CN110836939A - 土大黄中药饮片的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了土大黄中药饮片的检测方法，属于中药分析技术领域，包括：制备芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚五种对照品溶液的混合液；土大黄中药饮片粉末加入甲醇，加热回流，滤液挥去溶剂，加盐酸溶液水解，再加三氯甲烷提取，分取三氯甲烷溶液，减压回收溶剂至干，残渣溶于甲醇，制得总蒽醌供试品溶液；土大黄中药饮片粉末加入甲醇，加热回流，过滤，制得游离蒽醌供试品溶液；将上述三种溶液分别注入高效液相色谱仪测定；根据色谱图计算出土大黄中药饮片中总蒽醌、游离蒽醌的含量，本发明克服了原标准只能定性鉴别的缺陷，填补了土大黄中药饮片定量分析的空白，具有开创性。

Description

土大黄中药饮片的检测方法

技术领域

本发明涉及中药分析技术领域，具体涉及土大黄中药饮片的检测方法。

背景技术

土大黄来源于蓼科植物巴天酸模RumexpatientiaL.或皱叶酸模RumexcrispusL.的干燥根。历代医书中最早记载土大黄的是宋代苏颂主持编撰的《图经本草》，后来，明代李时珍编著《本草纲目》中记载描述的土大黄与现今酸模属的巴天酸模及皱叶酸模极其相似，清代吴其濬(音同俊)在编著《植物名实图考》时沿用了这一记录。自上世纪60年代之后，酸模属的土大黄成为北京药材市场该品种的主流，从1986年版《北京中药炮制规范》到1998年版《北京市中药材标准》再到后来的2008年版《北京市中药饮片炮制规范》，其收录的土大黄来源均为巴天酸模与皱叶酸模。

土大黄(巴天酸模)与土大黄(皱叶酸模)在化学成分上有许多共性，根部中含总蒽醌，还含酸模素(musizin)、鞣质、6-O-丙二酰基-β-甲基-D-吡喃葡萄糖苷(6-O-malonyl-β-methyl-D-glucopyranoside)、阿斯考巴拉酸(ascorbalamicacid)、槲皮素(quercetin)。总蒽醌包括游离蒽醌和结合蒽醌，游离蒽醌主要包括大黄酚(Chrysophanol)、大黄素(Emodin)，大黄素甲醚(Physcion)、大黄酸(Rhein)及芦荟大黄素(Aloe-emodin)五种成分，结合蒽醌是以游离蒽醌为苷元的单糖苷或多糖苷的结合。

大黄酚的结构式如下：

大黄素的结构式如下：

大黄素甲醚的结构式如下：

大黄酸的结构式如下：

芦荟大黄素的结构式如下：

土大黄中含有抑制真菌、细菌和莴苣秧苗生长的成分，所含酸模素具有强大抗菌作用。土大黄含有大黄素、大黄酚、酸模素等，其中大黄素、大黄酚能促进血液凝固，降低血管通透性，加强血管收缩性。药理实验表明，土大黄注射液能缩短家兔出、凝血时间及凝血酶原时间，延长家兔血浆复钙时间。土大黄具有清热解毒，凉血止血，祛瘀消肿，通便杀虫的作用，主治肺痨咯血，肺痈，吐血，瘀滞腹痛，跌打损伤，大便秘结，痄腮，痈疮肿毒，烫伤，疥廯，湿疹。

土大黄是北京常用中药材，而《中华人民共和国药典》现行版并未收载，《北京市中药材标准》1998年版及《北京市中药饮片炮制规范》2008年版虽然已收载土大黄，但检测项目简单，只能定性鉴别，而无含量测定项目，导致其内在质量无法控制。

发明内容

针对现有技术不足，本发明的一个目的在于提供一种土大黄中药饮片的检测方法，对土大黄指标成分总蒽醌和游离蒽醌进行了定量测定，提高了对土大黄中药饮片的质量控制，确保了患者用药安全。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现：

土大黄中药饮片的检测方法，包括有以下步骤：

S1制备对照品溶液：以甲醇为溶液，制备含有芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品和大黄素甲醚对照品的混合液；

