ml备用；继续渗漉，收集续漉液10000ml减压回收乙醇至60℃相对密度0.90～0.9,，放冷，静置，滤过，得析出物I，滤液l备用； 

步骤2， 

取初漉液加50％乙醇稀释至含醇量75％，用10％氢氧化钠的65％乙醇溶液碱化至漉液中无没食子酸斑点，静置12小时，取上清液用盐酸调节pH值至6.0～7.0，减压回收乙醇至60℃相对密度1.00～1.02，放冷，静置，滤过，得沉淀物l和滤液2， 

步骤3， 

滤液2与滤液l合并，减压浓缩至80℃相对密度1.40～1.45，加6倍稠膏重量的乙醇回流2次，每次0.5小时，滤过，滤液用10％氢氧化钠的65％乙醇溶液碱化至溶液中无没食子酸斑点，静置12小时，滤过，滤液调节pH值至6.0～7.0，减压回收乙醇，浓缩至80℃相对密度为1.45～1.48，并与上述沉淀物1合并，称定重量，加入10倍量0.5％氢氧化钠水溶液溶解，浓盐酸调节pH值至6.0～7.0，加入0.2倍合并物重量的明胶，加热，浓缩至80℃相对密度为1.40～1.45，趁热缓缓加入4倍量乙醇，加热搅拌至明胶析出，滤过，收集沉淀和滤液，沉淀加入适量沸水，加热使溶解，使80℃相对密度为1.40～1.45，趁热缓缓加入4倍量乙醇，加热搅拌至明胶析出，滤过，收集沉淀和滤液，沉淀再重复操作1次，合并3次滤液，减压回收乙醇至60℃相对密度0.95～0.97，放冷，滤过，收集析出物II和滤液3， 

步骤4， 

滤液3检查鞣质至阴性，加4倍量乙醇沉淀除尽残留明胶，滤过，回收乙醇，蒸干，85℃，0.07MPa减压干燥，粉碎，加6倍干固物重量乙醇回流2次，每次0.5小时，合并乙醇液，减压回收乙醇，得残留物， 

步骤5， 

残留物与析出物I、析出物II合并，混匀，65℃以下减压干燥，即得本发明的大黄总蒽醌。 

本发明的大黄总蒽醌，其检测方法如下： 

其【性状】为褐黄色粉末，气微，味微苦。 

其【鉴别】方法如下：取本发明的大黄总蒽醌0.1g，加三氯甲烷4Oml超声处理 lO分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。另取芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、大黄素、大黄酸对照品，加甲醇溶解，分别制成每1ml含0.2mg、0.1mg，0.1mg,0.1mg,0.2mg的溶液作为对照溶液，照薄层层析法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种供试品和对照品溶液各5～10μl分别点于同一以羧甲基纤维素纳为黏合剂的硅胶H薄层板上(新活化)，以石油醚(30～60℃)一甲酸乙酯一甲酸(15:5:1)10℃以下放置的上层溶液为展开剂，在25℃以下展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。 

其【检查】方法如下： 

没食子酸的检查：取本发明的大黄总蒽醌细粉25mg，置5ml量瓶中，加甲醇4～5ml超声处理30分钟使溶解，冷却，加甲醇稀释至刻度，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。另取没食子酸对照品，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各5μl分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯—乙酸乙酯—甲酸(5:4:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铁乙醇溶液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，出现的斑点颜色应不得深于对照品斑点的颜色。土大黄苷的检查：取本发明的大黄总蒽醌0.2g，加甲醇2ml，温浸10分钟，放冷，取上清液10ul点于滤纸上，以45％乙醇展开，取出，晾干，放置10分钟，置紫外光灯(365nm)下检视，不得显持久的亮紫色荧光。 

其【含量测定】方法如下： 

(1)、总蒽醌 

对照品溶液的制备 

取大黄素对照品约10mg，精密称定，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。 

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml、1.2ml、1.6ml置l0ml具塞试管中，蒸发至干，残渣分别精密加入0.8％醋酸镁甲醇溶液l0ml使溶解，摇匀，以第一份为空白，照紫外一可见分光光度法(中国药典2010年版一部附录VA)，在510nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。 

测定法：取本品约40mg，精密称定，置100ml园底烧瓶中，加8％盐酸溶液20ml，再加三氯甲烷20mL置沸水浴中加热回流1小时，冷却，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器至无色，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次(20ml、15ml、10ml)，合并三氯甲烷提取液置100ml量瓶中，加三氯甲烷稀释至刻度，摇匀。精密量取0.4ml置10ml具塞试管中，蒸发至干，残渣分别精密加入0.8％醋酸镁甲醇溶液l0ml使溶解，摇匀，以第一份为空白，照紫外一可见分光光度法(中国药典2010年版一部附录VA)，在510nm的波长处测定吸光度，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品中总蒽醌的量，计算，即得。 

本品按干燥品计算，含总蒽醌以大黄素(C_l5H_LoO₅计，应为50％-60％)。 

(2)、游离蒽醌 

对照品溶液的制备 

取大黄素对照品约10mg，精密称定，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。 

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml、1.2ml、1.6ml置lOml具塞试管中，蒸发至干，残渣分别精密加入0.8％醋酸镁甲醇溶液lOml使溶解，摇匀，以第一份为空白，照紫外一可见分光光度法(中国药典2010年版一部附录VA)，在510nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。 

测定法：取本品约40ml，精密称定，置100ml锥形瓶中，加三氯甲烷约60ml超声处理(功率250W，频率25KHz)40分钟，放冷，滤过，用三氯甲烷冲洗滤器及锥形瓶，并入滤液中，滤液转移至100ml量瓶中，加三氯甲烷稀释至刻度，摇匀。精密量取0.4ml置lOml具塞试管中，蒸发至干，残渣分别精密加入0.8％醋酸镁甲醇溶液lOml使溶解，摇匀，以第一份为空白，照紫外一可见分光光度法(中国药典2010年版一部附录VA)，在510nm的波长处测定吸光度，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品中游离蒽醌的量，计算，即得。 

本品按干燥品计算，含游离蒽醌以大黄素(C_l5H_LoO₅)计，应为48％-58％。 

(3)、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚总量：照高效液相色谱法(中国到典2010年版一部附录VID)测定。 

色谱条件与系统适用性试验以十八炕基硅炕键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1％磷酸溶液(85:15)为流动相:检测波长为440nm。理论板数按大黄素峰计算应不低于3000。 

对照品溶液的制备取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素各10μg、大黄素甲醚20μg、大黄酚50μg的混合溶液，即得。 

供试品溶液的制备：取本品约15mg，精密称定，置100ml量瓶中，加入甲醇适量，超声处理(功率250W，频率25KHz)30分钟，使其溶解，取出，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液10ml(剩余滤液备用)，置烧瓶中，挥去溶剂，加8％盐酸溶液20ml再加三氯甲烷20ml加热回流2小时，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷振摇提取3次，每次10时，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解并转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。 

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl注入液相色谱仪，测定，即得。 

本品按干燥品计算，含芦荟大黄素(C₁₅H₃₀O₅)、大黄酸(C₁₅H₈O₆)、大黄素(C₁₅H_lOO₅)、大黄酚(C₁₅H_lOO₄)、大黄素甲醚(C₁₆H₁₂O₅)的总量不得少于50％。 

(4)游离芦荟大黄素、游离大黄酸、游离大黄素、游离大黄酚、游离大黄素甲醚总量照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VID)测定。 

照高效液相色谱法(中国到典2010年版一部附录VID)测定。 

色谱条件与系统适用性试验以十八炕基硅炕键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1％磷酸溶液(85:15)为流动相:检测波长为440nm。理论板数按大黄素峰计算应不低于3000。 

对照品溶液的制备取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素各10μg、大黄素甲醚20μg、大黄酚50μg的混合溶液，即得。 

