CN111714530B - 一种简便快速去除三七总皂苷中蛋白质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种简便快速去除三七总皂苷中蛋白质的方法。所述的简便快速去除三七总皂苷中蛋白质的方法是在三七总皂苷中加入5~10倍的溶剂溶解得到三七总皂苷溶液,在10~30℃下过离子纤维素柱以乙醇容易洗脱,收集合并洗脱液,减压浓缩干燥得到目标物去蛋白三七总皂苷。本发明是将三七总皂苷溶解于溶剂中,在室温条件下,快速通过离子纤维素,使蛋白质吸附于离子纤维素。本发明具有快速、高效,操作简便等优势,具有较高的应用价值和开发前景。
Description
技术领域
本发明属于药品深加工技术领域,具体涉及一种简便快速去除三七总皂苷中蛋白质的方法。
背景技术
三七为五加科多年生草本植物Panax notoginseng(Burk)F.H.Chen的干燥根,主产于云南、广西等地。是云南的道地药材之一,具有“参中之王”的美称。是一种用途广泛、疗效佳的名贵中药材,其止血散瘀、消肿止痛、补血活血、清热、平肝、降压的功效驰名中外,而且具有一定的滋补强壮作用,深受患者欢迎。
目前,全国生产的三七类产品已经达到了三百余种,其中三七总皂苷类的制剂开发较为成功,特别是三七总皂苷注射剂类(血塞通注射液、注射用血塞通、血栓通注射液、注射用血栓通),已成为十大治疗心脑血管疾病的中药品种之一。
三七总皂苷(以下简称PNS)是从三七的根茎中提取的皂苷类成分,具有扩张血管,抑制血小板凝集,延长凝血时间,降血脂,清除自由基,抗炎,抗氧化等药理作用,临床上主要用于心脑血管疾病的治疗。一直以来对于三七中三七总皂苷的提取纯化研究围绕去除色素及小分子杂质进行,而忽略了对三七总皂苷中微量蛋白类物质的去除。此外,对于血塞通注射剂检验现行《药典》方法采用磺基水杨酸法进行检验,其原理是根据蛋白质在酸性环境中带正电荷,而磺基水杨酸根带负电,其与蛋白质结合沉淀,以显示蛋白质存在。该方法对于微量蛋白质则很难准确检出。
中药注射剂过敏反应最为常见,而中药注射剂中残留的植物蛋白是导致过敏反应发生的主要原因之一。经过深入研究,我们在已有有研究基础上找到了一种快速、高效的去除三七总皂苷中微量蛋白质的方法,较传统提取方法具有明显的综合优势。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简便快速去除三七总皂苷中蛋白质的方法。
本发明的目的是这样实现的,所述的简便快速去除三七总皂苷中蛋白质的方法是在三七总皂苷中加入5~10倍的溶剂溶解得到三七总皂苷溶液,在10~30℃下过离子纤维素柱以乙醇容易洗脱,收集合并洗脱液,减压浓缩干燥得到目标物去蛋白三七总皂苷。
本发明是将三七总皂苷溶解于溶剂中,在室温条件下,快速通过离子纤维素,使蛋白质吸附于离子纤维素。本发明具有快速、高效,操作简便等优势,具有较高的应用价值和开发前景。
附图说明
图1为蛋白含量标准曲线示意图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明,但不以任何方式对本发明加以限制,基于本发明教导所作的任何变换或替换,均属于本发明的保护范围。
本发明所述的简便快速去除三七总皂苷中蛋白质的方法是在三七总皂苷中加入5~10倍的溶剂溶解得到三七总皂苷溶液,在10~30℃下过离子纤维素柱以乙醇容易洗脱,收集合并洗脱液,减压浓缩干燥得到目标物去蛋白三七总皂苷。
所述的溶剂为水和/或醇。
所述的醇为1~3个碳原子的醇。
所述的溶解为加热搅拌溶解。
所述的加热是以2~3℃/min的升温速率升温至70~80℃。
溶解后还包括冷却步骤。
所述的冷却是以5~8℃/min的降温速率降温至10~30℃。
所述的离子纤维素为阳离子纤维素。
所述的离子纤维素使用量为三七总皂苷重量的1/10~1/20。
所述的离子纤维素柱的制备方法是取阳离子纤维素2g,加去离子水20ml,溶散后装柱,先加0.1mol/L的NaOH溶液20ml洗涤,加水洗涤至中性,再加0.1mol/L的HCl20ml洗涤,加水洗涤至中性,保存备用。
