CN112394121A - 一种测定牛膝中水龙骨素b含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种测定牛膝中水龙骨素B含量的方法，属于中药有效成分的分析检测技术领域。所述检测方法通过分别制备供试品溶液、对照品溶液，然后取对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，以乙腈‑0.1%甲酸水溶液为流动相，进行脱洗。本方法操作简便、稳定性高、重复性好、专属性强，并具有供试品制备简单、设备要求较低、实验操作安全、稳定性高、重复性好、专属性强以及操作简便等优势，为后续牛膝中水龙骨素B的定性、定量的研究等提供产品质量控制、评价指标提供可靠的检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药材中有效成分含量的测定方法，尤其涉及一种测定牛膝中水龙骨素B含量的方法，属于中药有效成分的分析检测技术领域。
背景技术
牛膝为觅科植物牛膝的干燥根，冬季茎叶枯萎时采挖，除去须根和泥沙，捆成小把，晒至干皱后，将顶端切齐，晒干。用于逐瘀通经，补肝肾，强筋骨，利尿通淋，引血下行。用于经闭，痛经，腰膝酸痛，筋骨无力，淋证，水肿，头痛，眩晕，牙痛，口疮，吐血，鲍血。
文献“β-蜕皮激素和水龙骨素B的混合物对促进对虾蜕皮的生长作用，罗日祥等，1990”中提到：试验β-蜕皮激素和水龙骨素B（2:1）的混合物促进对虾蜕皮生长的作用。其中，牛膝中有效处成分水龙骨素B属于蜕皮甾酮类化合物。文献“怀牛膝对记忆力和耐力的影响，马爱莲等，2013”文献中提到：蜕皮甾酮具有促进学习记忆和改善脑功能障碍的药理活性。文献“蜕皮甾酮对撞击致肺挫伤的影响，吴旭等，2016”中提到：牛膝中的蜕皮甾酮对撞击所致挫伤有一定治疗作用。另，文献“蜕皮甾酮软膏对家兔创面愈合的影响，李钰珑等，2008”中可知：蜕皮甾酮软膏有明显促进伤口愈合的作用，与云南白药作用相当。由此可见，蜕皮甾酮类化合物有着良好的药理作用，而水龙骨素B属于蜕皮甾酮类化合物，也有着蜕皮甾酮类化合物的性质，因此，对水龙骨素B的研究同样意义重大。
2020版《中国药典》中牛膝和川牛膝的鉴定和含量测定均未涉及水龙骨素B，且目前未有论文、专利等文献公开过牛膝中的水龙骨素B的分析检测、分离纯化制备等。文献“牛膝不同炮制品中化学成分的UPLC-Q-TOF-MS分析，陶益等，2017”中仅公开：比较生牛膝、酒牛膝及盐牛膝的各项质控指标及化学成分的差异，结果表明：生牛膝、酒牛膝及盐牛膝的水分、总灰分及醇溶性浸出物的含量均符合2015年版《中国药典》的要求，运用高分辨质谱鉴定了10个主要化学成分，分别为苄基葡萄糖苷、苄基葡萄糖苷异构体、牛膝甾酮A、水龙骨素B、β-蜕皮甾酮、牛膝甾酮、姜状三七苷R1、人参皂苷Ro、牛膝皂苷Ⅰ和竹节参皂苷Ⅳ。牛膝经酒炙后苄基葡萄糖苷、苄基葡萄糖苷异构体、水龙骨素B、β-蜕皮甾酮和人参皂苷Ro的含量显著升高，而姜状三七苷R1、牛膝皂苷Ⅰ和竹节参皂苷Ⅳ的含量则显著减低；盐炙后苄基葡萄糖苷、苄基葡萄糖苷异构体、牛膝甾酮A、水龙骨素B、β-蜕皮甾酮和牛膝甾酮含量显著升高，而姜状三七苷R1、人参皂苷Ro、牛膝皂苷Ⅰ和竹节参皂苷Ⅳ的含量则显著降低。同时得出：牛膝炮制后酚苷类和甾体皂苷类成分的含量显著上升，而三萜皂苷类成分的含量则显著降低。
以及，文献“牛膝不同炮制品中化学成分的UPLC-Q-TOF/MS检测分析，胡清宇，2018”中仅公开：分析应用UPLC-Q-TOF/MS对牛膝不同炮制品中化学成分的临床检测价值，结果表明：UPLC-Q-TOF/MS对牛膝不同炮制品中化学成分的临床检测价值在生牛膝、酒牛膝和盐牛膝3种炮制品中差异无统计学意义（P>0.05），但酒牛膝的检验灵敏度和特异性较高，差异具有统计学意义（P<0.05）。同时得出：牛膝含有三萜皂甙、多种多糖、肽类和氨酸类等多种化学成分，应用UPLC-Q-TOF/MS对牛膝不同炮制品中化学成分的临床检测价值确切，对酒牛膝的灵敏性和特异性较高，值得临床检测其有效成分，以指导临床用药，提供理论和临床实践依据。
