CN104224952A - 一种各种成分比例稳定均一的大黄总蒽醌的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种各种成分比例稳定均一的大黄总蒽醌的制备方法，步骤如下：步骤1.大黄渗漉，渗漉液放冷，静置，滤过，得析出物I和滤液l；步骤2.取初漉液，加乙醇，氢氧化钠，上清液用放冷，静置，滤过，得沉淀物l和滤液2；步骤3.滤液2与滤液l合并，浓缩，加乙醇回流，滤过，滤液静置，浓缩，与上述沉淀物1合并，放冷，滤过，收集析出物II和滤液3；步骤4.滤液3，减压回收乙醇，得残留物；步骤5.残留物与析出物I、析出物II合并，即得本发明的大黄总蒽醌。

Description

一种各种成分比例稳定均一的大黄总蒽醌的制备方法

技术领域：

本发明涉及一种中药提取物，特别涉及一种以中药大黄提取的一种各种成分比例稳定均一的大黄总蒽醌的制备方法。 

背景技术：

大黄为常用中药之一，系蓼科多年生草本植物掌叶大黄、唐古特大黄或药用大黄的干燥根和根茎。 

大黄味苦，性寒，具有泻下攻击，清热泻火，凉血解毒，逐瘀通经之功效。现代化学研究证明大黄的主要化学成分为蒽醌类化合物；大黄有效成分的提取分离方法主要有：煎煮法(水提法):煎煮法为大黄有效成分的传统提取方法，由于游离蒽醌类的极性小，故用煎煮法对游离蒽醌类成分的提取效果不佳；而其结合蒽醌苷类极性较其苷元较大，故可用水提取。醇提法:由于大黄中活性成分的极性分布很广，因此就总蒽醌类的提取而言，醇提法的效率要明显高于煎煮法。目前较常用的醇提法有乙醇回流法和渗漉法。 

大黄化学成分复杂，化学结构已被阐明的至少已有136种，但其主要成分为蒽醌类化合物，总含量在2％～5％，其中游离的羟基蒽醌类化合物只占1/10～1/5，主要为大黄酚、大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚和大黄酸等，为大黄的主要抗菌成分。结合性蒽醌衍生物为游离蒽醌的葡萄糖苷(即大黄酚葡萄糖苷、大黄素葡萄糖苷、芦荟大黄素葡萄糖苷、大黄酸葡萄糖苷等)和双蒽酮苷类，系大黄的主要泻下成分，其中双蒽酮苷为:番泻苷A、B、C、D、E等。番泻苷A与番泻苷B互为异构体；番泻苷C与番泻苷D互为异构体。此外尚含有大黄素、芦荟大黄素和大黄酚的双葡萄糖苷。大黄亦含有鞣质类化合物约5％，其中有没食子酰葡萄糖、没食子酸、d-儿茶素及大黄四聚素等，为收敛止血有效成分。 

大黄及大黄总蒽醌的药物作用在许多文献中有报道，主要的作用有： 

(1)疖肿及口腔炎，(2)下腿溃疡(臁疮)，(3)肠胀气，(4)传染性湿疹样皮炎，(5)咳嗽(6)急性胃十二指肠出血，(7)慢性肾功能不全，(8)拔牙术后出血(9)烧伤，(10)急性坏死性小肠炎致肠麻痹，(11)胆道蛔虫，(12)急性黄疸型肝炎，(13)胃癌 出血，(14)急性胰腺炎，(15)乳蛾(急性化脓性扁桃体炎)，(lS)流行性腮腺炎，(17)新生儿不吃奶，(18)慢性前列腺炎，(19)鼻出血，(20)慢性便秘，(21)小儿厌食症，(22)肝性脑病，(23)脑出血急性期，(24)胆道出血，(25)脑外伤性颅内出血，(26)高脂血症，(27)慢性肾功能衰竭，(28)急性胆囊炎，(29)急性肠梗阻，(30)阑尾脓肿，(31)张力性水疱，(32)腹膜后血肿，(33)带状疱疹，(34)排卵功能失调，(35)急性淋病，(36)银屑病，(37)急性软组织损伤，(38)甲沟炎，(39)淋巴结核，(40)老年单纯性肥胖症，(41)中风便秘，(42)癃闭，(43)预治大面积烧伤并发症，(44)重型肝炎，(45)流行性出血热消化道出血。 

总之，大黄及其蒽醌提取物具有多种多样的药物作用，是近年来研究最多的中药之一。 

用大黄制备的药物已经上市多年，现有的大黄制剂有新清宁片和新清宁胶囊，其主要成分是熟大黄。具有清热解毒。活血化瘀，缓下功效。用于内结实热，喉肿，牙痛，目赤，便秘，下痢，感染性炎症，发烧等证。 

因大黄的主要活性成分为大黄总蒽醌，因此以大黄总蒽醌作为药物成分以及相应的提取分离方法多有报道，大黄总蒽醌提取自大黄的根茎，其颜色形状为棕黑色浸膏或棕色粉状结晶，是游离蒽醌、结合蒽醌、蒽酮、糖、鞣质等混合物。 

已经上市的大黄总蒽醌制剂有大黄总蒽醌胶囊，其主要成分为大黄提取物。【功能主治】用于治疗湿热型黄疸肝炎。 

大黄总蒽醌、大黄蒽醌或大黄蒽醌类衍生物的制备方法很多，如以下中国专利中的描述： 

99114211.X         一种提取大黄总游离蒽醌的方法 

00125405.7         一种从大黄中提取游离蒽醌的浸膏及制备方法 

01113574.3         从大黄中提取游离蒽醌的方法及其药用新用途 

01134161.0         大黄总蒽醌的提取纯化方法及其在治疗肾衰药品中的应用 

02114573.3         大黄属植物地上部分蒽醌类物质的提取工艺 

200610057160.5     一种超临界二氧化碳萃取大黄总蒽醌的方法 

200610001899.4     超临界酸水解提取大黄粉游离蒽醌的方法 

200610128443.4     细胞超声破碎提取大黄中的蒽醌类成分的最佳工艺 

200610067506.X     一种大黄素的合成改良方法 

200710068891.4     一种采用超临界CO2萃取高纯度大黄游离蒽醌的方法 

200810059316.2     一种萃取分离大黄总蒽醌类化合物的方法 

200810107377.1     一种从大黄提取大黄总蒽醌的方法 

200810135343.3     一种大黄总游离蒽醌提取物的制备方法 

200910272509.0     从大黄根茎中提取高纯大黄酚的方法 

200910307312.6     大黄结合型蒽醌与大黄鞣质的分离方法 

200910272508.6     一种高纯度大黄素的分离方法 

200910157905.9     一种大黄提取物及其制备和应用 

201110086108.3     一种超声提取大黄蒽醌类成分的方法 

201110112289.2     一种大黄蒽醌类成分的提取和分离方法 

201310292063.4     一种大黄药材自身酶解法游离大黄蒽醌类的方法 

201110112290.5     超临界流体提取中药大黄中的大黄总蒽醌的方法 

201310191913.1     一种大黄提取物及其应用 

201310110849.X     一种用共结晶分离大黄素的方法 

201310243667.X     一种从新鲜大黄中提取总蒽醌的方法 

但是，现有大黄总蒽醌的制备中，技术方案比较复杂，价格昂贵，副产品多，回收率低，纯度不高，难以实现工业化和供药物申报使用，本发明对大黄总蒽醌进行了研究，提供一种大黄总蒽醌的制备及纯化方法，用该方法得到一种各种成分比例稳定均一的大黄总蒽醌，其中的各组分相互协同，共同起作用，疗效优异，取得了令人满意的效果。 