S2制备总蒽醌供试品溶液：取一定量的土大黄中药饮片粉末，按土大黄中药饮片粉末质量:甲醇体积为0.15g:20-30mL的比值，加入甲醇，加热回流80-40min，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过；取一定体积的续滤液，挥去溶剂，按续滤液中对应的土大黄中药饮片粉末质量:盐酸溶液体积为0.003g:1mL的比值，加质量浓度为8％的盐酸溶液，超声处理2min；再加与8％盐酸溶液等体积的三氯甲烷，加热回流1h；分取三氯甲烷层，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，取续滤液，即得；

S3测定：分别将对照品溶液和总蒽醌供试品溶液注入液相色谱仪，检测；

S4计算：根据对照品溶液色谱图与总蒽醌供试品溶液色谱图的峰面积，计算出土大黄中总蒽醌的含量。

通过采用上述技术方案，制备总蒽醌供试品溶液时，根据土大黄的总蒽醌成分中含有结合蒽醌和游离蒽醌的性质，先将土大黄中药饮片粉末加入甲醇提取，将结合蒽醌和游离蒽醌提取至甲醇中，再加入盐酸使结合蒽醌水解成为游离蒽醌，然后，用三氯甲烷提取出游离蒽醌，过滤蒸干，再用甲醇定容测定。

制备总蒽醌供试品溶液时，经过两次提取，最终的总蒽醌供试品溶液纯度高，能够用于精确测定芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚五种成分的含量，为判定土大黄中药饮片的质量提供精准多样的数据参考。而且，通过多批验证认为，本发明的土大黄含量测定方法成熟可行，可操作性强，便于推广。

综上，本发明的检测方法，既完善了标准，填补了土大黄标准无含量测定的空白，又保证了药品质量，确保了患者用药安全，具有很高的应用价值。

较佳的，制备总蒽醌供试品溶液时，步骤S2中，分取三氯甲烷层之后的酸液再用三氯甲烷提取3次，合并三氯甲烷液，再进行减压回收溶剂至干的操作。

本发明的目的二在于提供另一种土大黄中药饮片的检测方法，包括有以下步骤：

S1制备对照品溶液：以甲醇为溶液，制备含有芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品和大黄素甲醚对照品的混合液；

减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

S3测定：分别将对照品溶液和游离蒽醌供试品溶液注入液相色谱仪，检测；

S4计算：根据对照品溶液色谱图与游离蒽醌供试品溶液色谱图的峰面积，计算出土大黄中游离蒽醌的含量。

通过采用上述技术方案，根据土大黄的游离蒽醌成分的性质，将土大黄中药饮片粉末直接加入甲醇提取，测定出游离蒽醌中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚五种成分的含量，与总蒽醌的检测数据一同用于判定土大黄中药饮片的质量，丰富了数据参考，进一步提高了土大黄中药饮片质量判定的精准度。

较佳的，上述总蒽醌供试品溶液或游离蒽醌供试品溶液的制备中，土大黄中药饮片粉末的粒径为65目。

通过采用上述技术方案，可以使供试品粉末达到检测要求，不会因为粉末太粗影响含量测定，也不会因为太细而破坏供试品细胞，影响检测结果，提高了检测的准确度。

较佳的，上述总蒽醌测试或游离蒽醌测试中，芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品的浓度均为16ug/mL，大黄素甲醚对照品的浓度为8ug/mL。

较佳的，上述总蒽醌测试或游离蒽醌测试中，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为85：15的甲醇-0.1％磷酸溶液为流动相。

较佳的，上述总蒽醌测试或游离蒽醌测试中，检测波长为254nm。

通过采用上述技术方案，254nm检测波长下，样品的峰形左右对称，受干扰最小，因此检测结果精确。

较佳的，上述总蒽醌供试品溶液的浓度为0.0025-0.00375g/ml。

较佳的，上述游离蒽醌供试品溶液浓度为0.015-0.025g/ml。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供了土大黄中药饮片总蒽醌、游离蒽醌两种指标成分的检测方法，准确可行，克服了原标准只能定性鉴别的缺陷，填补了土大黄中药饮片定量分析的空白，为药检系统与中药企业质检测定土大黄中药饮片提供了参考依据，有利于完善检测标准，保证药品质量，确保患者用药安全，具有开创性；