供试品溶液的制备：取本品约15mg，精密称定，置100ml量瓶中，加入甲醇适量，超声处理(功率250W，频率25KHz)30分钟，使其溶解，取出，放冷，加 甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，滤液的一部分作为供试品溶液。 

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl注入液相色谱仪，测定，即得。 

本品按干燥品计算，含游离芦荟大黄素(C₁₅H₃₀O₅)、游离大黄酸(C₁₅H₈O₆)、游离大黄素(C₁₅H_lOO₅)、游离大黄酚(C₁₅H_lOO₄)、游离大黄素甲醚(C₁₆H₁₂O₅)的总量不得少于40％。 

本发明的大黄总蒽醌，其中， 

含总蒽醌以大黄素计，为50％-60％。 

含游离蒽醌以大黄素计，为48％-58％。 

按干燥品计算，含芦荟大黄素(C₁₅H₃₀O₅)、大黄酸(C₁₅H₈O₆)、大黄素(C₁₅H_lOO₅)、大黄酚(C₁₅H_lOO₄)、大黄素甲醚(C₁₆H₁₂O₅)的总量不少于50％。 

按干燥品计算，含游离芦荟大黄素(C₁₅H₃₀O₅)、游离大黄酸(C₁₅H₈O₆)、游离大黄素(C₁₅H_lOO₅)、游离大黄酚(C₁₅H_lOO₄)、游离大黄素甲醚(C₁₆H₁₂O₅)的总量不少于40％。 

本发明的大黄总蒽醌可以制备成片剂，胶囊等口服药物形式，也可以制备成外用和注射用药物形式，如含有以下重量比例的组分制备的片剂或胶囊剂： 

制备方法如下： 

1)大黄总蒽醌，微晶纤维素，混合均匀； 

2)将聚维酮用95％(v/v)的乙醇溶解，制备成含有10％的聚维酮溶液(10份重量的聚维酮溶解到95％的乙醇中得到100份体积的聚维酮乙醇溶液)； 

3)将10％的聚维酮溶液加入上述混合物中搅拌均匀，制软材，过18目筛制颗粒，干燥，颗粒干燥后加入硬脂酸镁混匀，装1000粒胶囊。或上压片机压1000片，再包衣即可。 

本发明在研究大黄总蒽醌的过程中意外的发现其对乙型病毒性肝炎的退黄具有治疗作用，为此本发明的核心在于，提供一种老药新用途，即用本发明的大黄总 

蒽醌制备一种用于乙型病毒性肝炎患者退黄的药物。 

以下通过实验数据说明本发明的新用途。 

一、大黄总蒽醌对小鼠四氯化碳急性肝损伤的治疗作用 

取昆明种小鼠90只，Ⅱ级，雄性、体重21～23g，随机分成6组，每组15只，分别是：正常对照组、模型对照组、联苯双酯200mg/kg剂量组、大黄总蒽醌22.5mg/kg、45mg/kg和90mg/kg剂量组。实验前称体重，在实验的第一天的上午，除正常对照组外，其他各组动物均腹腔注射0.1％CCL₄橄榄油10ml/kg，造成急性肝损伤模型，尔后口服给药，每天一次，连续15天，正常和模型对照组给等量生理盐水。第15天下午，再重复腹腔注射0.1％CCL₄橄榄油10ml/kg一次。18小时后，小鼠称重，摘眼球采血，测血清ALT、AST，剖腹取肝脏，肉眼观察并称湿重，并用10％福尔马林液固定，HE染色，病理切片镜检，正常对照组动物不给任何药物，结果进行组间t测验。 

结果： 

1、大黄总蒽醌对CCL₄致小鼠肝损伤的血清ALT和AST的影响 

大黄总蒽醌22.5mg/kg、45mg/kg和90mg/kg三个剂量组及联苯双酯200mg/kg阳性药组动物的血清ALT平均值，与模型组动物比较差异均有非常显著的意义(P＜0.01)，均能非常显著的降低四氯化碳致动物肝损伤引起的ALT平均值升高。 

大黄总蒽醌45mg/kg和90mg/kg剂量组与阳性药组动物的血清AST平均值，与模型组动物比较，差异均有非常显著的意义(P＜0.01)，能显著的降低四氯化碳致动物肝损伤引起的AST平均值升高作用。大黄总蒽醌22.5mg/kg剂量组亦有明显的降低作用(P＜0.05)，见表1。 

表1 大黄总蒽醌对四氯化碳致小鼠肝损伤血清ALT与AST的影响

与模型组比较*P＜0.05.**P＜0.01. 

2、病理学检查： 

小鼠肝脏病理切片镜检显示：正常对照组小鼠多数肝脏切片镜检未见异常，少数可见轻度炎症细胞浸润和气球样变。而模型组肝脏损伤严重，可见严重灶状坏死和炎症反应，有嗜酸性小体形成，少数出现大块坏死。而大黄总蒽醌三个剂量组和联苯双酯阳性药组小鼠肝脏病理变明显减轻，并纤维组织修复。见表2 

表2 大黄总蒽醌对四氯化碳所致小鼠肝脏病理改变镜检结果 

二、大黄总蒽醌对D-Glan致大鼠急性肝损伤的影响 

取Wistar大鼠60只，Ⅱ级(清洁级)，雄性，体重：180～200g，随机分成6组，每组10只，分别为：正常对照组，模型组，大黄总蒽醌7.5mg/kg，15mg/kg和30mg/kg剂量组，联苯双酯60mg/kg剂量组，每天灌胃给药一次，连续15天，除正常组外，其他各组动物在末次给药2小时后，腹腔注射10％D-Glan橄榄油 液800mg/kg，48小时后，眼眶采血测ALT、AST，并取各鼠同一叶肝脏做病理切片镜检，结果t测验。 

结果： 

1、大黄总蒽醌对D-Glan所致大鼠急性肝损伤血清ALT、AST的影响 

大黄总蒽醌7.5mg/kg剂量组动物的血清ALT值与模型组比较，有明显的降低，差异有显著性的意义(P＜0.05)；而15mg/kg和30mg/kg剂量组及联苯双酯60mg/kg剂量组动物，与模型组动物ALT值比较有非常明显的降低，差异有非常显著性意义(P＜0.01)，能非常显著的对抗D-Glan对大鼠所致的肝损伤。大黄总蒽醌7.5mg/kg剂量组动物的AST值，与模型组比较，无明显差异(P＞0.05)；而15mg/kg剂量组动物的AST值与模型组比较，则有明显的差异(P＜0.05)；大黄总蒽醌30mg/kg剂量组与联苯双酯60mg/kg剂量组动物的AST平均值与模型组比较均有非常显著的差异(P值均＜0.01)，均能非常显著的降低D-Glan致大鼠急性肝损伤引起的血清AST的升高，见表3 

表3 大黄总蒽醌对D-Glan致大鼠肝损伤血清ALT和AST的影响

与模型组比较*P＜0.05.**P＜0.01. 