发明内容：

本发明提供一种大黄总蒽醌的制备方法，本发明所述大黄总蒽醌包括游离蒽醌、结合蒽醌、蒽酮、糖、鞣质等或它们的混合物。本发明的制备方法包括以下步骤： 

步骤1， 

取大黄1000g，照中国药典2010年版一部附录I0流浸膏剂与浸膏剂项下的渗漉法，用乙醇作溶剂，浸渍48小时后，以每公斤药粉每分钟1～1.5ml的速度缓缓渗漉，收集初漉液5000ml备用；继续渗漉，收集续漉液10000ml减压回收乙醇至60℃相对密度0.90～0.9,，放冷，静置，滤过，得析出物I，滤液l备用； 

步骤2， 

取初漉液加50％乙醇稀释至含醇量75％，用10％氢氧化钠的65％乙醇溶液碱化至漉液中无没食子酸斑点，静置12小时，取上清液用盐酸调节pH值至6.0～7.0，减压回收乙醇至60℃相对密度1.00～1.02，放冷，静置，滤过，得沉淀物l和滤液2， 

步骤3， 

滤液2与滤液l合并，减压浓缩至80℃相对密度1.40～1.45，加6倍稠膏重量的乙醇回流2次，每次0.5小时，滤过，滤液用10％氢氧化钠的65％乙醇溶液碱化至溶液中无没食子酸斑点，静置12小时，滤过，滤液调节pH值至6.0～7.0，减压回收乙醇，浓缩至80℃相对密度为1.45～1.48，并与上述沉淀物1合并，称定重量，加入10倍量0.5％氢氧化钠水溶液溶解，浓盐酸调节pH值至6.0～7.0，加入0.2倍合并物重量的明胶，加热，浓缩至80℃相对密度为1.40～1.45，趁热缓缓加入4倍量乙醇，加热搅拌至明胶析出，滤过，收集沉淀和滤液，沉淀加入适量沸水，加热使溶解，使80℃相对密度为1.40～1.45，趁热缓缓加入4倍量乙醇，加热搅拌至明胶析出，滤过，收集沉淀和滤液，沉淀再重复操作1次，合并3次滤液，减压回收乙醇至60℃相对密度0.95～0.97，放冷，滤过，收集析出物II和滤液3， 

步骤4， 

滤液3检查鞣质至阴性，加4倍量乙醇沉淀除尽残留明胶，滤过，回收乙醇，蒸干，85℃，0.07MPa减压干燥，粉碎，加6倍干固物重量乙醇回流2次，每次0.5小时，合并乙醇液，减压回收乙醇，得残留物， 

步骤5， 

残留物与析出物I、析出物II合并，混匀，65℃以下减压干燥，即得本发明的大黄总蒽醌。 

本发明方法得到的大黄总蒽醌，其检测方法如下： 

其【性状】为褐黄色粉末，气微，味微苦。 

其【鉴别】方法如下：取本发明的大黄总蒽醌0.1g，加三氯甲烷4Oml超声处理lO分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。另取芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、大黄素、大黄酸对照品，加甲醇溶解，分别制成每1ml含0.2mg、0.1mg，0.1mg,0.1mg,0.2mg的溶液作为对照溶液，照薄层层析法(中国药典2010年版一 部附录VIB)试验，吸取上述两种供试品和对照品溶液各5～10μl分别点于同一以羧甲基纤维素纳为黏合剂的硅胶H薄层板上(新活化)，以石油醚(30～60℃)一甲酸乙酯一甲酸(15:5:1)10℃以下放置的上层溶液为展开剂，在25℃以下展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。 

其【检查】方法如下： 

没食子酸的检查：取本发明的大黄总蒽醌细粉25mg，置5ml量瓶中，加甲醇4～5ml超声处理30分钟使溶解，冷却，加甲醇稀释至刻度，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。另取没食子酸对照品，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各5μl分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯—乙酸乙酯—甲酸(5:4:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铁乙醇溶液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，出现的斑点颜色应不得深于对照品斑点的颜色。 

土大黄苷的检查：取本发明的大黄总蒽醌0.2g，加甲醇2ml，温浸10分钟，放冷，取上清液10ul点于滤纸上，以45％乙醇展开，取出，晾干，放置10分钟，置紫外光灯(365nm)下检视，不得显持久的亮紫色荧光。 

其【含量测定】方法如下： 

(1)、总蒽醌 

对照品溶液的制备 

取大黄素对照品约10mg，精密称定，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。 

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml、1.2ml、1.6ml置l0ml具塞试管中，蒸发至干，残渣分别精密加入0.8％醋酸镁甲醇溶液l0ml使溶解，摇匀，以第一份为空白，照紫外一可见分光光度法(中国药典2010年版一部附录VA)，在510nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。 

测定法：取本品约40mg，精密称定，置100ml园底烧瓶中，加8％盐酸溶液20ml，再加三氯甲烷20mL置沸水浴中加热回流1小时，冷却，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器至无色，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲 烷提取3次(20ml、15ml、10ml)，合并三氯甲烷提取液置100ml量瓶中，加三氯甲烷稀释至刻度，摇匀。精密量取0.4ml置10ml具塞试管中，蒸发至干，残渣分别精密加入0.8％醋酸镁甲醇溶液l0ml使溶解，摇匀，以第一份为空白，照紫外一可见分光光度法(中国药典2010年版一部附录VA)，在510nm的波长处测定吸光度，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品中总蒽醌的量，计算，即得。 

本品按干燥品计算，含总蒽醌以大黄素(C_l5H_LoO₅计，应为50％-60％)。 

(2)、游离蒽醌 

对照品溶液的制备 

取大黄素对照品约10mg，精密称定，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。 

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml、1.2ml、1.6ml置lOml具塞试管中，蒸发至干，残渣分别精密加入0.8％醋酸镁甲醇溶液lOml使溶解，摇匀，以第一份为空白，照紫外一可见分光光度法(中国药典2010年版一部附录VA)，在510nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。 

测定法：取本品约40ml，精密称定，置100ml锥形瓶中，加三氯甲烷约60ml超声处理(功率250W，频率25KHz)40分钟，放冷，滤过，用三氯甲烷冲洗滤器及锥形瓶，并入滤液中，滤液转移至100ml量瓶中，加三氯甲烷稀释至刻度，摇匀。精密量取0.4ml置lOml具塞试管中，蒸发至干，残渣分别精密加入0.8％醋酸镁甲醇溶液lOml使溶解，摇匀，以第一份为空白，照紫外一可见分光光度法(中国药典2010年版一部附录VA)，在510nm的波长处测定吸光度，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品中游离蒽醌的量，计算，即得。 

本品按干燥品计算，含游离蒽醌以大黄素(C_l5H_LoO₅)计，应为48％-58％。 

(3)、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚总量：照高效液相色谱法(中国到典2010年版一部附录VID)测定。 

色谱条件与系统适用性试验以十八炕基硅炕键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1％磷酸溶液(85:15)为流动相:检测波长为440nm。理论板数按大黄素峰计算应不低于3000。 

对照品溶液的制备取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素各10μg、大黄素甲醚20μg、大黄酚50μg的混合溶液，即得。 

供试品溶液的制备：取本品约15mg，精密称定，置100ml量瓶中，加入甲醇适量，超声处理(功率250W，频率25KHz)30分钟，使其溶解，取出，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液10ml(剩余滤液备用)，置烧瓶中，挥去溶剂，加8％盐酸溶液20ml再加三氯甲烷20ml加热回流2小时，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷振摇提取3次，每次10时，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解并转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。 

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl注入液相色谱仪，测定，即得。 

本品按干燥品计算，含芦荟大黄素(C₁₅H₃₀O₅)、大黄酸(C₁₅H₈O₆)、大黄素(C₁₅H_lOO₅)、大黄酚(C₁₅H_lOO₄)、大黄素甲醚(C₁₆H₁₂O₅)的总量不得少于50％。 

(4)游离芦荟大黄素、游离大黄酸、游离大黄素、游离大黄酚、游离大黄素甲醚总量照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VID)测定。 

照高效液相色谱法(中国到典2010年版一部附录VID)测定。 

色谱条件与系统适用性试验以十八炕基硅炕键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1％磷酸溶液(85:15)为流动相:检测波长为440nm。理论板数按大黄素峰计算应不低于3000。 