2、本发明提供了具体的操作方法，试剂用量配比、取样量等均较为合理，成熟可行，可操作性强，便于推广；

3、本发明制备总蒽醌供试品溶液时，经过甲醇、三氯甲烷两次提取，获得纯度较高的供试品溶液，能够用于精确测定芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚五种成分的含量，为判定土大黄中药饮片的质量提供精准多样的参考数据；

4、本发明测定出游离蒽醌中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚五种成分的含量，可单独或与总蒽醌的检测数据一同用于判定土大黄中药饮片的质量，丰富了参考数据；

5、综合考量多种因素，确定土大黄中药饮片合理的成分含量标准，即总蒽醌含量不得少于0.50％，游离蒽醌含量不得少于0.20％，具有很强的实际借鉴意义。

附图说明

图1为混合对照品第一针的色谱图；

图2为混合对照品第二针的色谱图；

图3为实施例1检测总蒽醌的色谱图；

图4为实施例2检测总蒽醌的色谱图；

图5为实施例3检测总蒽醌的色谱图；

图6为实施例4检测游离蒽醌的色谱图；

图7为实施例5检测游离蒽醌的色谱图；

图8为实施例6检测游离蒽醌的色谱图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

本发明用到的仪器设备如下：

百分之一电子天平(TP–1102，北京赛多利斯仪器系统有限公司)、万分之一电子天平(TP–214，北京赛多利斯仪器系统有限公司)、十万分之一电子天平(TP–25，丹佛仪器(北京)有限公司)、粉碎机(111B浙江瑞安市永历制药机械有限公司)、数控超声波清洗器(KQ–500D，昆山市超声仪器有限公司)、电子恒温水浴锅(DK–98–II，北京市永光明医疗仪器厂)、旋转蒸发仪(RE-52A上海亚荣生化仪器厂)、高效液相色谱仪(Lc–15c，岛津仪器(苏州)有限公司，双泵，自动进样)、紫外双波长检测器(SPD–15c，岛津仪器(苏州)有限公司)、C18色谱柱(4.6×150mm，Agilent)。

本发明用到的试药如下：

土大黄中药饮片由安国中药材市场采购，根据《北京市中药饮片炮制规范》2008年版中的规定，通过性状鉴别，确定为符合规定的土大黄中药饮片。

芦荟大黄素(批号为110795-200605，纯度为98.3％)、大黄酸(批号为110757-200206，纯度为100％)、大黄素(批号为110756-201512，纯度为98.7％)、大黄酚(批号为110796-200514，纯度为100％)、大黄素甲醚(批号为110758-200610，纯度为98.6％)，上述对照品均从中国食品药品检定研究院购买；

甲醇(进口)为色谱纯；其它试剂均为分析纯(北京化工厂)；流动相用水为娃哈哈纯净水。

本发明中的高效液相色谱的色谱条件为：

色谱柱填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶；

柱温：35℃；

流速：1.0mL/min；

流动相：以进口甲醇-0.1％磷酸溶液(体积比为85:15)；其中，0.1％磷酸溶液指质量浓度为0.1％的磷酸溶液；

检测波长为254nm。

实施例1

土大黄中药饮片的检测方法，包括有以下步骤：

S1制备对照品溶液：

用十万分之一天平精密称取芦荟大黄素5.33mg、大黄酸5.80mg、大黄素4.98mg、大黄酚5.25mg、大黄素甲醚5.33mg，分别置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，精密量取大黄素甲醚液5ml，精密量取其它对照品溶液各10ml，分别置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，分别精密量取上述5种对照品溶液各4ml，置20ml量瓶中混匀。

即得对照品溶液的浓度为：芦荟大黄素16.766ug/ml、大黄酸18.560ug/ml、大黄素15.729ug/ml、大黄酚16.800ug/ml、大黄素甲醚8.409ug/ml的对照品混合溶液。

S2制备总蒽醌供试品溶液：

将土大黄中药饮片放入粉碎机粉碎，并过4号筛(65目)得到供试品粉末。用万分之一天平精密称取供试品粉末0.1541g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，称定重量，加热回流80min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5ml，置烧瓶中，挥去溶剂，加质量浓度为8％的盐酸溶液12ml，超声处理2min，再加三氯甲烷12ml，加热回流60min，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