发明内容
本发明旨在解决现有技术问题，而提出了一种测定牛膝中水龙骨素B含量的方法。在本技术方案中，通过有机溶剂提取有效成分作为供试品溶液，与对照品溶液一并进入高效液相色谱仪中进行测定，可实现牛膝中水龙骨素B的定性和定量检测（检测限可达到0.75μg/mL），为后续牛膝中水龙骨素B的定性、定量的研究，以及为产品质量控制、评价指标提供可靠的检测方法；且本方法操作简便、稳定性高、重复性好及专属性强。
为了实现上述技术目的，提出如下的技术方案：
一种测定牛膝中水龙骨素B含量的方法，包括如下步骤：
A．对照品溶液的制备：取对照品水龙骨素B，加甲醇溶解，按浓度呈梯度分布配制至少五份对照品溶液；
B．供试品溶液的制备：取供试品牛膝，干燥粉碎后，称牛膝药材粉末1～5g，加入水饱和正丁醇（水：正丁醇=1:1配置）10～40mL，密塞，称定重量，浸泡过夜，超声处理（电磁波频率30～60 kHz，温度为15～30℃），放冷后以水饱和正丁醇补足重量，摇匀，离心（2000r/min），用甲醇10～20mL分3～5次洗涤离心管和残渣，合并上清液和洗液，减压浓缩至干（温度60～80℃），残渣加甲醇使溶解，转移至5～10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，取续滤液作为供试品溶液；
C．标准曲线的绘制：取所得对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪中进行测定，记录对应的色谱图和峰面积；
以对照品溶液的浓度为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，计算得线性回归方程；
D．结果计算：取所得供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测定，将所得峰面积带入所述标准曲线的线性回归方程中，即得供试品牛膝中水龙骨素B的含量；
高效液相色谱仪内色谱条件满足：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；
色谱柱柱温：20～40℃；
检测器：UV-PAD检测器；
流动相：以乙腈为流动相A，以0.1%甲酸水溶液为流动相B；
流动相流速：0.8～1.2mL/min；
进样量：2～20μL；
检测波长：250nm；
流动相按下表进行梯度洗脱，具体为：
优选的，在步骤A中，所述对照品溶液中，水龙骨素B含量为0.0580～1.066mg/mL，对照品溶液的浓度与对应色谱图中水龙骨素B色谱峰的峰面积具有良好的线性关系。
优选的，在步骤A中，所述对照品溶液为五份，浓度分别为：0.0580mg/mL、0.1012mg/mL、0.2108mg/mL、0.5020mg/mL及1.066mg/mL。在此对照品浓度范围内，本发明提供的方法具有较高的准确性。
优选的，所述方法的检测限可达到0.75μg/mL。
采用本技术方案，带来的有益技术效果为：
1）在本发明中，通过有机溶剂提取有效成分作为供试品溶液，用水龙骨素B对照品进行定位，将供试品溶液与对照品溶液一并进入高效液相色谱仪中进行测定，可实现牛膝中水龙骨素B的定性和定量检测，为后续牛膝中水龙骨素B的定性、定量的研究，为产品质量控制、评价指标提供可靠的检测方法；且本方法操作简便、稳定性高、重复性好及专属性强，RSD值均小于2%，实际检测效果良好；
2）本发明实用性强，在实际检测过程中，其检测限可达0.75μg/mL，可以判断药材质量的优劣，检测过程简单、快捷。
附图说明
图1为本发明中水龙骨素B对照品溶液的标准曲线及回归方程；
图2为本发明采用三批次牛膝药材与水龙骨素B对照品溶液（浓度为0.2108mg/mL）的色谱图。
具体实施方式