对照品溶液的制备取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素各10μg、大黄素甲醚20μg、大黄酚50μg的混合溶液，即得。 

供试品溶液的制备：取本品约15mg，精密称定，置100ml量瓶中，加入甲醇适量，超声处理(功率250W，频率25KHz)30分钟，使其溶解，取出，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，滤液的一部分作为供试品溶液。 

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl注入液相色谱仪，测定，即得。 

本品按干燥品计算，含游离芦荟大黄素(C₁₅H₃₀O₅)、游离大黄酸(C₁₅H₈O₆)、游离大黄素(C₁₅H_lOO₅)、游离大黄酚(C₁₅H_lOO₄)、游离大黄素甲醚(C₁₆H₁₂O₅)的总量不得少于40％。 

用本发明的大黄总蒽醌作为药物活性成分可以制备成口服的药物制剂，如胶囊，片剂等，所述药物制剂可以由以下重量比例的组分制备而成： 

大黄总蒽醌20-50g，微晶纤维素40-60g，氢氧化铝干凝胶20-30g,碳酸氢钠8-12g,聚维酮1-3g,硬脂酸镁1-3g。所述药物制剂优选胶囊剂。 

本发明人在研究大黄总蒽醌制剂的过程中，发现现有胶囊剂虽然加入了淀粉作为填充剂，但无法满足长期存放的要求，为此发明人进行了配方筛选，以期获得一种稳定性好，储存期长的配方。 

另一方面，本发明人发现大黄总蒽醌在服用过程中常有口苦感，并有胃肠道不适感，因此也需要调整配方以改善患者的适应性。 

在配方筛选过程中，发明人意外的发现，在配方中加入部分氢氧化铝干凝胶和碳酸氢钠可以延长药物的储存期限，同时改善口苦感和胃肠道不适。在处方筛选过程中意外的发现加入少量碳酸氢钠可以起到稳定化的作用，同时口感和胃肠道刺激问题得到解决。 

另外，本发明人还对本发明的胶囊剂进行了含量测定方法的研究，含量测定方法如下： 

(1)、总蒽醌 

对照品溶液的制备 

取大黄素对照品约10mg，精密称定，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。 

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml、1.2ml、1.6ml置lOml具塞试管中，蒸发至干，残渣分别精密加入0.8％醋酸镁甲醇溶液l0ml使溶解，摇匀，以第一份为空白，照紫外一可见分光光度法(中国药典2010年版一部附录VA)，在510nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。 

测定法：取装量差异项下本品内容物粉末约0.2g，精密称定，置100ml园底烧瓶中，加8％盐酸溶液20ml，再加三氯甲烷20mL置沸水浴中加热回流1小时， 冷却，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器至无色，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次(20ml、15ml、10ml)，合并三氯甲烷提取液置100ml量瓶中，加三氯甲烷稀释至刻度，摇匀。精密量取0.4ml置10ml具塞试管中，蒸发至干，残渣分别精密加入0.8％醋酸镁甲醇溶液l0ml使溶解，摇匀，以第一份为空白，照紫外一可见分光光度法(中国药典2010年版一部附录VA)，在510nm的波长处测定吸光度，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品中总蒽醌的量，计算，即得。 

(2)、游离蒽醌 

对照品溶液的制备 

取大黄素对照品约10mg，精密称定，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。 

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml、1.2ml、1.6ml置l0ml具塞试管中，蒸发至干，残渣分别精密加入0.8％醋酸镁甲醇溶液l0ml使溶解，摇匀，以第一份为空白，照紫外一可见分光光度法(中国药典2010年版一部附录VA)，在510nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。 

测定法：取装量差异项下本品内容物粉末约0.2g，精密称定，置100ml锥形瓶中，加三氯甲烷约60mL超声处理(功率250W，频率25KHz)40分钟，放冷，滤过，用三氯甲烷冲洗滤器及锥形瓶，并入滤液中，滤液转移至100ml量瓶中，加三氯甲烷稀释至刻度，摇匀。精密量取0.4ml置l0ml具塞试管中，蒸发至干，残渣分别精密加入0.8％醋酸镁甲醇溶液lOml使溶解，摇匀，以第一份为空白，照紫外一可见分光光度法(中国药典2010年版一部附录VA)，在510nm的波长处测定吸光度，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品中游离蒽醌的量，计算，即得。 

(3)、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚总量：照高效液相色谱法(中国到典2010年版一部附录VID)测定。 

色谱条件与系统适用性试验以十八炕基硅炕键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1％磷酸溶液(85:15)为流动相:检测波长为440nm。理论板数按大黄素峰计算应不低于3000。 

对照品溶液的制备取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素各10μg、大黄素甲醚20μg、大黄酚50μg的混合溶液，即得。 

供试品溶液的制备：取装量差异项下本品内容物粉末约75mg，精密称定，置100ml量瓶中，加入甲醇适量，超声处理(功率250W，频率25KHz)30分钟，使其溶解，取出，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液10ml(剩余滤液备用)，置烧瓶中，挥去溶剂，加8％盐酸溶液20ml再加三氯甲烷20ml加热回流2小时，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷振摇提取3次，每次10时，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解并转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。 

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl注入液相色谱仪，测定，即得。 

(4)游离芦荟大黄素、游离大黄酸、游离大黄素、游离大黄酚、游离大黄素甲醚总量照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VID)测定。 

色谱条件与系统适用性试验以十八炕基硅炕键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1％磷酸溶液(85:15)为流动相:检测波长为440nm。理论板数按大黄素峰计算应不低于3000。 

对照品溶液的制备取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素各10μg、大黄素甲醚20μg、大黄酚50μg的混合溶液，即得。 

供试品溶液的制备：取装量差异项下本品内容物粉末约75mg，精密称定，置100ml量瓶中，加入甲醇适量，超声处理(功率250W，频率25KHz)30分钟，使其溶解，取出，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，滤液的一部分作为供试品溶液。 

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl注入液相色谱仪，测定，即得。 

本发明的大黄总蒽醌的制备方法，其优点为：产品的有效成分含量高，产品收率高，工艺简单，所用物料价格低廉，适合工业化生产，质量易于控制，和现有技 术相比，生产成本低，产品收率高，操作简单。 

本发明的大黄总蒽醌，其中， 

含总蒽醌以大黄素计，为50％-60％。 

含游离蒽醌以大黄素计，为48％-58％。 

按干燥品计算，含芦荟大黄素(C₁₅H₃₀O₅)、大黄酸(C₁₅H₈O₆)、大黄素(C₁₅H_lOO₅)、大黄酚(C₁₅H_lOO₄)、大黄素甲醚(C₁₆H₁₂O₅)的总量不少于50％。 

按干燥品计算，含游离芦荟大黄素(C₁₅H₃₀O₅)、游离大黄酸(C₁₅H₈O₆)、游离大黄素(C₁₅H_lOO₅)、游离大黄酚(C₁₅H_lOO₄)、游离大黄素甲醚(C₁₆H₁₂O₅)的总量不少于40％。 

以下通过实验数据说明本发明的大黄总蒽醌的有益效果。 

以下通过实验数据说明本发明的新用途。 

一、大黄总蒽醌对小鼠四氯化碳急性肝损伤的治疗作用 

取昆明种小鼠90只，Ⅱ级，雄性、体重21～23g，随机分成6组，每组15只，分别是：正常对照组、模型对照组、联苯双酯200mg/kg剂量组、大黄总蒽醌22.5mg/kg、45mg/kg和90mg/kg剂量组。实验前称体重，在实验的第一天的上午，除正常对照组外，其他各组动物均腹腔注射0.1％CCL₄橄榄油10ml/kg，造成急性肝损伤模型，尔后口服给药，每天一次，连续15天，正常和模型对照组给等量生理盐水。第15天下午，再重复腹腔注射0.1％CCL₄橄榄油10ml/kg一次。18小时后，小鼠称重，摘眼球采血，测血清ALT、AST，剖腹取肝脏，肉眼观察并称湿重，并用10％福尔马林液固定，HE染色，病理切片镜检，正常对照组动物不给任何药物，结果进行组间t测验。 

结果： 

1、大黄总蒽醌对CCL₄致小鼠肝损伤的血清ALT和AST的影响 

大黄总蒽醌22.5mg/kg、45mg/kg和90mg/kg三个剂量组及联苯双酯200mg/kg阳性药组动物的血清ALT平均值，与模型组动物比较差异均有非常显著的意义(P＜0.01)，均能非常显著的降低四氯化碳致动物肝损伤引起的ALT平均值升高。 

大黄总蒽醌45mg/kg和90mg/kg剂量组与阳性药组动物的血清AST平均值， 与模型组动物比较，差异均有非常显著的意义(P＜0.01)，能显著的降低四氯化碳致动物肝损伤引起的AST平均值升高作用。大黄总蒽醌22.5mg/kg剂量组亦有明显的降低作用(P＜0.05)，见表1。 

表1大黄总蒽醌对四氯化碳致小鼠肝损伤血清ALT与AST的影响

与模型组比较*P＜0.05.**P＜0.01. 