2、病理学检查： 

大鼠肝脏病理切片镜检显示：正常对照组大鼠肝脏切片镜检未见异常，偶见轻度炎症细胞。模型组肝脏损伤严重，镜检见肝细胞拥挤，胞浆疏松，嗜酸性小体和气球样细胞易见。肝细胞核大小不一，核膜增厚，核质聚集，小叶内散在着 肝细胞的点状坏死灶，灶内和肝窦内有较多单核细胞，分叶核白血球，淋巴球等。枯否氏细胞增多并肥大。而大黄总蒽醌和联苯双酯给药组动物的肝脏病变明显减轻，并有纤维组织修复。见表4 

表4 大黄总蒽醌对D-Glan所致大鼠肝脏病理改变镜检结果 

三、大黄总蒽醌对大鼠实验性黄疸的影响 

取Wistar大鼠60只，雄性，Ⅱ级、体重200±10g，随机分成6组，每组10只，分别为：正常对照组、模型对照组、大黄总蒽醌7.5mg/kg、15mg/kg和30mg/kg剂量组、联苯双酯60mg/kg剂量组。每天灌胃给药一次，连续15天，正常组与模型组给等量生理盐水。在实验的第13天，除正常组外，其他各组动物，灌胃2.5％ANIT橄榄油液70mg/kg造型(继续灌胃给药)，48小时后，断头取血，测血清总胆红素、直接胆红素、ALT、AST，肝脏作病理切片检查，结果t测验。 

结果 

1、大黄总蒽醌对血清总胆红素和直接胆红素的影响 

大黄总蒽醌7.5mg/kg剂量组动物的血清总胆红素平均值与模型组比较有明显的降低作用，差异有显著的意义(P＜0.05)，大黄总蒽醌15mg/kg和30mg/kg剂量组动物的血清总胆红素值与模型组比较有非常明显的下降，差异有非常显著的意义(P＜0.01)，联苯双酯60mg/kg剂量组与模型组比较亦有明显的差异(P＜0.05)。 

大黄总蒽醌7.5mg/kg剂量组动物的血清直接胆红素值与模型组动物比较无明显的差异(P＞0.05)；15mg/kg和30mg/kg剂量组动物的血清直接胆红素值与模型组比较有非常明显的下降，差异有非常显著的意义(P＜0.01)，联苯双酯阳性对照组与模型组比较亦有明显差异(P＜0.05)。见表5。 

表5 大黄总蒽醌对ANIT致大鼠实验性黄疸血清总胆红素和直接胆红素的影响

与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01 

2、大黄总蒽醌对血清ALT、AST的影响 

大黄总蒽醌7.5mg/kg剂量组动物的血清ALT平均值与模型组比较，有明显的差异(P＜0.05)，而15mg/kg和30mg/kg剂量组及联苯双酯60mg/kg剂量组动物的血清ALT平均值与模型组比较有非常显著的差异(P＜0.01)。 

大黄总蒽醌15mg/kg剂量组动物的血清AST平均值与模型组比较有明显的差异(P＜0.05)，30mg/kg剂量组和联苯双酯组动物的血清AST平均值与模型组动物比较有非常显著的差异(P＜0.01)。而大黄总蒽醌7.5mg/kg剂量组动物的血清AST值与模型组比较无明显差异(P＞0.05)。见表6。 

表6 大黄总蒽醌对ANIT致大鼠实验性黄疸血清ALT、AST的影响

与模型组比较，*P＜0.05.**P＜0.01 

3、病理学检查 

病理镜检结果显示，正常组大鼠肝脏切片镜检未见异常；模型组肝脏损伤严重，可见毛细胆管增生及小叶间胆管周围产生炎症，从而造成了胆管阻塞，形成明显的胆汁郁积，并伴随有点状坏死为主的肝实质细胞损害。而大黄总蒽醌和联苯双酯给药组能明显减轻肝脏损害，见表7。 

表7 大黄总蒽醌对ANIT致大鼠肝脏病理改变镜检结果

注1：+++门脉区胆管上皮细胞坏死；++门脉区胆管上皮细胞空泡变形；+门脉区胆管上皮细胞水肿；0基本正常。 

注2：+++炎性细胞浸润严重；++炎性细胞浸润较重；+炎性细胞浸润较轻；0基本正常。 

注3：+++小叶间门脉区胆管上皮细胞严重坏死，大量碎屑进入管腔、引起明显 阻塞，另外毛细胆管大量增生及小叶间胆管周围产生严重炎症，亦造成胆管严重阻塞，形成严重的胆汁郁积。++毛细胆管增生与小叶间胆管周围产生炎症，造成胆管阻塞，胆汁郁积明显；+毛细胆管增生与小叶间胆管周围炎症不严重，胆管阻塞不明显，未见胆汁郁积；0基本正常。 

注4：+++肝实质细胞损伤严重，点状坏死范围广泛；++肝实质细胞有损害，点状坏死范围不大；+肝实质细胞损害较轻，点状坏死较少见；0基本正常。 

四、大黄总蒽醌对大鼠的利胆作用 

取Wistar大鼠50只，Ⅱ级，雄性，体重：220～250，随机分成5组，每组10只，分别为：生理盐水对照组，联苯双酯阳性药对照组，大黄总蒽醌7.5mg/kg、15mg/kg和30mg/kg剂量组，实验前12小时禁食不禁水，实验时用20％乌拉坦5ml/kg腹腔注射麻醉，固定于手术台上，进行胆总管插管术，插入直径为0.6mm的聚乙烯管，待胆汁入管后，用丝线结扎，导管引出腹腔，用10ml离心管收集胆汁，手术后用止血钳夹闭腹壁，用生理盐水纱布覆盖。待稳定15～20min后，先收集1小时胆汁，然后各组大鼠分别由十二指肠注入不同剂量的药物，生理盐水组给等容量的生理盐水，各组给药体积均为1ml/100g，每小时补充5％葡萄糖盐水5ml/kg一次。分别收集给药后不同时间的胆汁分泌量，并测定给药前后胆汁中的总胆红素和总胆固醇含量，结果t测验。 

结果： 

1、大黄总蒽醌对大鼠胆汁分泌量的影响 

大黄总蒽醌给药后，胆汁分泌量均有不同程度的增加，以给药后1小时胆汁分泌增加最为明显。大黄总蒽醌7.5mg/kg剂量组分泌增加率10％，15mg/kg剂量组为30.5％，30mg/kg剂量组为48.87％，而联苯双酯剂量组的胆汁分泌增加率仅为3.74％，表明其利胆作用不明显。 

由表8可见，大黄总蒽醌30mg/kg和15mg/kg剂量组给药后胆汁分泌量都有非常显著的增加(P＜0.01)，30mg/kg剂量组持续时间在3h以上，15mg/kg剂量组持续时间在2h以上，7.5mg/kg剂量组给药后胆汁分泌量虽有增加，但与生理盐水组比较无明显差异(P＞0.05)。见表8 

表8 大黄总蒽醌对大鼠胆汁分泌量的影响

说明： 

②括号内数字为胆汁增加率。 

2、大黄总蒽醌对大鼠胆汁中总胆红素、总胆固醇含量的影响 

由表9可见，大黄总蒽醌30mg/kg和15mg/kg剂量组动物，给药后胆汁中胆红素的含量都有非常显著的增加(P＜0.01)，7.5mg/kg剂量组动物胆汁中胆红素含量也有显著地增加(P＜0.05)，但大黄总蒽醌各剂量组对动物胆汁中的总胆固醇含量无明显影响(P值均＞0.05)。见表9。 

表9 大黄总蒽醌对大鼠胆汁中总胆红素、总胆固醇含量的影响

与生理盐水组比较：*P＜0.05.**P＜0.01 

五、大黄总蒽醌对大鼠实验性慢性肝损伤的保护作用 

取6周龄SD大鼠120只，Ⅱ级，雄性，体重160±5g，随机分成6组，每组20只，分别是：正常对照组、模型对照组、联苯双酯60mg/kg剂量组、大黄总蒽醌7.5mg/kg、15mg/kg和30mg/kg剂量组。除正常组外，其余各组动物均于皮下注射10％CCL4橄榄油液5ml/kg，每周2次，连续3个月，造成实验性慢性肝损伤模型。从造型的第二个月起，开始给动物灌胃给药，每日一次，连续2个月，正常组及模型组给生理盐水。每周称体重1次，以调整给药剂量及造型用CCL4剂量。末次给药24小时后，大鼠称重、摘眼球采血，测ALT、AST、总蛋白、白蛋白，剖腹取肝脏，肉眼观察并称湿重。左肝用10％福尔马林液固定、H·E与V·G染色，病理切片镜检，记录肝纤维增生程度；右肝测定羟脯氨酸及胶原蛋白含量。结果t测验。 