下面通过对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
在以下实施例中，所涉及的仪器包括：
高效液相色谱仪：Waters2695-996、Waters2695-2996，
电子天平：LD610-2R（MEITTER TOLEDO）、XS205DU（MEITTER TOLEDO），
超纯水机：WP-Z-UV（四川沃特尔水处理设备有限公司），
超声波清洗器：BK-900B（济南巴克超声波科技有限公司），
离心机：TD6M（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；
在以下实施例中，所涉及的试剂包括：
乙腈（色谱纯）、甲酸（色谱纯）、水（超纯水），其余试剂均为分析纯；
在以下实施例中，所涉及的供试品包括：
牛膝药材批号：WN202007002-01、WN202007003-01、WN202007004-01（购自成都荷花池中药市）；
在以下实施例中，所涉及的对照品包括：
水龙骨素B（成都普思生物科技股份有限公司，批号：PS200525-02，含量以100%计）。
实施例1
一种测定牛膝中水龙骨素B含量的方法，包括如下步骤：
A．对照品溶液的制备：取对照品水龙骨素B，加甲醇溶解，按浓度呈梯度分布配制五份对照品溶液；
B．供试品溶液的制备：取供试品牛膝，干燥粉碎后，称牛膝药材粉末3g，加入水饱和正丁醇（水：正丁醇=1:1配置）10mL，密塞，称定重量，浸泡过夜，超声处理（电磁波频率30 kHz，温度为15℃），放冷后以水饱和正丁醇补足重量，摇匀，离心（2000r/min），用甲醇10mL分3次洗涤离心管和残渣，合并上清液和洗液，减压浓缩至干（温度60℃），残渣加甲醇使溶解，转移至5～10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，取续滤液作为供试品溶液；
C．标准曲线的绘制：取所得对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪中进行测定，记录对应的色谱图和峰面积；
以对照品溶液的浓度为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，计算得线性回归方程；
D．结果计算：取所得供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测定，将所得峰面积带入所述标准曲线的线性回归方程中，即得供试品牛膝中水龙骨素B的含量；
高效液相色谱仪内色谱条件满足：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；
色谱柱柱温：20℃；
检测器：ΜV-PAD检测器
流动相：以乙腈为流动相A，以0.1%甲酸水溶液为流动相B；
流动相流速：0.8mL/min；
进样量：2μL；
检测波长：250nm；
流动相按下表1进行梯度洗脱，具体为：
表1 梯度洗脱
实施例2
一种测定牛膝中水龙骨素B含量的方法，包括如下步骤：
A．对照品溶液的制备：取对照品水龙骨素B，加甲醇溶解，按浓度呈梯度分布配制六份对照品溶液；
B．供试品溶液的制备：取供试品牛膝，干燥粉碎后，称牛膝药材粉末5g，加入水饱和正丁醇（水：正丁醇=1:1配置）40mL，密塞，称定重量，浸泡过夜，超声处理（电磁波频率60 kHz，温度为30℃），放冷后以水饱和正丁醇补足重量，摇匀，离心（2000r/min），用甲醇20mL分5次洗涤离心管和残渣，合并上清液和洗液，减压浓缩至干（温度80℃），残渣加甲醇使溶解，转移至10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，取续滤液作为供试品溶液；
C．标准曲线的绘制：取所得对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪中进行测定，记录对应的色谱图和峰面积；