S3测定：

分别吸取对照品溶液10μL，供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，检测。其中，对照品溶液进针两次，获得的色谱图分别见图1和图2。总蒽醌供试品溶液的色谱图见图3。图1-3中，每个图中的五个检测峰由左向右，对应的五种成分均分别为芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚。

S4计算：

根据两份对照品溶液的色谱图，可知对照品溶液中五种成分的平均峰面积，分别为芦荟大黄素825894、大黄酸727974、大黄素657608、大黄酚479192、大黄素甲醚138977。

根据对照品与供试品的配制浓度，与对照品溶液中五种成分的平均峰面积及总蒽醌供试品溶液中五种成分的峰面积，对比计算出土大黄中药饮片中总蒽醌的含量。本实施例中，土大黄中药饮片中，五种成分的单独含量以及总蒽醌含量的计算结果见表1。

实施例2

本实施例按照实施例1中的方法进行，不同之处在于，步骤S2中：

精密称取供试品粉末0.1513g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，加热回流60min，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过。精密量取续滤液5ml，置烧瓶中，挥去溶剂，加质量浓度为8％的盐酸溶液10ml，超声处理2min，再加三氯甲烷10ml。

本实施例中，总蒽醌供试品溶液的色谱图见图4，同图1-3，图4中五个检测峰由左向右分别对应芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚。本实施例中，土大黄中药饮片中，五种成分的单独含量以及总蒽醌含量的计算结果见表1。

实施例3

本实施例按照实施例1中的方法进行，不同之处在于，步骤S2中：

精密称取供试品粉末0.1598g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇30ml，称定重量，加热回流40min，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过。精密量取续滤液5ml，置烧瓶中，挥去溶剂，加质量浓度为8％的盐酸溶液8ml，超声2min，再加三氯甲烷8ml。

本实施例中，总蒽醌供试品溶液的色谱图见图5，同图1-4，图5中五个检测峰由左向右分别对应芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚。本实施例中，土大黄中药饮片中，五种成分的单独含量以及总蒽醌含量的计算结果见表1。

实施例4

土大黄中药饮片的检测方法，包括有以下步骤：

S1制备对照品溶液：

同实施例1项下。

S2制备游离蒽醌供试品溶液：

将土大黄中药饮片放入粉碎机粉碎，并过4号筛(65目)得到供试品粉末。用万分之一天平精密称取0.4814g供试品，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，称定重量，加热回流80min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

S3测定：

吸取供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，检测。色谱图见图6。对照品色谱图采用实施例1中的对照品色谱图，即图1、图2。同图1-5，图6中五个检测峰由左向右，对应的五种成分，同样分别为芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚。

S4计算：

根据对照品与供试品的配制浓度，与对照品溶液中五种成分的平均峰面积及游离蒽醌供试品溶液中五种成分的峰面积，对比计算出土大黄中药饮片中游离蒽醌的含量。本实施例中，土大黄药饮片中，游离蒽醌对应的五种成分的单独含量以及游离蒽醌含量的计算结果见表2。

实施例5

本实施例按照实施例4中的方法进行，不同之处在于，步骤S2中：精密称取0.5511g供试品，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，加热回流60min。

本实施例中，游离蒽醌供试品溶液的色谱图见图7。同图1-6，图7中五个检测峰由左向右，同样分别对应芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚。土大黄中药饮片中，游离蒽醌对应的五种成分的单独含量以及游离蒽醌含量的计算结果见表2。

实施例6

本实施例按照实施例4中的方法进行，不同之处在于，步骤S2中：

精密称取0.4923g供试品，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇30ml，称定重量，加热回流40min。

本实施例中，游离蒽醌供试品溶液的色谱图见图8。同图1-7，图8中五个检测峰由左向右，同样分别对应芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚。土大黄中药饮片中，游离蒽醌对应的五种成分的单独含量以及游离蒽醌含量的计算结果见表2。

色谱图分析

图1-8中，均在五个相同的横坐标处出现特征峰，五个特征峰均分别对应芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚。相同特征峰的峰高不同，说明溶液中相同成分的含量不同。图3-5中相同特征峰的峰高不同，是由总蒽醌供试品溶液的制备参数设置不同引起的。同样的，图6-7中相同特征峰的峰高不同，是由游离蒽醌供试品溶液的制备参数设置不同引起的。