结果： 

1、大黄总蒽醌对慢性肝损伤大鼠血清ALT、AST的影响 

大黄总蒽醌15mg/kg剂量组与联苯双酯组动物的血清ALT平均值与模型组比较，均有显著的差异(P＜0.05)，大黄总蒽醌30mg/kg剂量组动物的血清ALT值与模型组比较有非常显著的差异(P＜0.01)，而7.5mg/kg剂量组动物的ALT值与模型组比较无明显差异(P＞0.05)。 

大黄总蒽醌30mg/kg剂量组动物的血清AST值与模型组比较亦有非常明显的下降，差异有非常显著的意义(P＜0.01)，见表10。 

表10 大黄总蒽醌对大鼠慢性肝损伤血清ALT、AST的影响

与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01 

2、大黄总蒽醌对慢性肝损伤大鼠总蛋白、白蛋白及白蛋白/球蛋白比例的影响 

大黄总蒽醌30mg/kg计量组和联苯双酯组动物的总蛋白，白蛋白及白蛋白/球蛋白的比值与模型组动物比较，均有非常显著的升高，大黄总蒽醌15mg/kg、7.5mg/kg剂量组作用稍弱。见表11。 

表11 大黄总蒽醌对大鼠慢性肝损伤总蛋白、白蛋白及总蛋白/白蛋白比例的影响

与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01 

3、大黄总蒽醌对慢性肝损伤大鼠肝羟脯氨酸及胶原蛋白含量的影响 

大黄总蒽醌和联苯双酯组动物的肝内羟脯氨酸和胶原蛋白的含量与模型组比较均有非常明显的下降，差异有非常显著的意义(P值均＜0.01)，见表12。 

表12 大黄总蒽醌对慢性肝损伤大鼠肝羟脯氨酸及胶原蛋白含量的影响

与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01 

4、病理学检查 

H·E染色标本观察：正常组大鼠肝细胞未见异常；模型组肝小叶失去正常结构，肝板排列紊乱，肝细胞普遍变性，多数表现为胞质内有大量脂滴积聚(脂肪变)，少数为细胞质疏松或肿胀(水样变)，甚至如气球状(气球样变)。各例均可见到程度不等、范围不一的肝细胞坏死区，坏死区中央或周边有中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞或浆细胞浸润。肝细胞再生活跃，核分裂相多见。肝窦多受压变窄、闭塞，少数代偿性扩胀，枯否氏细胞多肥大增生；门脉区有大量成纤维细胞、纤维细胞和增生的胶原纤维，伴同炎症细胞和增生的小血管，组成纤维间隔向小叶内伸展。与模型组比较，大黄总蒽醌7.5mg/kg剂量组变性、坏死的肝细胞数量略减轻。15mg/kg组变性、坏死肝细胞数量减少，部分肝细胞水样变轻，为颗粒变性。纤维组织增生和肝小叶结构的破坏明显减轻。30mg/kg组各标本中肝细胞脂肪变程度轻、脂滴小，有半数标本的部分肝细胞为颗粒变性。其肝细胞空泡变、坏死、炎症浸润及纤维组织增生、肝小叶结构破坏等均有非常明显的减轻。见表13。 

V·G染色标本观察：模型组肝内主要由胶原纤维组成的纤维间隔正在形成或已形成，其破坏界板，分割、包绕肝小叶，部分已有假小叶。各给药组胶原纤 维增生均减轻。尤以大黄总蒽醌30mg/kg和联苯双酯组明显。见表13。 

表13 大黄总蒽醌对慢性肝损伤大鼠肝脏病理改变的影响

注1：+++表示肝细胞内出现大空泡，弥散分布；++表示多数细胞内出现大小不等圆形空泡；+表示部分肝细胞内出现大小不等的圆形空泡，散在分布；0基本正常。 

注2：+++表示肝细胞呈点状灶性溶解坏死，弥散分布；++表示肝细胞灶性溶解坏死，分布范围较广；+表示肝细胞溶解坏死散在分布；0基本正常。 

注3：+++表示胶原纤维呈较宽的条索状分隔肝小叶，胶原纤维明显增加；++表示胶原纤维呈细条索状分隔肝小叶，散在分布；+表示胶原纤维含量增加，但很少形成条索分隔肝小叶；0基本正常。 

注4：+++表示较多的假小叶形成；++表示有较少的假小叶形成；+表示形成的假小叶极少；0基本正常。 

六、对小鼠血清溶血素的影响 

取昆明种小鼠60只，Ⅱ级，雌雄各半，体重20.6±1.04g，随机均分6组，每组10只，分别为：正常对照组、模型组、大黄总蒽醌22.5mg/kg、45.0mg/kg和90.0mg/kg剂量组和联苯双酯200.0mg/kg剂量组。正常组腹腔注射生理盐水0.5ml/天，同时灌胃0.5ml 0.5％羧甲基纤维素钠。模型组腹腔注射醋酸氢化可的松0.5ml/天，同时灌胃0.5ml 0.5％羧甲基纤维素钠。其余各组分别腹腔注射醋酸氢化可的松0.5ml/天，同时灌胃各对应不同浓度的药物0.5ml，连续给药21天， 于给药第16天腹腔注射10％绵羊红细胞0.2ml进行免疫，末次给药后小鼠摘眼球取血，分离血清，用生理盐水1：250稀释，加入0.5ml绵羊红细胞及1ml补体，37℃水浴10分钟，水浴终止反应，2000rpm离心10分钟，加都氏试剂3ml，用721型分光光度计540nm波长处测定吸收度，计算50％溶血值(HC50)。 

计算：(1)测定试验用绵羊半数溶血时的吸收度值：试验测定所用绵羊红细胞半数溶血时血红蛋白的吸收值。即取0.25ml绵羊红细胞悬液，用都氏试剂稀释至4ml。摇匀，放置10分钟，在540nm波长比色，记录吸收值即为试验中所用绵羊红细胞半数溶血时的吸收值。 

(2)计算样品的半数溶血值(HC50) 

结果：大黄总蒽醌各剂量组动物的血清溶血素与模型组比较没有明显的差异(P＞0.05)。见表14。 

表14 对小鼠溶血素的影响

注：与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。 

七、对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响 

取昆明种小鼠60只，Ⅱ级，雌雄各半，体重19～21g，随机均分6组：正常对照组、模型组、大黄总蒽醌22.5mg/kg、45.0mg/kg和90.0mg/kg剂量组及联苯双酯200.0mg/kg剂量组、正常组腹腔注射生理盐水0.5ml/天，同时灌胃0.5ml 0.5％羧甲基纤维素钠。模型组腹腔注射醋酸氢化可的松0.5ml/天，同时灌胃0.5ml 0.5％ 羧甲基纤维素钠。其余各组分别腹腔注射醋酸氢化可的松0.5ml/天，同时灌胃各对应不同浓度的药物0.5ml，连续给药21天，末次给药后腹腔注射5％鸡红细胞悬液0.5ml，1.5小时后颈椎脱位法处死小鼠，腹腔注入生理盐水2ml，轻揉腹部，从腹腔抽取腹腔液，滴片，37℃温育30分钟，生理盐水漂洗，甲醇固定，Gimsa染色，油镜观察，计算吞噬百分率及吞噬指数。结果大黄总蒽醌个剂量组小鼠巨噬细胞吞噬率与模型组比较没有显著的差异(P＞0.05)见表15。 