2、病理学检查： 

小鼠肝脏病理切片镜检显示：正常对照组小鼠多数肝脏切片镜检未见异常，少数可见轻度炎症细胞浸润和气球样变。而模型组肝脏损伤严重，可见严重灶状坏死和炎症反应，有嗜酸性小体形成，少数出现大块坏死。而大黄总蒽醌三个剂量组和联苯双酯阳性药组小鼠肝脏病理变明显减轻，并纤维组织修复。见表2 

表2大黄总蒽醌对四氯化碳所致小鼠肝脏病理改变镜检结果 

二、大黄总蒽醌对D-Glan致大鼠急性肝损伤的影响 

取Wistar大鼠60只，Ⅱ级(清洁级)，雄性，体重：180～200g，随机分成6组，每组10只，分别为：正常对照组，模型组，大黄总蒽醌7.5mg/kg，15mg/kg和30mg/kg剂量组，联苯双酯60mg/kg剂量组，每天灌胃给药一次，连续15天，除正常组外，其他各组动物在末次给药2小时后，腹腔注射10％D-Glan橄榄油液800mg/kg，48小时后，眼眶采血测ALT、AST，并取各鼠同一叶肝脏做病理切片镜检，结果t测验。 

结果： 

1、大黄总蒽醌对D-Glan所致大鼠急性肝损伤血清ALT、AST的影响 

大黄总蒽醌7.5mg/kg剂量组动物的血清ALT值与模型组比较，有明显的降低，差异有显著性的意义(P＜0.05)；而15mg/kg和30mg/kg剂量组及联苯双酯60mg/kg剂量组动物，与模型组动物ALT值比较有非常明显的降低，差异有非常显著性意义(P＜0.01)，能非常显著的对抗D-Glan对大鼠所致的肝损伤。大黄总蒽醌7.5mg/kg剂量组动物的AST值，与模型组比较，无明显差异(P＞0.05)；而15mg/kg剂量组动物的AST值与模型组比较，则有明显的差异(P＜0.05)；大黄总蒽醌30mg/kg剂量组与联苯双酯60mg/kg剂量组动物的AST平均值与模型组比较均有非常显著的差异(P值均＜0.01)，均能非常显著的降低D-Glan致大鼠急性肝损伤引起的血清AST的升高，见表3 

表3大黄总蒽醌对D-Glan致大鼠肝损伤血清ALT和AST的影响

与模型组比较*P＜0.05.**P＜0.01. 

2、病理学检查： 

大鼠肝脏病理切片镜检显示：正常对照组大鼠肝脏切片镜检未见异常，偶见轻度炎症细胞。模型组肝脏损伤严重，镜检见肝细胞拥挤，胞浆疏松，嗜酸性小体和气球样细胞易见。肝细胞核大小不一，核膜增厚，核质聚集，小叶内散在着肝细胞的点状坏死灶，灶内和肝窦内有较多单核细胞，分叶核白血球，淋巴球等。枯否氏细胞增多并肥大。而大黄总蒽醌和联苯双酯给药组动物的肝脏病变明显减轻，并有纤维组织修复。见表4 

表4大黄总蒽醌对D-Glan所致大鼠肝脏病理改变镜检结果 

三、大黄总蒽醌对大鼠实验性黄疸的影响 

取Wistar大鼠60只，雄性，Ⅱ级、体重200±10g，随机分成6组，每组10只，分别为：正常对照组、模型对照组、大黄总蒽醌7.5mg/kg、15mg/kg和30mg/kg 剂量组、联苯双酯60mg/kg剂量组。每天灌胃给药一次，连续15天，正常组与模型组给等量生理盐水。在实验的第13天，除正常组外，其他各组动物，灌胃2.5％ANIT橄榄油液70mg/kg造型(继续灌胃给药)，48小时后，断头取血，测血清总胆红素、直接胆红素、ALT、AST，肝脏作病理切片检查，结果t测验。 

结果 

1、大黄总蒽醌对血清总胆红素和直接胆红素的影响 

大黄总蒽醌7.5mg/kg剂量组动物的血清总胆红素平均值与模型组比较有明显的降低作用，差异有显著的意义(P＜0.05)，大黄总蒽醌15mg/kg和30mg/kg剂量组动物的血清总胆红素值与模型组比较有非常明显的下降，差异有非常显著的意义(P＜0.01)，联苯双酯60mg/kg剂量组与模型组比较亦有明显的差异(P＜0.05)。 

大黄总蒽醌7.5mg/kg剂量组动物的血清直接胆红素值与模型组动物比较无明显的差异(P＞0.05)；15mg/kg和30mg/kg剂量组动物的血清直接胆红素值与模型组比较有非常明显的下降，差异有非常显著的意义(P＜0.01)，联苯双酯阳性对照组与模型组比较亦有明显差异(P＜0.05)。见表5。 

表5大黄总蒽醌对ANIT致大鼠实验性黄疸血清总胆红素和直接胆红素的影响(x±SD) 

与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01 

2、大黄总蒽醌对血清ALT、AST的影响 

大黄总蒽醌7.5mg/kg剂量组动物的血清ALT平均值与模型组比较，有明显的差异(P＜0.05)，而15mg/kg和30mg/kg剂量组及联苯双酯60mg/kg剂量组动物的血清ALT平均值与模型组比较有非常显著的差异(P＜0.01)。 

大黄总蒽醌15mg/kg剂量组动物的血清AST平均值与模型组比较有明显的差异(P＜0.05)，30mg/kg剂量组和联苯双酯组动物的血清AST平均值与模型组动物比较有非常显著的差异(P＜0.01)。而大黄总蒽醌7.5mg/kg剂量组动物的血清AST值与模型组比较无明显差异(P＞0.05)。见表6。 

表6大黄总蒽醌对ANIT致大鼠实验性黄疸血清ALT、AST的影响

与模型组比较，*P＜0.05.**P＜0.01 

3、病理学检查 

病理镜检结果显示，正常组大鼠肝脏切片镜检未见异常；模型组肝脏损伤严重，可见毛细胆管增生及小叶间胆管周围产生炎症，从而造成了胆管阻塞，形成明显的胆汁郁积，并伴随有点状坏死为主的肝实质细胞损害。而大黄总蒽醌和联苯双酯给药组能明显减轻肝脏损害，见表7。 

表7大黄总蒽醌对ANIT致大鼠肝脏病理改变镜检结果

注1：+++门脉区胆管上皮细胞坏死；++门脉区胆管上皮细胞空泡变形；+门脉区胆管上皮细胞水肿；0基本正常。 

注2：+++炎性细胞浸润严重；++炎性细胞浸润较重；+炎性细胞浸润较轻；0基本正常。 

注3：+++小叶间门脉区胆管上皮细胞严重坏死，大量碎屑进入管腔、引起明显阻塞，另外毛细胆管大量增生及小叶间胆管周围产生严重炎症，亦造成胆管严重阻塞，形成严重的胆汁郁积。++毛细胆管增生与小叶间胆管周围产生炎症，造成胆管阻塞，胆汁郁积明显；+毛细胆管增生与小叶间胆管周围炎症不严重，胆管阻塞不明显，未见胆汁郁积；0基本正常。 