下面以具体实施案例对本发明做进一步说明:
实施例1
去蛋白三七总皂苷的制备
材料:三七总皂苷(由昆药集团提供,批号20170615)。
溶解:三七总皂苷10.0g,加10倍体积(W/V)95%乙醇,加热搅拌使完全溶解,放至室温,备用。
阳离子纤维素准备:取阳离子纤维素(CM-Cellulose以下简称CMC)1g,加去离子水约20ml,溶散后装柱,先加0.1mol/L NaOH溶液20ml洗涤,加水洗涤至中性,再加0.1mol/LHCl溶液20ml洗涤,加水洗涤至中性,保存备用。
上柱洗脱:取三七总皂苷溶液过CMC柱,之后加10ml95%乙醇洗脱CMC柱,收集合并洗脱液,减压浓缩至干,得三七总皂苷9.8g。为样品1。
实施例2
去蛋白三七总皂苷的制备
材料:三七总皂苷(由昆药集团提供,批号20170615)。
溶解:三七总皂苷10.0g,加10倍体积(W/V)70%乙醇,加热搅拌使完全溶解,放至室温,备用。
阳离子纤维素准备:取阳离子纤维素(CM-Cellulose以下简称CMC)1g,加去离子水约20ml,溶散后装柱,先加0.1mol/L NaOH溶液20ml洗涤,加水洗涤至中性,再加0.1mol/LHCl溶液20ml洗涤,加水洗涤至中性,保存备用。
上柱洗脱:取三七总皂苷溶液过CMC柱,之后加10ml95%乙醇洗脱CMC柱,收集合并洗脱液,减压浓缩至干,得三七总皂苷9.9g。为样品2。
实施例3
去蛋白三七总皂苷的制备
材料:三七总皂苷(由昆药集团提供,批号20170615)。
溶解:三七总皂苷10.0g,加10倍体积(W/V)25%乙醇,加热搅拌使完全溶解,放至室温,备用。
阳离子纤维素准备:取阳离子纤维素(CM-Cellulose以下简称CMC)2g,加去离子水约20ml,溶散后装柱,先加0.1mol/L NaOH溶液20ml洗涤,加水洗涤至中性,再加0.1mol/LHCl溶液20ml洗涤,加水洗涤至中性,保存备用。
上柱洗脱:取三七总皂苷溶液过CMC柱,之后加10ml95%乙醇洗脱CMC柱,收集合并洗脱液,减压浓缩至干,得三七总皂苷9.8g。为样品3。
实施例4
去蛋白三七总皂苷的制备
材料:三七总皂苷(由昆药集团提供,批号20170615)。
溶解:三七总皂苷10.0g,加10倍体积(W/V)水,加热搅拌使完全溶解,放至室温,备用。
阳离子纤维素准备:取阳离子纤维素(CM-Cellulose以下简称CMC)2g,加去离子水约20ml,溶散后装柱,先加0.1mol/L NaOH溶液20ml洗涤,加水洗涤至中性,再加0.1mol/LHCl溶液20ml洗涤,加水洗涤至中性,保存备用。
上柱洗脱:取三七总皂苷溶液过CMC柱,之后加10ml95%乙醇洗脱CMC柱,收集合并洗脱液,减压浓缩至干,得三七总皂苷9.8g。为样品4。
实施例5
三七总皂苷的检测
取实施例1-4制备的三七总皂苷样品,按2015版《中国药典》方法进行含量测定。
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以乙腈为流动相A,以水为流动相B,按下表中的规定进行梯度洗脱;流速每分钟为1.5ml;检测波长为203nm;柱温25℃。人参皂苷Rg1与人参皂苷Re的分离度应大于1.5。理论板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于6000。
对照提取物溶液的制备 取三七总皂苷对照提取物适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含5mg的溶液,即得。
供试品溶液的制备 取本品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml中约含5mg的溶液,即得。
测定法 分别精密吸取对照提取物溶液与供试品溶液各10µl,注入液相色谱仪,测定,结果见下表。