表15 对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响 

注：与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。 

八、对ConA诱导小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响 

取昆明种小鼠60只，Ⅱ级，雌雄各半，体重9～21g，随机均分6组：正常对照组、模型组、大黄总蒽醌22.5mg/kg、45.0mg/kg和90.0mg/kg剂量组及联苯双酯200.0mg/kg组。各组分别灌胃各对应不同浓度的药液。连续21天，给药第21天，颈椎脱位法处死小鼠，无菌条件下取脾脏，剪碎挤压过100目不锈钢筛网，1500rpm离心10分钟，弃上清液，加入适量0.83％NH₄CL溶液溶解红细胞，再用RPMI-1640洗涤2次，台盼蓝染色计数后在96孔板中每孔加入100μL浓度为5×106个/ml的脾细胞悬液(含2％小牛血清)及POUI浓度为10ug/ml的ConA，同时设不加ConA的阴性对照，每只小鼠为一样本，每一样本设3复孔，置37℃、5％CO₂条件下培养72小时，于结束前12小时每孔加入³H-TDR1.85KBq，培养结束时用多头细胞收集器收集细胞于玻璃纤维滤膜上，并依次用生理盐水、 5％三氯醋酸、无水乙醇洗涤，将滤膜置60℃烘干，冷却后将滤膜(吸附样品面向上)置盛有5ml闪烁液(2，5-二苯基恶唑-PPO 4g，POPOP 0.3g，二甲苯加至1000ml)的测量杯中，测掺入的放射性强度(cpm)。结果如表16。 

表16 对ConA诱导小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响 

注：与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。 

九、大黄总蒽醌对血清总胆红素和直接胆素的影响 

大黄总蒽醌7.5mg/kg剂量组动物的血清总胆红素平均值与模型组比较有明显的降低作用，差异有显著的意义(P＜0.05)；15mg/kg和30mg/kg剂量组动物的血清总胆红素平均值与模型组比较有非常明显的下降，差异有非常显著的意义(P＜0.01)；联苯双酯60mg/kg剂量组与模型组比较无明显差异(P＞0.05)。 

大黄总蒽醌7.5mg/kg、15mg/kg剂量组动物的血清直接胆红素平均值与模型组动物比较有明显的差异(P＜0.05)；30mg/kg剂量组动物的血清直接胆红素平均值与模型组动物比较有非常明显的下降，差异有非常显著的意义(P＜0.01)，联苯双酯60mg/kg剂量组与模型组比较无明显差异(P＞0.05)。见表17。 

表17 大黄总蒽醌对ANIT致大鼠阻塞性黄疸血清总胆红素直接胆红素的影响

注：与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。 

十、大黄总蒽醌对血清ALT、AST的影响 

大黄总蒽醌7.5mg/kg剂量组动物的血清ALT平均值与模型组动物比较，有明显的差异(P＜0.05)；而15mg/kg和30mg/kg剂量组及联苯双酯60mg/kg剂量组动物的血清ALT平均值与模型组动物比较有非常显著的差异(P＜0.01)。 

大黄总蒽醌15mg/kg剂量组动物的血清AST平均值与模型组动物比较，有明显的差异(P＜0.05)；大黄总蒽醌30mg/kg剂量组及联苯双酯剂量组动物的血清AST平均值与模型组动物比较均有非常显著的差异(P均值＜0.01)；而大黄总蒽醌7.5mg/kg剂量组动物的血清AST值与模型组动物比较，无明显差异(P＞0.05)。见表18。 

表18 大黄总蒽醌对ANIT致大鼠阻塞性黄疸血清ALT、AST的影响

注：与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。 

3、病理学检查 

病理镜检结果显示，正常组大鼠肝脏切片镜检均未见异常；模型组肝脏损伤严重，可见毛细胆管增生及小叶间胆管周围产生炎症，从而造成了胆管阻塞，形成明显的胆汁郁积，并伴随有点状坏死为主的肝实质细胞损害。而大黄总蒽醌和联苯双脂给药组能明显减轻肝脏损害，见表19。 

表19 大黄总蒽醌对ANIT致大鼠肝脏病理改变镜检结果

注1：+++门脉区胆管上皮细胞坏死；++门脉区胆管上皮细胞空泡变形；+门脉区胆管上皮细胞水肿；0基本正常。 

注2：+++炎性细胞浸润严重；++炎性细胞浸润较重；+炎性细胞浸润较轻；0基本正常。 

注3：+++小叶间门脉区胆管上皮细胞严重坏死，大量碎屑进入管腔、引起明显阻塞，另外毛细胆管大量增生及小叶间胆管周围产生严重炎症，亦造成胆管严重阻塞，形成严重的胆汁郁积。++毛细胆管增生与小叶间胆管周围产生炎症，造成胆管阻塞，胆汁郁积明显；+毛细胆管增生与小叶间胆管周围炎症不严重，胆管阻塞不明显，未见胆汁郁积；0基本正常。 

注4：+++肝实质细胞损伤严重，点状坏死范围广泛；++肝实质细胞有损害，点状坏死范围不大；+肝实质细胞损害较轻，点状坏死较少见；0基本正常。 

克黄利胆胶囊的有效成分为大黄的提取物——大黄总蒽醌，具有泻下、抗菌、抗病毒、导滞通便、利水通淋、舒肝利胆、积滞腹痛、抗肿瘤、消炎、止血、止 吐、止痛等多方面的药理作用。江西昌诺药业有限公司根据中医传统理论以及现代药理研究，以大黄提取的大黄总蒽醌为原料，研制开发了克黄利胆胶囊。 

根据国家食品药品监督管理局批准(药物临床研究批件号：2003L02157)，对该药进行Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期临床试验，以广西中医学院第一附属医院、云南中医学院第一附属医院等为临床试验单位，依照《药品注册管理办法》、《药物临床试验质量管理规范》及临床前研究资料进行了Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期临床试验。 

Ⅰ期临床： 

克黄利胆胶囊Ⅰ期临床试验计划观察健康受试者32例，其中6个单次给药剂量组共计24例，2个连续给药剂量组共计8例。其中单剂量组在剂量递增过程中，第5组出现2例药物不良应反应，故按照方案规定终止试验，不再进行单剂量第6组的试验。单剂量组实际完成试验20例，连续剂量组2个组8例均完成试验。所有受试者年龄在19岁到23岁之间，男女各半，试验前一般情况和体格检查符合试验方案要求。 

结论 

试验结果示：克黄利胆胶囊每次2～3粒，每天3次，饭后口服，连续使用14天是安全的，推荐此剂量作为Ⅱ期临床研究剂量。由于该药本身具有泻下作用，故在临床用量过大时，可能会出现一过性腹痛、腹泻等症状，一般停药后症状即可逐渐消失，但对有慢性胃肠道疾病者要慎用。 

II期临床 

14.1一般资料 

本试验共入组乙型黄疸型肝炎-肝胆湿热证216例。试验1组、试验2组和对照组各72例，其中，试验1组完成试验方案64例，剔除3例，脱落5例；试验2组完成试验方案68例，脱落4例；对照组完成试验方案69例，脱落3例。试验1组、试验2组与对照组完成治疗方案情况，经检验差异无统计学意义(P>0.05)。 

试验前试验1组、试验2组与对照组的基线资料包括性别、年龄、体重、病程、临床分期及黄疸程度、过敏史、合并疾病、试验前用药、生命体征以及实验室检查等差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。 

试验过程中除脱落病例外，试验1组、试验2组与对照组的依从性均良好，没有出现违背方案的合并用药。 

14.2疗效评价 

14.2.1退黄疗效(FAS)：疗后三组的总胆红素均值均较治疗前降低，试验1组、试验2组与对照组治疗前、后的总胆红素均值分别为50.34±10.36和26.86±15.51、49.55±8.87和24.33±12.23、50.91±11.03和24.17±9.51，前后差异均有统计学意义(P<0.0001)。协方差分析，扣除协变量和中心间差别因素影响，试验1组、试验2组与对照组治疗前后的总胆红素差值，差异均无统计学意义(P＞0.05)。PPS分析和FAS分析结论一致。 