注4：+++肝实质细胞损伤严重，点状坏死范围广泛；++肝实质细胞有损害，点状坏死范围不大；+肝实质细胞损害较轻，点状坏死较少见；0基本正常。 

四、大黄总蒽醌对大鼠的利胆作用 

取Wistar大鼠50只，Ⅱ级，雄性，体重：220～250，随机分成5组，每组10只，分别为：生理盐水对照组，联苯双酯阳性药对照组，大黄总蒽醌7.5mg/kg、15mg/kg和30mg/kg剂量组，实验前12小时禁食不禁水，实验时用20％乌拉坦5ml/kg腹腔注射麻醉，固定于手术台上，进行胆总管插管术，插入直径为0.6mm的聚乙烯管，待胆汁入管后，用丝线结扎，导管引出腹腔，用10ml离心管收集胆汁，手术后用止血钳夹闭腹壁，用生理盐水纱布覆盖。待稳定15～20min后，先收集1小时胆汁，然后各组大鼠分别由十二指肠注入不同剂量的药物，生理盐水组给等容量的生理盐水，各组给药体积均为1ml/100g，每小时补充5％葡萄糖盐水5ml/kg一次。分别收集给药后不同时间的胆汁分泌量，并测定给药前后胆 汁中的总胆红素和总胆固醇含量，结果t测验。 

结果： 

1、大黄总蒽醌对大鼠胆汁分泌量的影响 

大黄总蒽醌给药后，胆汁分泌量均有不同程度的增加，以给药后1小时胆汁分泌增加最为明显。大黄总蒽醌7.5mg/kg剂量组分泌增加率10％，15mg/kg剂量组为30.5％，30mg/kg剂量组为48.87％，而联苯双酯剂量组的胆汁分泌增加率仅为3.74％，表明其利胆作用不明显。 

由表8可见，大黄总蒽醌30mg/kg和15mg/kg剂量组给药后胆汁分泌量都有非常显著的增加(P＜0.01)，30mg/kg剂量组持续时间在3h以上，15mg/kg剂量组持续时间在2h以上，7.5mg/kg剂量组给药后胆汁分泌量虽有增加，但与生理盐水组比较无明显差异(P＞0.05)。见表8 

表8大黄总蒽醌对大鼠胆汁分泌量的影响

说明： 

②括号内数字为胆汁增加率。 

2、大黄总蒽醌对大鼠胆汁中总胆红素、总胆固醇含量的影响 

由表9可见，大黄总蒽醌30mg/kg和15mg/kg剂量组动物，给药后胆汁中胆红素的含量都有非常显著的增加(P＜0.01)，7.5mg/kg剂量组动物胆汁中胆红素含量也有显著地增加(P＜0.05)，但大黄总蒽醌各剂量组对动物胆汁中的总胆固醇含量无明显影响(P值均＞0.05)。见表9。 

表9大黄总蒽醌对大鼠胆汁中总胆红素、总胆固醇含量的影响

与生理盐水组比较：*P＜0.05.**P＜0.01 

五、大黄总蒽醌对大鼠实验性慢性肝损伤的保护作用 

取6周龄SD大鼠120只，Ⅱ级，雄性，体重160±5g，随机分成6组，每组20只，分别是：正常对照组、模型对照组、联苯双酯60mg/kg剂量组、大黄总蒽醌7.5mg/kg、15mg/kg和30mg/kg剂量组。除正常组外，其余各组动物均于皮下注射10％CCL₄橄榄油液5ml/kg，每周2次，连续3个月，造成实验性慢性肝损伤模型。从造型的第二个月起，开始给动物灌胃给药，每日一次，连续2个月，正常组及模型组给生理盐水。每周称体重1次，以调整给药剂量及造型用CCL₄剂量。末次给药24小时后，大鼠称重、摘眼球采血，测ALT、AST、总蛋白、白蛋白，剖腹取肝脏，肉眼观察并称湿重。左肝用10％福尔马林液固定、H·E与V·G染色，病理切片镜检，记录肝纤维增生程度；右肝测定羟脯氨酸及胶原 蛋白含量。结果t测验。 

结果： 

1、大黄总蒽醌对慢性肝损伤大鼠血清ALT、AST的影响 

大黄总蒽醌15mg/kg剂量组与联苯双酯组动物的血清ALT平均值与模型组比较，均有显著的差异(P＜0.05)，大黄总蒽醌30mg/kg剂量组动物的血清ALT值与模型组比较有非常显著的差异(P＜0.01)，而7.5mg/kg剂量组动物的ALT值与模型组比较无明显差异(P＞0.05)。 

大黄总蒽醌30mg/kg剂量组动物的血清AST值与模型组比较亦有非常明显的下降，差异有非常显著的意义(P＜0.01)，见表10。 

表10大黄总蒽醌对大鼠慢性肝损伤血清ALT、AST的影响

与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01 

2、大黄总蒽醌对慢性肝损伤大鼠总蛋白、白蛋白及白蛋白/球蛋白比例的影响 

大黄总蒽醌30mg/kg计量组和联苯双酯组动物的总蛋白，白蛋白及白蛋白/球蛋白的比值与模型组动物比较，均有非常显著的升高，大黄总蒽醌15mg/kg、7.5mg/kg剂量组作用稍弱。见表11。 

表11大黄总蒽醌对大鼠慢性肝损伤总蛋白、白蛋白及总蛋白/白蛋白比例的影响

与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01 

3、大黄总蒽醌对慢性肝损伤大鼠肝羟脯氨酸及胶原蛋白含量的影响 

大黄总蒽醌和联苯双酯组动物的肝内羟脯氨酸和胶原蛋白的含量与模型组比较均有非常明显的下降，差异有非常显著的意义(P值均＜0.01)，见表12。表12大黄总蒽醌对慢性肝损伤大鼠肝羟脯氨酸及胶原蛋白含量的影响

与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01 

4、病理学检查 

H·E染色标本观察：正常组大鼠肝细胞未见异常；模型组肝小叶失去正常结构，肝板排列紊乱，肝细胞普遍变性，多数表现为胞质内有大量脂滴积聚(脂肪变)，少数为细胞质疏松或肿胀(水样变)，甚至如气球状(气球样变)。各例均可见到程度不等、范围不一的肝细胞坏死区，坏死区中央或周边有中性 粒细胞、淋巴细胞、单核细胞或浆细胞浸润。肝细胞再生活跃，核分裂相多见。肝窦多受压变窄、闭塞，少数代偿性扩胀，枯否氏细胞多肥大增生；门脉区有大量成纤维细胞、纤维细胞和增生的胶原纤维，伴同炎症细胞和增生的小血管，组成纤维间隔向小叶内伸展。与模型组比较，大黄总蒽醌7.5mg/kg剂量组变性、坏死的肝细胞数量略减轻。15mg/kg组变性、坏死肝细胞数量减少，部分肝细胞水样变轻，为颗粒变性。纤维组织增生和肝小叶结构的破坏明显减轻。30mg/kg组各标本中肝细胞脂肪变程度轻、脂滴小，有半数标本的部分肝细胞为颗粒变性。其肝细胞空泡变、坏死、炎症浸润及纤维组织增生、肝小叶结构破坏等均有非常明显的减轻。见表13。 

V·G染色标本观察：模型组肝内主要由胶原纤维组成的纤维间隔正在形成或已形成，其破坏界板，分割、包绕肝小叶，部分已有假小叶。各给药组胶原纤维增生均减轻。尤以大黄总蒽醌30mg/kg和联苯双酯组明显。见表13。 