计算结果分析

表1土大黄中药饮片中总蒽醌含量的计算结果。

表2土大黄中药饮片中游离蒽醌含量的计算结果(％)。

由表1、2可以看出，采用本发明的检测方法，测得的土大黄中药饮片中，总蒽醌含量在0.745-0.927％之间、平均值为0.86％，游离蒽醌含量在0.515-0.653％之间、平均值为0.56％。说明本发明的检测方法准确可行，克服了原标准只能定性鉴别的缺陷，填补了土大黄中药饮片定量分析的空白，完善了检测标准，具有开创性。

土大黄中药饮片检测指标的确定

由表1、2中的计算结果可知，采用本发明的检测方法，测得的土大黄中药饮片中，总蒽醌含量和游离蒽醌含量的平均值分别为0.86％和0.56％。两种指标含量定的过高，不利于土大黄中药饮片的引进，过低，无法起到鉴别筛选的作用。综合考量各种因素，制定土大黄中药饮片中总蒽醌含量和游离蒽醌的含量指标如下：

(一)土大黄中药饮片含总蒽醌的总量不得少于0.50％；

(二)土大黄中药饮片含游离蒽醌的总量不得少于0.20％。

上述两种指标具有很强的实际借鉴意义。

上述具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (9)

1.土大黄中药饮片的检测方法，其特征在于，包括有以下步骤：

S1制备对照品溶液：以甲醇为溶液，制备含有芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品和大黄素甲醚对照品的混合液；

S2制备总蒽醌供试品溶液：取一定量的土大黄中药饮片粉末，按土大黄中药饮片粉末质量:甲醇体积为0.15g:20-30mL的比值，加入甲醇，加热回流80-40min，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过；取一定体积的续滤液，挥去溶剂，按续滤液中对应的土大黄中药饮片粉末质量:盐酸溶液体积为0.003g:1mL的比值，加质量浓度为8%的盐酸溶液，超声处理2min；再加与8%盐酸溶液等体积的三氯甲烷，加热回流1h；分取三氯甲烷层，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，取续滤液，即得；

S3测定：分别将对照品溶液和总蒽醌供试品溶液注入液相色谱仪，检测；

S4计算：根据对照品溶液色谱图与总蒽醌供试品溶液色谱图的峰面积，计算出土大黄中总蒽醌的含量。

2.根据权利要求1所述的土大黄中药饮片的检测方法，其特征在于：步骤S2中，分取三氯甲烷层之后的酸液再用三氯甲烷提取3次，合并三氯甲烷溶液，再进行减压回收溶剂至干的操作。

3.土大黄中药饮片的检测方法，其特征在于，包括有以下步骤：

S1制备对照品溶液：以甲醇为溶液，制备含有芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品和大黄素甲醚对照品的混合液；

S2制备游离蒽醌供试品溶液：取一定量的土大黄中药饮片粉末，按土大黄中药饮片粉末质量:甲醇体积为0.5g:20-30mL的比值，加入甲醇，加热回流80-40min，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

S3测定：分别将对照品溶液和游离蒽醌供试品溶液注入液相色谱仪，检测；S4计算：根据对照品溶液色谱图与游离蒽醌供试品溶液色谱图的峰面积，计算出土大黄中游离蒽醌的含量。

4.根据权利要求1或3所述的土大黄中药饮片的检测方法，其特征在于：土大黄中药饮片粉末的粒径为65目。

5.根据权利要求1或3所述的土大黄中药饮片的检测方法，其特征在于：步骤S1的混合液中，芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品的浓度均为16ug/mL，大黄素甲醚对照品的浓度为8ug/mL。

6.根据权利要求1或3所述的土大黄中药饮片的检测方法，其特征在于：步骤S3中，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为85:15的甲醇和0.1%磷酸溶液的混合液为流动相。

7.根据权利要求1或3所述的土大黄中药饮片的检测方法，其特征在于：步骤S3中，检测波长为254nm。

8.根据权利要求1或3所述的土大黄中药饮片的检测方法，其特征在于：总蒽醌供试品溶液的浓度为0.0025-0.00375g/ml。

9.根据权利要求1或3所述的土大黄中药饮片的检测方法，其特征在于：游离蒽醌供试品溶液浓度为0.015-0.025g/ml。

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