经校正中心效应的CMH卡方分析，试验1组、试验2组与对照组的退黄疗效总有效率(显效+有效)分别为：56.94％、55.56％和59.72％，组间差异无统计学意义(P>0.05)，PPS分析和FAS分析结论一致。 

试验1组与对照组、试验2组与对照组的退黄有效率差值(95％CI)分别为-2.78％(-5.24％～-0.32％)和-4.16％(-6.60％～-1.72％)，即95％CI_L＞-δ。经非劣效性的单侧检验，试验1组和试验2组分别与对照组比较的非劣检验结果均合格(P＜0.05)，说明试验1组和试验2组的退黄有效率均不劣于对照组。PPS分析和FAS分析结论一致。 

14.2.2按黄疸程度分层分析(FAS)： 

轻度黄疸的退黄有效率，试验1组、试验2组和对照组分别为57.38％、55.00％和56.36％；中度黄疸的退黄有效率，试验1组、试验2组和对照组分别为66.67％、58.33％和68.75％，组间差异均无统计学意义(P>0.05)。PPS分析和FAS分析结论一致。 

14.2.3中医证候疗效(FAS)： 

治疗后三组的中医证候总积分较治疗前均有明显下降。经校正中心效应的CMH卡方分析，试验1组、试验2组与对照组的中医证候总有效率(临床痊愈+显效+有效)分别为：94.44％、94.44％和95.83％，组间差异无统计学意义(P>0.05)，PPS分析和FAS分析结论一致。 

14.2.4主要症状体征(目黄、身黄、小便黄、胁肋疼痛)疗效(FAS): 

试验1组、试验2组与对照组的主要症状体征总有效率(显效+有效)分别为： 90.28％、91.67％和88.89％，组间差异无统计学意义(P>0.05)，PPS分析和FAS分析结论一致。 

14.2.5中医单项症状分析(FAS)： 

试验1组、试验2组与对照组治疗后的目黄、身黄、小便黄、胁肋疼痛、食欲不振、恶心呕吐、倦怠乏力等症状评分改善情况和舌质、脉象的变化，组间差异均无统计学意义(P＞0.05)。舌苔变化组间差异有统计学意义(P＜0.05)。PPS分析和FAS分析结论一致。 

14.2.6肝功检查分析 

14.2.6.1ALT结果分析(PPS)：试验1组、试验2组与对照组治疗前、后的ALT均值分别为94.10±43.58和42.46±22.45、100.92±45.17和48.50±46.59、104.25±50.04和48.67±24.67，组间差异无统计学意义(P>0.05)。 

14.2.6.2AST结果分析(PPS)：试验1组、试验2组与对照组治疗前、后的AST均值分别为70.71±38.59和35.80±16.46、69.68±38.48和35.77±23.74、68.96±22.38和40.19±25.69，组间差异无统计学意义(P>0.05)。 

14.2.6.3ALP结果分析(PPS)：试验1组、试验2组与对照组治疗前、后的ALP均值分别为102.03±34.90和86.81±25.50、105.94±37.38和85.59±17.31、106.21±33.51和86.82±28.44，组间差异无统计学意义(P>0.05)。 

14.2.6.4DBIL结果分析(PPS)：试验1组、试验2组与对照组治疗前、后的DBIL均值分别为20.34±11.33和8.68±5.27、19.94±11.24和8.67±6.63、21.71±12.67和8.87±5.63，组间差异无统计学意义(P>0.05)。 

14.2.6.5尿胆红素及B超检查结果分析(PPS)：试验1组、试验2组与对照组治疗后尿胆红素及B超检查结果异常的病例数较治疗前均有减少，组间差异无统计学意义(P>0.05)。 

14.3安全性评价 

进入本临床试验的安全性分析集病例数为216例，试验1组、试验2组与对 照组各72例。 

三组用药后各阶段的体温、心率、呼吸和血压与用药前自身比较，用药前和用药后各阶段组间比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。 

试验1组出现7例7件不良事件，试验2组出现9例9件不良事件，对照组出现4例4件不良事件，除了对照组1例轻度恶心外，三组所发生的不良事件均表现为轻度或中度的腹泻，考虑与试验药物(大黄总蒽醌)本身的药理作用有关，一般持续1-3天，症状即可消失，无需特殊处理。腹泻的发生率试验1组和试验2组略高于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)。实验室检查，试验结束后，试验1组、试验2组与对照组病例的血、尿、大便常规、心电图、肾功能均未出现与试验药物有关的异常变化 

15、结论 

本临床试验结果表明：试验1组(克黄利胆胶囊2粒，3次/日)和试验2组(克黄利胆胶囊3粒，3次/日)治疗乙型黄疸型肝炎-肝胆湿热证，均有明显退黄，降低血清胆红素，改善肝功能的作用，除少数患者服药后出现轻度或中度腹泻外，无其他不良反应。试验1组和试验2组与对照组相比，其疗效和安全性相似，差异均无统计学意义(P>0.05)。 

考虑试验1组和试验2组之间疗效及安全性差异无统计学意义，故推荐Ⅲ期临床试验的剂量采用试验1组的剂量，即克黄利胆胶囊2粒，3次/日，为进一步评价克黄利胆胶囊的安全性，建议在Ⅲ期临床试验中对腹泻发作次数、严重程度、伴随症状等作进一步的观察。 

Ⅲ期临床 

15.1一般资料 

本试验共入组乙型黄疸型肝炎-肝胆湿热证420例。其中，试验组入组316例，因自觉疗效不佳、腹痛腹泻、失访脱落7例，因不符合入选标准剔除9例。对照组入组104例，因失访和自觉疗效不佳脱落2例，因不符合入选标准剔除2例。试验组与对照组完成治疗方案情况，差异无统计学意义(P>0.05)。 

疗前试验组与对照组的基线资料包括性别、年龄、体重、病程、临床分期及黄疸程度、过敏史、合并疾病、试验前用药、生命体征以及实验室检查等差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。 

试验过程中除脱落病例外，试验组与对照组的依从性均良好，没有出现违背方案的合并用药，两组合并用药的情况，差异无统计学意义(P>0.05)。 

15.2疗效评价 

15.2.1退黄疗效(FAS)：疗后两组的总胆红素均值均较治疗前显著降低，试验组治疗前、后的总胆红素均值(μmol/L)分别为62.49±24.06和29.23±14.06，对照组治疗前、后的总胆红素均值分别为61.56±22.09和30.90±13.48，组间差异无统计学意义(P>0.05)。协方差分析，扣除协变量和中心间差别因素影响，试验组与对照组治疗前后的总胆红素差值，差异均无统计学意义(P>0.05)。PPS分析和FAS分析结论一致。 

经校正中心效应的CMH卡方分析，试验组与对照组的退黄疗效总有效率(显效+有效)分别为：56.35％和50.00％，试验组略高于对照组，差异无统计学意义(P>0.05)，PPS分析和FAS分析结论一致。 

试验组与对照组的退黄有效率差值(95％CI)为6.35％(5.39％～7.31％)，即95％CI_L＞-δ。经非劣效性的单侧检验，试验组与对照组比较的非劣检验结果合格(P＜0.05)，说明试验组的退黄有效率不劣于对照组。PPS分析和FAS分析结论一致。15.2.2按黄疸程度分层分析(FAS)：轻度黄疸的退黄有效率，试验组和对照组分别为47.72％和42.42％；中度黄疸的退黄有效率，试验组和对照组分别为69.90％和60.61％，组间差异无统计学意义(P>0.05)。PPS分析和FAS分析结论一致。 

15.2.3中医证候疗效(FAS)：两组的中医证候总积分较治疗前相比明显下降。疗后试验组的总积分低于对照组，差异有统计学意义，但总积分前后差值的组间差异无统计学意义。中医证候总有效率(临床痊愈+显效+有效)：试验组与对照组分别为94.79％和95.10％，痊显率(临床痊愈+显效)：试验组与对照组分别为56.03％和47.06％，组间差异均无统计学意义(P>0.05)，PPS分析和FAS分析结论一致。 