表13大黄总蒽醌对慢性肝损伤大鼠肝脏病理改变的影响

注1：+++表示肝细胞内出现大空泡，弥散分布；++表示多数细胞内出现大小不等圆形空泡；+表示部分肝细胞内出现大小不等的圆形空泡，散在分布；0基本正常。 

注2：+++表示肝细胞呈点状灶性溶解坏死，弥散分布；++表示肝细胞灶性溶解坏死，分布范围较广；+表示肝细胞溶解坏死散在分布；0基本正常。 

注3：+++表示胶原纤维呈较宽的条索状分隔肝小叶，胶原纤维明显增加；++表 示胶原纤维呈细条索状分隔肝小叶，散在分布；+表示胶原纤维含量增加，但很少形成条索分隔肝小叶；0基本正常。 

注4：+++表示较多的假小叶形成；++表示有较少的假小叶形成；+表示形成的假小叶极少；0基本正常。 

六、对小鼠血清溶血素的影响 

取昆明种小鼠60只，Ⅱ级，雌雄各半，体重20.6±1.04g，随机均分6组，每组10只，分别为：正常对照组、模型组、大黄总蒽醌22.5mg/kg、45.0mg/kg和90.0mg/kg剂量组和联苯双酯200.0mg/kg剂量组。正常组腹腔注射生理盐水0.5ml/天，同时灌胃0.5ml 0.5％羧甲基纤维素钠。模型组腹腔注射醋酸氢化可的松0.5ml/天，同时灌胃0.5ml 0.5％羧甲基纤维素钠。其余各组分别腹腔注射醋酸氢化可的松0.5ml/天，同时灌胃各对应不同浓度的药物0.5ml，连续给药21天，于给药第16天腹腔注射10％绵羊红细胞0.2ml进行免疫，末次给药后小鼠摘眼球取血，分离血清，用生理盐水1：250稀释，加入0.5ml绵羊红细胞及1ml补体，37℃水浴10分钟，水浴终止反应，2000rpm离心10分钟，加都氏试剂3ml，用721型分光光度计540nm波长处测定吸收度，计算50％溶血值(HC50)。 

计算：(1)测定试验用绵羊半数溶血时的吸收度值：试验测定所用绵羊红细胞半数溶血时血红蛋白的吸收值。即取0.25ml绵羊红细胞悬液，用都氏试剂稀释至4ml。摇匀，放置10分钟，在540nm波长比色，记录吸收值即为试验中所用绵羊红细胞半数溶血时的吸收值。 

(2)计算样品的半数溶血值(HC50) 

结果：大黄总蒽醌各剂量组动物的血清溶血素与模型组比较没有明显的差异(P＞0.05)。见表14。 

表14对小鼠溶血素的影响

注：与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。 

七、对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响 

取昆明种小鼠60只，Ⅱ级，雌雄各半，体重19～21g，随机均分6组：正常对照组、模型组、大黄总蒽醌22.5mg/kg、45.0mg/kg和90.0mg/kg剂量组及联苯双酯200.0mg/kg剂量组、正常组腹腔注射生理盐水0.5ml/天，同时灌胃0.5ml 0.5％羧甲基纤维素钠。模型组腹腔注射醋酸氢化可的松0.5ml/天，同时灌胃0.5ml 0.5％羧甲基纤维素钠。其余各组分别腹腔注射醋酸氢化可的松0.5ml/天，同时灌胃各对应不同浓度的药物0.5ml，连续给药21天，末次给药后腹腔注射5％鸡红细胞悬液0.5ml，1.5小时后颈椎脱位法处死小鼠，腹腔注入生理盐水2ml，轻揉腹部，从腹腔抽取腹腔液，滴片，37℃温育30分钟，生理盐水漂洗，甲醇固定，Gimsa染色，油镜观察，计算吞噬百分率及吞噬指数。结果大黄总蒽醌个剂量组小鼠巨噬细胞吞噬率与模型组比较没有显著的差异(P＞0.05)见表15。 

表15对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响 

注：与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。 

八、对ConA诱导小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响 

取昆明种小鼠60只，Ⅱ级，雌雄各半，体重9～21g，随机均分6组：正常对照组、模型组、大黄总蒽醌22.5mg/kg、45.0mg/kg和90.0mg/kg剂量组及联苯双酯200.0mg/kg组。各组分别灌胃各对应不同浓度的药液。连续21天，给药第21天，颈椎脱位法处死小鼠，无菌条件下取脾脏，剪碎挤压过100目不锈钢筛网，1500rpm离心10分钟，弃上清液，加入适量0.83％NH₄CL溶液溶解红细胞，再用RPMI-1640洗涤2次，台盼蓝染色计数后在96孔板中每孔加入100μL浓度为5×106个/ml的脾细胞悬液(含2％小牛血清)及POUI浓度为10ug/ml的ConA，同时设不加ConA的阴性对照，每只小鼠为一样本，每一样本设3复孔，置37℃、5％CO₂条件下培养72小时，于结束前12小时每孔加入³H-TDR1.85KBq，培养结束时用多头细胞收集器收集细胞于玻璃纤维滤膜上，并依次用生理盐水、5％三氯醋酸、无水乙醇洗涤，将滤膜置60℃烘干，冷却后将滤膜(吸附样品面向上)置盛有5ml闪烁液(2，5-二苯基恶唑-PPO 4g，POPOP 0.3g，二甲苯加至1000ml)的测量杯中，测掺入的放射性强度(cpm)。结果如表16。 

表16对ConA诱导小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响 

注：与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。 

九、大黄总蒽醌对血清总胆红素和直接胆素的影响 

大黄总蒽醌7.5mg/kg剂量组动物的血清总胆红素平均值与模型组比较有明 显的降低作用，差异有显著的意义(P＜0.05)；15mg/kg和30mg/kg剂量组动物的血清总胆红素平均值与模型组比较有非常明显的下降，差异有非常显著的意义(P＜0.01)；联苯双酯60mg/kg剂量组与模型组比较无明显差异(P＞0.05)。 

大黄总蒽醌7.5mg/kg、15mg/kg剂量组动物的血清直接胆红素平均值与模型组动物比较有明显的差异(P＜0.05)；30mg/kg剂量组动物的血清直接胆红素平均值与模型组动物比较有非常明显的下降，差异有非常显著的意义(P＜0.01)，联苯双酯60mg/kg剂量组与模型组比较无明显差异(P＞0.05)。见表17。 

表17大黄总蒽醌对ANIT致大鼠阻塞性黄疸血清总胆红素直接胆红素的影响

注：与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。 

十、大黄总蒽醌对血清ALT、AST的影响 

大黄总蒽醌7.5mg/kg剂量组动物的血清ALT平均值与模型组动物比较，有明显的差异(P＜0.05)；而15mg/kg和30mg/kg剂量组及联苯双酯60mg/kg剂量组动物的血清ALT平均值与模型组动物比较有非常显著的差异(P＜0.01)。 

大黄总蒽醌15mg/kg剂量组动物的血清AST平均值与模型组动物比较，有明显的差异(P＜0.05)；大黄总蒽醌30mg/kg剂量组及联苯双酯剂量组动物的血清AST平均值与模型组动物比较均有非常显著的差异(P均值＜0.01)；而大黄总蒽醌7.5mg/kg剂量组动物的血清AST值与模型组动物比较，无明显差异(P＞0.05)。见表18。 

表18大黄总蒽醌对ANIT致大鼠阻塞性黄疸血清ALT、AST的影响

注：与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。 

3、病理学检查 

病理镜检结果显示，正常组大鼠肝脏切片镜检均未见异常；模型组肝脏损伤严重，可见毛细胆管增生及小叶间胆管周围产生炎症，从而造成了胆管阻塞，形成明显的胆汁郁积，并伴随有点状坏死为主的肝实质细胞损害。而大黄总蒽醌和联苯双脂给药组能明显减轻肝脏损害，见表19。 