表1.三七总皂苷含量测定结果
从结果看,经过阳离子纤维素处理后的三七总皂苷中五组分含量及总和含量差别不大。
实施例6
三七总皂苷的蛋白质检查
取上述制备三七总皂苷,加水制成每1ml含三七总皂苷50mg的溶液,除钾离子外,照注射剂有关物质检查法(《中国药典》2015年版四部通则2400)项下蛋白质检查检查方法进行检查,结果见下表。
表2 .三七总皂苷蛋白质检查结果
从结果看,采用药典规定的注射剂蛋白质检查方法,均未检出蛋白质残留。
实施例7
三七总皂苷的微量蛋白质的含量测定
为验证本方法除蛋白的效果,我们采用考马斯亮蓝法测定三七总皂苷中蛋白含量。
仪器:SYNERGR/HT多功能酶标仪,BIOTEK;50-1000μl电动单道移液器,sartorius;0.5-10μl,10-100μl,100-1000μl手动单道移液器,Eppendorf;30-300μl 8道手动移液器,Eppendorf;96孔透明酶标板,sartorius;超纯水机,milli-Q reference;实验试剂配置相关玻璃器皿。
试剂:考马斯亮蓝G250,天津市光复精细化工研究院,批号:2014年9月13日,规格:5g;无水乙醇,天津市风船化学试剂科技有限公司,批号:2016年11月01日,规格:2500ml,去离子水,现用现取。
1.样品处理
称取原料各批号25mg,加入70%乙醇1000ul,将其配置为50mg/ml溶液备用。
2.测定曲札茋苷原料中蛋白含量
A:标准液配置
原液浓度为2.0mg/ml,用去70%乙醇对倍稀释为1.0mg/ml,标准液为BCA试剂盒中的,稀释液为70%乙醇。
表3.1标准液配置
B:加样
表3.2加样表
C: 计算蛋白含量
扣除空白对照孔OD值后,以标准液浓度与相对应OD值作标准曲线(y=kx+/-b)。样品蛋白含量计算:将扣除空白对照后的OD 值带入标准曲线公式,计算出蛋白含量。结果见表4。
表4 三七总皂苷中蛋白含量测定表
根据图1所示蛋白含量标准曲线:标准曲线R2>0.99,y = 0.0278x - 0.0208 计算,将相对应OD 带入公式计算。
从结果看未经过处理的三七总皂苷蛋白含量为0.018%,经阳离子纤维素处理后样品中蛋白含量约为0.012%,较未处理前降低约33%。
Claims (8)
1.一种简便快速去除三七总皂苷中蛋白质的方法,其特征在于,所述简便快速去除三七总皂苷中蛋白质的方法是在含微量蛋白质的三七总皂苷中加入5~10倍的乙醇或水溶解得到三七总皂苷溶液,在10~30℃下过离子纤维素柱以95%乙醇溶液洗脱,收集合并洗脱液,减压浓缩干燥得到目标物去蛋白三七总皂苷,离子纤维素为阳离子纤维素。
2.根据权利要求1所述的简便快速去除三七总皂苷蛋白质的方法,其特征在于,所述溶解用乙醇的浓度为95%、70%或25%。
3.根据权利要求1所述的简便快速去除三七总皂苷蛋白质的方法,其特征在于,所述溶解为加热搅拌溶解。
4.根据权利要求3所述的简便快速去除三七总皂苷蛋白质的方法,其特征在于,所述加热是以2~3℃/min的升温速率升温至70~80℃。
5.根据权利要求1所述的简便快速去除三七总皂苷蛋白质的方法,其特征在于,溶解后还包括冷却步骤。
6.根据权利要求5所述的简便快速去除三七总皂苷蛋白质的方法,其特征在于,所述冷却是以5~8℃/min的降温速率降温至10~30℃。
7.根据权利要求1所述的简便快速去除三七总皂苷蛋白质的方法,其特征在于,所述离子纤维素使用量为三七总皂苷重量的1/10~1/20。
8.根据权利要求1所述的简便快速去除三七总皂苷蛋白质的方法,其特征在于,所述离子纤维素柱的制备方法是取阳离子纤维素2g,加去离子水20mL,溶散后装柱,先加0.1mol/L的NaOH溶液20mL洗涤,加水洗涤至中性,再加0.1mol/L的HCl 20mL洗涤,加水洗涤至中性,保存备用。
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