15.2.4主要症状体征(目黄、身黄、小便黄、胁肋疼痛积分总和)(FAS)：总有效率(显效+有效)：试验组与对照组分别为93.16％和94.12％，组间差异无统计学意义(P>0.05)，PPS分析和FAS分析结论一致。 

15.2.5中医单项症状分析(FAS)：试验组治疗后的小便黄及胁肋疼痛症状评分 程度减轻的病例比例高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，其他症状包括目黄、身黄、食欲不振、恶心呕吐、倦怠乏力等症状评分改善情况和舌、脉象的变化，组间差异均无统计学意义(P＞0.05)。 

15.2.6肝功检验指标分析(PPS)： 

ALT(U/L)：试验组治疗前、后的均值分别为109.48±42.18和52.95±40.65，对照组治疗前、后的均值分别为112.29±51.20和49.30±25.54，组间差异无统计学意义(P>0.05)。 

AST(U/L)：试验组治疗前、后的均值分别为92.30±39.62和47.00±35.58，对照组治疗前、后的均值分别为97.85±55.15和43.44±20.17，组间差异无统计学意义(P>0.05)。 

ALP(U/L)：试验组治疗前、后的均值分别为117.38±69.03和90.56±46.48，对照组治疗前、后的均值分别为116.15±60.49和92.50±31.69，组间差异无统计学意义(P>0.05)。 

DBIL(μmol/L)：试验组治疗前、后的均值分别为28.57±19.66和11.36±9.11，对照组治疗前、后的均值分别为28.21±18.28和12.48±9.10，组间差异无统计学意义(P>0.05)。 

15.2.7尿胆红素及B超检查结果分析(PPS)：试验组与对照组治疗后尿胆红素及B超检查结果异常的病例数较治疗前均有减少，组间差异无统计学意义(P>0.05)。 

15.3安全性评价 

进入本临床试验安全性分析的病例为419例，试验组与对照组分别为315例和104例。 

试验组与对照组用药后各阶段的体温、心率、呼吸和血压与用药前自身比较，用药前和用药后各阶段组间比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。 

实验室检查，试验组疗后的HB、WBC的均值比疗前高，对照组疗后的HB均值比疗前高，差异有统计学意义，但其差值很小，无临床意义。此外两组病例的血、尿、大便常规、心电图、肝肾功能均未出现与试验药物有关的异常变化。 

由于本试验药克黄利胆胶囊的有效成分为大黄总蒽醌，对照药苦黄颗粒也含有大黄总蒽醌，故试验药和对照药除了具有清热祛湿，利胆退黄的药理作用外， 还有一定的泻下作用，本次Ⅲ期临床试验对于服药后发生的腹痛、腹泻特地作了全面观察，结果显示在用药第1周时腹痛发生率，试验组和对照组分别为42.54％和39.42％，此后每周随访的发生率逐次下降，第4周时腹痛发生率，试验组和对照组分别为15.64％和13.73％。腹痛程度分析显示，试验组腹痛轻微和明显的比例分别为94.92％和5.08％。对照组腹痛轻微和明显的比例分别为95.06％和4.94％，两组均没有出现腹痛难以忍受的病例。大便性状分析显示，试验组出现稀便和水样便的比例分别为96.98％和3.02％。对照组出现稀便和水样便的比例分别为96.59％和3.41％。每日腹泻次数和平均持续时间分析显示，试验组和对照组平均每日腹泻的均值为2.61和2.37次，平均持续时间的均值为3.81和3.50天。以上试验组的腹痛发生率、每日腹泻次数和平均持续时间都略高于对照组，但差异均无统计学意义(P>0.05)。 

除腹痛腹泻以外，试验组共出现4例4件其他不良事件，其中有2例2件与药物相关，表现为轻度皮疹1例和中度头昏头痛1例，经观察或停药观察后症状均消失，对照组未出现其他不良事件。两组其他不良事件发生率差异无统计学意义(P>0.05) 

16、结论 

本临床试验结果表明：克黄利胆胶囊，每次2粒，每日3次口服，治疗乙型黄疸型肝炎-肝胆湿热证，有明显退黄，降低血清胆红素，改善肝功能的作用，虽有少数患者服药后出现轻度腹痛、腹泻，但症状轻微，基本上不影响药物治疗。与已经上市的对照药苦黄颗粒相比，其退黄疗效略高，安全性相近，值得临床推广使用。 

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。 

实施例1 

发明的大黄总蒽醌胶囊的制备方法如下： 

1)大黄总蒽醌，微晶纤维素，混合均匀； 

2)将聚维酮用95％(v/v)的乙醇溶解，制备成含有10％的聚维酮溶液(10份重量的聚维酮溶解到95％的乙醇中得到100份体积的聚维酮乙醇溶液)； 

3)将10％的聚维酮溶液加入上述混合物中搅拌均匀，制软材，过18目筛制颗粒，干燥，颗粒干燥后加入硬脂酸镁混匀，装1000粒胶囊。 

实施例2 

配方为 

制备方法如下： 

1)大黄总蒽醌，微晶纤维素，混合均匀； 

2)将聚维酮用95％(v/v)的乙醇溶解，制备成含有10％的聚维酮溶液(10份重量的聚维酮溶解到95％的乙醇中得到100份体积的聚维酮乙醇溶液)； 

3)将10％的聚维酮溶液加入上述混合物中搅拌均匀，制软材，过18目筛制颗粒，干燥，颗粒干燥后加入硬脂酸镁混匀，压1000片。 

实施例3 

配方为 

制备方法如下： 

1)大黄总蒽醌，微晶纤维素，混合均匀； 

2)将聚维酮用95％(v/v)的乙醇溶解，制备成含有10％的聚维酮溶液(10份重量的聚维酮溶解到95％的乙醇中得到100份体积的聚维酮乙醇溶液)； 

3)将10％的聚维酮溶液加入上述混合物中搅拌均匀，制软材，过18目筛制颗粒，干燥，颗粒干燥后加入硬脂酸镁混匀，装1000粒胶囊。 

Claims (7)

1.大黄总蒽醌及其组合物在制备乙型病毒性肝炎的退黄治疗的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，所述应用是大黄总蒽醌具有退黄作用，降低血清胆红素的作用，改善肝功能的作用。

3.权利要求1所述的应用，其中所述大黄总蒽醌包括任何一种方法制备的大黄蒽醌物质，包括游离蒽醌、结合蒽醌、蒽酮、糖、鞣质等或它们的混合物。

4.权利要求1所述的应用，其中所述大黄总蒽醌是采用以下方法制备的大黄总蒽醌：

步骤1，

取大黄1000g，照中国药典2010年版一部附录I0流浸膏剂与浸膏剂项下的渗漉法，用乙醇作溶剂，浸渍48小时后，以每公斤药粉每分钟1～1.5ml的速度缓缓渗漉，收集初漉液5000ml备用；继续渗漉，收集续漉液10000ml减压回收乙醇至60℃相对密度0.90～0.9,，放冷，静置，滤过，得析出物I，滤液l备用；

步骤2，

取初漉液加50％乙醇稀释至含醇量75％，用10％氢氧化钠的65％乙醇溶液碱化至漉液中无没食子酸斑点，静置12小时，取上清液用盐酸调节pH值至6.0～7.0，减压回收乙醇至60℃相对密度1.00～1.02，放冷，静置，滤过，得沉淀物l和滤液2，