表19大黄总蒽醌对ANIT致大鼠肝脏病理改变镜检结果

注1：+++门脉区胆管上皮细胞坏死；++门脉区胆管上皮细胞空泡变形；+门脉 区胆管上皮细胞水肿；0基本正常。 

注2：+++炎性细胞浸润严重；++炎性细胞浸润较重；+炎性细胞浸润较轻；0基本正常。 

注3：+++小叶间门脉区胆管上皮细胞严重坏死，大量碎屑进入管腔、引起明显阻塞，另外毛细胆管大量增生及小叶间胆管周围产生严重炎症，亦造成胆管严重阻塞，形成严重的胆汁郁积。++毛细胆管增生与小叶间胆管周围产生炎症，造成胆管阻塞，胆汁郁积明显；+毛细胆管增生与小叶间胆管周围炎症不严重，胆管阻塞不明显，未见胆汁郁积；0基本正常。 

注4：+++肝实质细胞损伤严重，点状坏死范围广泛；++肝实质细胞有损害，点状坏死范围不大；+肝实质细胞损害较轻，点状坏死较少见；0基本正常。 

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。 

实施例1 

步骤1， 

取大黄1000g，照中国药典2010年版一部附录I0流浸膏剂与浸膏剂项下的渗漉法，用乙醇作溶剂，浸渍48小时后，以每公斤药粉每分钟1～1.5ml的速度缓缓渗漉，收集初漉液5000ml备用；继续渗漉，收集续漉液10000ml减压回收乙醇至60℃相对密度0.90～0.9,，放冷，静置，滤过，得析出物I，滤液l备用； 

步骤2， 

取初漉液加50％乙醇稀释至含醇量75％，用10％氢氧化钠的65％乙醇溶液碱化至漉液中无没食子酸斑点，静置12小时，取上清液用盐酸调节pH值至6.0～7.0，减压回收乙醇至60℃相对密度1.00～1.02，放冷，静置，滤过，得沉淀物l和滤液2， 

步骤3， 

滤液2与滤液l合并，减压浓缩至80℃相对密度1.40～1.45，加6倍稠膏重量的乙醇回流2次，每次0.5小时，滤过，滤液用10％氢氧化钠的65％乙醇溶液碱化至溶液中无没食子酸斑点，静置12小时，滤过，滤液调节pH值至6.0～7.0，减压回收乙醇，浓缩至80℃相对密度为1.45～1.48，并与上述沉淀物1合并，称定重量，加入10倍量0.5％氢氧化钠水溶液溶解，浓盐酸调节pH值至6.0～7.0，加 入0.2倍合并物重量的明胶，加热，浓缩至80℃相对密度为1.40～1.45，趁热缓缓加入4倍量乙醇，加热搅拌至明胶析出，滤过，收集沉淀和滤液，沉淀加入适量沸水，加热使溶解，使80℃相对密度为1.40～1.45，趁热缓缓加入4倍量乙醇，加热搅拌至明胶析出，滤过，收集沉淀和滤液，沉淀再重复操作1次，合并3次滤液，减压回收乙醇至60℃相对密度0.95～0.97，放冷，滤过，收集析出物II和滤液3， 

步骤4， 

滤液3检查鞣质至阴性，加4倍量乙醇沉淀除尽残留明胶，滤过，回收乙醇，蒸干，85℃，0.07MPa减压干燥，粉碎，加6倍干固物重量乙醇回流2次，每次0.5小时，合并乙醇液，减压回收乙醇，得残留物， 

步骤5， 

残留物与析出物I、析出物II合并，混匀，65℃以下减压干燥，即得本发明的大黄总蒽醌。 

Claims (6)

1.一种各种成分比例稳定均一的大黄总蒽醌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，

取大黄1000g，照中国药典2010年版一部附录I0流浸膏剂与浸膏剂项下的渗漉法，用乙醇作溶剂，浸渍48小时后，以每公斤药粉每分钟1～1.5ml的速度缓缓渗漉，收集初漉液5000ml备用；继续渗漉，收集续漉液10000ml减压回收乙醇至60℃相对密度0.90～0.9,，放冷，静置，滤过，得析出物I，滤液l备用；

步骤2，

取初漉液加50％乙醇稀释至含醇量75％，用10％氢氧化钠的65％乙醇溶液碱化至漉液中无没食子酸斑点，静置12小时，取上清液用盐酸调节pH值至6.0～7.0，减压回收乙醇至60℃相对密度1.00～1.02，放冷，静置，滤过，得沉淀物l和滤液2，

步骤3，

滤液2与滤液l合并，减压浓缩至80℃相对密度1.40～1.45，加6倍稠膏重量的乙醇回流2次，每次0.5小时，滤过，滤液用10％氢氧化钠的65％乙醇溶液碱化至溶液中无没食子酸斑点，静置12小时，滤过，滤液调节pH值至6.0～7.0，减压回收乙醇，浓缩至80℃相对密度为1.45～1.48，并与上述沉淀物1合并，称定重量，加入10倍量0.5％氢氧化钠水溶液溶解，浓盐酸调节pH值至6.0～7.0，加入0.2倍合并物重量的明胶，加热，浓缩至80℃相对密度为1.40～1.45，趁热缓缓加入4倍量乙醇，加热搅拌至明胶析出，滤过，收集沉淀和滤液，沉淀加入适量沸水，加热使溶解，使80℃相对密度为1.40～1.45，趁热缓缓加入4倍量乙醇，加热搅拌至明胶析出，滤过，收集沉淀和滤液，沉淀再重复操作1次，合并3次滤液，减压回收乙醇至60℃相对密度0.95～0.97，放冷，滤过，收集析出物II和滤液3，

步骤4，

滤液3检查鞣质至阴性，加4倍量乙醇沉淀除尽残留明胶，滤过，回收乙醇，蒸干，85℃，0.07MPa减压干燥，粉碎，加6倍干固物重量乙醇回流2次，每次0.5小时，合并乙醇液，减压回收乙醇，得残留物，

步骤5，

残留物与析出物I、析出物II合并，混匀，65℃以下减压干燥，即得本发明的大黄总蒽醌。

2.根据权利要求1的方法制备的大黄总蒽醌，其特征在于，

含总蒽醌以大黄素计，为50％-60％，含游离蒽醌以大黄素计，为48％-58％，按干燥品计算，含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的总量不少于50％，按干燥品计算，含游离芦荟大黄素、游离大黄酸、游离大黄素、游离大黄酚、游离大黄素甲醚的总量不少于40％，

其【性状】为褐黄色粉末，气微，味微苦，

其【鉴别】方法如下：取本发明的大黄总蒽醌0.1g，加三氯甲烷4Oml超声处理lO分钟，滤过，滤液作为供试品溶液，另取芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、大黄素、大黄酸对照品，加甲醇溶解，分别制成每1ml含0.2mg、0.1mg，0.1mg,0.1mg,0.2mg的溶液作为对照溶液，照薄层层析法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种供试品和对照品溶液各5～10μl分别点于同一以羧甲基纤维素纳为黏合剂的硅胶H薄层板上(新活化)，以石油醚(30～60℃)一甲酸乙酯一甲酸(15:5:1)10℃以下放置的上层溶液为展开剂，在25℃以下展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，

其【检查】方法如下：

没食子酸的检查：取本发明的大黄总蒽醌细粉25mg，置5ml量瓶中，加甲醇4～5ml超声处理30分钟使溶解，冷却，加甲醇稀释至刻度，滤过，取续滤液，作为供试品溶液，另取没食子酸对照品，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各5μl分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯—乙酸乙酯—甲酸(5:4:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铁乙醇溶液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，出现的斑点颜色应不得深于对照品斑点的颜色，

土大黄苷的检查：取本发明的大黄总蒽醌0.2g，加甲醇2ml，温浸10分钟，放冷，取上清液10ul点于滤纸上，以45％乙醇展开，取出，晾干，放置10分钟，置紫外光灯(365nm)下检视，不得显持久的亮紫色荧光，

其【含量测定】方法如下：

(1)、总蒽醌

对照品溶液的制备

取大黄素对照品约10mg，精密称定，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得，

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml、1.2ml、1.6ml置l0ml具塞试管中，蒸发至干，残渣分别精密加入0.8％醋酸镁甲醇溶液l0ml使溶解，摇匀，以第一份为空白，照紫外一可见分光光度法(中国药典2010年版一部附录VA)，在510nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，

测定法：取本品约40mg，精密称定，置100ml园底烧瓶中，加8％盐酸溶液20ml，再加三氯甲烷20mL置沸水浴中加热回流1小时，冷却，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器至无色，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次(20ml、15ml、10ml)，合并三氯甲烷提取液置100ml量瓶中，加三氯甲烷稀释至刻度，摇匀，精密量取0.4ml置10ml具塞试管中，蒸发至干，残渣分别精密加入0.8％醋酸镁甲醇溶液l0ml使溶解，摇匀，以第一份为空白，照紫外一可见分光光度法(中国药典2010年版一部附录VA)，在510nm的波长处测定吸光度，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品中总蒽醌的量，计算，即得，

(2)、游离蒽醌

对照品溶液的制备

取大黄素对照品约10mg，精密称定，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得，

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml、1.2ml、1.6ml置lOml具塞试管中，蒸发至干，残渣分别精密加入0.8％醋酸镁甲醇溶液lOml使溶解，摇匀，以第一份为空白，照紫外一可见分光光度法(中国药典2010年版一部附录VA)，在510nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，

测定法：取本品约40ml，精密称定，置100ml锥形瓶中，加三氯甲烷约60ml超声处理(功率250W，频率25KHz)40分钟，放冷，滤过，用三氯甲烷冲洗滤器及锥形瓶，并入滤液中，滤液转移至100ml量瓶中，加三氯甲烷稀释至刻度，摇匀，精密量取0.4ml置lOml具塞试管中，蒸发至干，残渣分别精密加入0.8％醋酸镁甲醇溶液lOml使溶解，摇匀，以第一份为空白，照紫外一可见分光光度法(中国药典2010年版一部附录VA)，在510nm的波长处测定吸光度，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品中游离蒽醌的量，计算，即得，

(3)、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚总量：照高效液相色谱法(中国到典2010年版一部附录VID)测定，

色谱条件与系统适用性试验以十八炕基硅炕键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1％磷酸溶液(85:15)为流动相:检测波长为440nm，理论板数按大黄素峰计算应不低于3000，

对照品溶液的制备取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素各10μg、大黄素甲醚20μg、大黄酚50μg的混合溶液，即得，

供试品溶液的制备：取本品约15mg，精密称定，置100ml量瓶中，加入甲醇适量，超声处理(功率250W，频率25KHz)30分钟，使其溶解，取出，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液10ml(剩余滤液备用)，置烧瓶中，挥去溶剂，加8％盐酸溶液20ml再加三氯甲烷20ml加热回流2小时，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷振摇提取3次，每次10时，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解并转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得，

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl注入液相色谱仪，测定，即得，

(4)游离芦荟大黄素、游离大黄酸、游离大黄素、游离大黄酚、游离大黄素甲醚总量照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VID)测定，

照高效液相色谱法(中国到典2010年版一部附录VID)测定，

色谱条件与系统适用性试验以十八炕基硅炕键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1％磷酸溶液(85:15)为流动相:检测波长为440nm，理论板数按大黄素峰计算应不低于3000，

对照品溶液的制备取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素各10μg、大黄素甲醚20μg、大黄酚50μg的混合溶液，即得，

供试品溶液的制备：取本品约15mg，精密称定，置100ml量瓶中，加入甲醇适量，超声处理(功率250W，频率25KHz)30分钟，使其溶解，取出，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，滤液的一部分作为供试品溶液，

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl注入液相色谱仪，测定，即得。

3.用权利要求2的大黄总蒽醌作为药物活性成分制备成的口服药物制剂组合物。

4.权利要求3的口服药物组合物，选自胶囊，片剂。

5.权利要求4的口服药物组合物，其中的胶囊剂配方如下：

大黄总蒽醌20-50g，微晶纤维素40-60g，氢氧化铝干凝胶20-30g,碳酸氢钠8-12g,聚维酮1-3g,硬脂酸镁1-3g。

6.权利要求5所述的胶囊剂的含量测定方法，步骤如下：

(1)、总蒽醌

对照品溶液的制备

取大黄素对照品约10mg，精密称定，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得，

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml、1.2ml、1.6ml置lOml具塞试管中，蒸发至干，残渣分别精密加入0.8％醋酸镁甲醇溶液l0ml使溶解，摇匀，以第一份为空白，照紫外一可见分光光度法(中国药典2010年版一部附录VA)，在510nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，

测定法：取装量差异项下本品内容物粉末约0.2g，精密称定，置100ml园底烧瓶中，加8％盐酸溶液20ml，再加三氯甲烷20mL置沸水浴中加热回流1小时，冷却，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器至无色，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次(20ml、15ml、10ml)，合并三氯甲烷提取液置100ml量瓶中，加三氯甲烷稀释至刻度，摇匀，精密量取0.4ml置10ml具塞试管中，蒸发至干，残渣分别精密加入0.8％醋酸镁甲醇溶液l0ml使溶解，摇匀，以第一份为空白，照紫外一可见分光光度法(中国药典2010年版一部附录VA)，在510nm的波长处测定吸光度，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品中总蒽醌的量，计算，即得，

(2)、游离蒽醌

对照品溶液的制备

取大黄素对照品约10mg，精密称定，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得，

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml、1.2ml、1.6ml置l0ml具塞试管中，蒸发至干，残渣分别精密加入0.8％醋酸镁甲醇溶液l0ml使溶解，摇匀，以第一份为空白，照紫外一可见分光光度法(中国药典2010年版一部附录VA)，在510nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，

测定法：取装量差异项下本品内容物粉末约0.2g，精密称定，置100ml锥形瓶中，加三氯甲烷约60mL超声处理(功率250W，频率25KHz)40分钟，放冷，滤过，用三氯甲烷冲洗滤器及锥形瓶，并入滤液中，滤液转移至100ml量瓶中，加三氯甲烷稀释至刻度，摇匀，精密量取0.4ml置l0ml具塞试管中，蒸发至干，残渣分别精密加入0.8％醋酸镁甲醇溶液lOml使溶解，摇匀，以第一份为空白，照紫外一可见分光光度法(中国药典2010年版一部附录VA)，在510nm的波长处测定吸光度，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品中游离蒽醌的量，计算，即得，

(3)、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚总量：照高效液相色谱法(中国到典2010年版一部附录VID)测定，

色谱条件与系统适用性试验以十八炕基硅炕键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1％磷酸溶液(85:15)为流动相:检测波长为440nm，理论板数按大黄素峰计算应不低于3000，

对照品溶液的制备取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素各10μg、大黄素甲醚20μg、大黄酚50μg的混合溶液，即得，

供试品溶液的制备：取装量差异项下本品内容物粉末约75mg，精密称定，置100ml量瓶中，加入甲醇适量，超声处理(功率250W，频率25KHz)30分钟，使其溶解，取出，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液10ml(剩余滤液备用)，置烧瓶中，挥去溶剂，加8％盐酸溶液20ml再加三氯甲烷20ml加热回流2小时，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷振摇提取3次，每次10时，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解并转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得，

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl注入液相色谱仪，测定，即得，

(4)游离芦荟大黄素、游离大黄酸、游离大黄素、游离大黄酚、游离大黄素甲醚总量照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VID)测定，

色谱条件与系统适用性试验以十八炕基硅炕键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1％磷酸溶液(85:15)为流动相:检测波长为440nm，理论板数按大黄素峰计算应不低于3000，

对照品溶液的制备取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素各10μg、大黄素甲醚20μg、大黄酚50μg的混合溶液，即得，

供试品溶液的制备：取装量差异项下本品内容物粉末约75mg，精密称定，置100ml量瓶中，加入甲醇适量，超声处理(功率250W，频率25KHz)30分钟，使其溶解，取出，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，滤液的一部分作为供试品溶液，

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl注入液相色谱仪，测定，即得。