步骤3，

滤液2与滤液l合并，减压浓缩至80℃相对密度1.40～1.45，加6倍稠膏重量的乙醇回流2次，每次0.5小时，滤过，滤液用10％氢氧化钠的65％乙醇溶液碱化至溶液中无没食子酸斑点，静置12小时，滤过，滤液调节pH值至6.0～7.0，减压回收乙醇，浓缩至80℃相对密度为1.45～1.48，并与上述沉淀物1合并，称定重量，加入10倍量0.5％氢氧化钠水溶液溶解，浓盐酸调节pH值至6.0～7.0，加入0.2倍合并物重量的明胶，加热，浓缩至80℃相对密度为1.40～1.45，趁热缓缓加入4倍量乙醇，加热搅拌至明胶析出，滤过，收集沉淀和滤液，沉淀加入适量沸水，加热使溶解，使80℃相对密度为1.40～1.45，趁热缓缓加入4倍量乙醇，加热搅拌至明胶析出，滤过，收集沉淀和滤液，沉淀再重复操作1次，合并3次滤液，减压回收乙醇至60℃相对密度0.95～0.97，放冷，滤过，收集析出物II和滤液3，

步骤4，

滤液3检查鞣质至阴性，加4倍量乙醇沉淀除尽残留明胶，滤过，回收乙醇，蒸干，85℃，0.07MPa减压干燥，粉碎，加6倍干固物重量乙醇回流2次，每次0.5小时，合并乙醇液，减压回收乙醇，得残留物，

步骤5，

残留物与析出物I、析出物II合并，混匀，65℃以下减压干燥，即得。

5.权利要求4所述的应用，其中所述大黄总蒽醌含总蒽醌以大黄素计，为50％-60％，含游离蒽醌以大黄素计，为48％-58％，按干燥品计算，含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的总量不少于50％，按干燥品计算，含游离芦荟大黄素、游离大黄酸、游离大黄素、游离大黄酚、游离大黄素甲醚的总量不少于40％，

其【性状】为褐黄色粉末，气微，味微苦，

其【鉴别】方法如下：取本发明的大黄总蒽醌0.1g，加三氯甲烷4Oml超声处理lO分钟，滤过，滤液作为供试品溶液，另取芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、大黄素、大黄酸对照品，加甲醇溶解，分别制成每1ml含0.2mg、0.1mg，0.1mg,0.1mg,0.2mg的溶液作为对照溶液，照薄层层析法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种供试品和对照品溶液各5～10μl分别点于同一以羧甲基纤维素纳为黏合剂的硅胶H薄层板上(新活化)，以石油醚(30～60℃)一甲酸乙酯一甲酸(15:5:1)10℃以下放置的上层溶液为展开剂，在25℃以下展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，

其【检查】方法如下：

没食子酸的检查：取本发明的大黄总蒽醌细粉25mg，置5ml量瓶中，加甲醇4～5ml超声处理30分钟使溶解，冷却，加甲醇稀释至刻度，滤过，取续滤液，作为供试品溶液，另取没食子酸对照品，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各5μl分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯—乙酸乙酯—甲酸(5:4:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铁乙醇溶液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，出现的斑点颜色应不得深于对照品斑点的颜色，土大黄苷的检查：取本发明的大黄总蒽醌0.2g，加甲醇2ml，温浸10分钟，放冷，取上清液10ul点于滤纸上，以45％乙醇展开，取出，晾干，放置10分钟，置紫外光灯(365nm)下检视，不得显持久的亮紫色荧光，

其【含量测定】方法如下：

(1)、总蒽醌

对照品溶液的制备

取大黄素对照品约10mg，精密称定，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得，

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml、1.2ml、1.6ml置l0ml具塞试管中，蒸发至干，残渣分别精密加入0.8％醋酸镁甲醇溶液l0ml使溶解，摇匀，以第一份为空白，照紫外一可见分光光度法(中国药典2010年版一部附录VA)，在510nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，

测定法：取本品约40mg，精密称定，置100ml园底烧瓶中，加8％盐酸溶液20ml，再加三氯甲烷20mL置沸水浴中加热回流1小时，冷却，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器至无色，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次(20ml、15ml、10ml)，合并三氯甲烷提取液置100ml量瓶中，加三氯甲烷稀释至刻度，摇匀，精密量取0.4ml置10ml具塞试管中，蒸发至干，残渣分别精密加入0.8％醋酸镁甲醇溶液l0ml使溶解，摇匀，以第一份为空白，照紫外一可见分光光度法(中国药典2010年版一部附录VA)，在510nm的波长处测定吸光度，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品中总蒽醌的量，计算，即得，

(2)、游离蒽醌

对照品溶液的制备

取大黄素对照品约10mg，精密称定，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得，

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml、1.2ml、1.6ml置lOml具塞试管中，蒸发至干，残渣分别精密加入0.8％醋酸镁甲醇溶液lOml使溶解，摇匀，以第一份为空白，照紫外一可见分光光度法(中国药典2010年版一部附录VA)，在510nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，

测定法：取本品约40ml，精密称定，置100ml锥形瓶中，加三氯甲烷约60ml超声处理(功率250W，频率25KHz)40分钟，放冷，滤过，用三氯甲烷冲洗滤器及锥形瓶，并入滤液中，滤液转移至100ml量瓶中，加三氯甲烷稀释至刻度，摇匀，精密量取0.4ml置lOml具塞试管中，蒸发至干，残渣分别精密加入0.8％醋酸镁甲醇溶液lOml使溶解，摇匀，以第一份为空白，照紫外一可见分光光度法(中国药典2010年版一部附录VA)，在510nm的波长处测定吸光度，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品中游离蒽醌的量，计算，即得，

(3)、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚总量：照高效液相色谱法(中国到典2010年版一部附录VID)测定，

色谱条件与系统适用性试验以十八炕基硅炕键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1％磷酸溶液(85:15)为流动相:检测波长为440nm，理论板数按大黄素峰计算应不低于3000，

对照品溶液的制备取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素各10μg、大黄素甲醚20μg、大黄酚50μg的混合溶液，即得，

供试品溶液的制备：取本品约15mg，精密称定，置100ml量瓶中，加入甲醇适量，超声处理(功率250W，频率25KHz)30分钟，使其溶解，取出，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液10ml(剩余滤液备用)，置烧瓶中，挥去溶剂，加8％盐酸溶液20ml再加三氯甲烷20ml加热回流2小时，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷振摇提取3次，每次10时，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解并转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得，

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl注入液相色谱仪，测定，即得，

(4)游离芦荟大黄素、游离大黄酸、游离大黄素、游离大黄酚、游离大黄素甲醚总量照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VID)测定，

照高效液相色谱法(中国到典2010年版一部附录VID)测定，

色谱条件与系统适用性试验以十八炕基硅炕键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1％磷酸溶液(85:15)为流动相:检测波长为440nm，理论板数按大黄素峰计算应不低于3000，

对照品溶液的制备取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素各10μg、大黄素甲醚20μg、大黄酚50μg的混合溶液，即得，

供试品溶液的制备：取本品约15mg，精密称定，置100ml量瓶中，加入甲醇适量，超声处理(功率250W，频率25KHz)30分钟，使其溶解，取出，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，滤液的一部分作为供试品溶液，

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl注入液相色谱仪，测定，即得。

6.权利要求1所述的应用，其中所述大黄总蒽醌组合物为大黄总蒽醌的片剂，胶囊剂。

7.权利要求6所述的应用，其中所述大黄总蒽醌胶囊剂，其配方如下：

制备方法如下：

1)大黄总蒽醌，微晶纤维素，混合均匀；

2)将聚维酮用95％(v/v)的乙醇溶解，制备成含有10％的聚维酮溶液(10份重量的聚维酮溶解到95％的乙醇中得到100份体积的聚维酮乙醇溶液)；

3)将10％的聚维酮溶液加入上述混合物中搅拌均匀，制软材，过18目筛制颗粒，干燥，颗粒干燥后加入硬脂酸镁混匀，装1000粒胶囊，或上压片机压1000片，再包衣即可。