以对照品溶液的浓度为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，计算得线性回归方程；
D．结果计算：取所得供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测定，将所得峰面积带入所述标准曲线的线性回归方程中，即得供试品牛膝中水龙骨素B的含量；
高效液相色谱仪内色谱条件满足：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；
色谱柱柱温：40℃；
检测器：ΜV-PAD检测器
流动相：以乙腈为流动相A，以0.1%甲酸水溶液为流动相B；
流动相流速：1.2mL/min；
进样量：20μL；
检测波长：250nm；
流动相按下表2进行梯度洗脱，具体为：
表2 梯度洗脱
实施例3
一种测定牛膝中水龙骨素B含量的方法，包括如下步骤：
A．对照品溶液的制备：取对照品水龙骨素B，加甲醇溶解，配制浓度分别为0.0580mg/mL、0.1012mg/mL、0.2108mg/mL、0.5020mg/mL及1.066mg/mL的五份对照品溶液；
B．供试品溶液的制备：取供试品牛膝1.004g，干燥粉碎后，加入水饱和正丁醇（水：正丁醇=1:1配置）30mL，密塞，称定重量，浸泡过夜，超声处理（电磁波频率40 kHz，温度为25℃），放冷后以水饱和正丁醇补足重量，摇匀，离心（2000r/min），用甲醇15mL分4次洗涤离心管和残渣，合并上清液和洗液，减压浓缩至干（温度70℃），残渣加甲醇使溶解，转移至8mL容量瓶中，加甲醇至刻度，取续滤液作为供试品溶液；
C．标准曲线的绘制：取所得对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪中进行测定，记录对应的色谱图和峰面积；
以对照品溶液的浓度为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线（如图1所示），计算得线性回归方程y = 7771899.0023 x - 16705.4533（R2=0.9997），同时表明对照品溶液中水龙骨素B含量在0.0580 ～1.066mg/mL范围内时，具有良好的线性关系；
D．结果计算：取所得供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测定，将所得峰面积带入所述标准曲线的线性回归方程中，即得供试品牛膝中水龙骨素B的含量；
高效液相色谱仪内色谱条件满足：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；
色谱柱柱温：30℃；
检测器：ΜV-PAD检测器
流动相：以乙腈为流动相A，以0.1%甲酸水溶液为流动相B；
流动相流速：1.0mL/min；
进样量：10μL；
检测波长：250nm；
流动相按下表3进行梯度洗脱，具体为：
表3 梯度洗脱
实施例4
基于实施例3，对牛膝中水龙骨素B含量的测定方法中的检测限、定量限、精密度、重复性、溶液稳定性、耐用性、准确度（加样回收）、样品检测进行考察，以对本发明作进一步的说明。
一、检测限和定量限考察
以信噪比为3时，所对应的对照品水龙骨素B浓度为检测限；信噪比为10时，所对应的对照品水龙骨素B浓度为定量限，浓度分别为0.75μg/mL和2.475μg/mL。
二、精密度考察
取任意一批次的牛膝药材，按实施例3中的处理方式，制备供试品溶液，平行进样六次，结果如下表4。
表4 精密度考察结果
可知：相对标准偏差RSD值为1.87%，试验方法精密度符合要求。
三、重复性考察
取任意一批次的牛膝药材，按实施例3中的处理方式，制备六份供试品溶液，分别进样一次，结果如下表5。
表5 重复性考察结果
可知：相对标准偏差RSD值为4.84%，试验方法重复性符合要求。
四、溶液稳定性考察
取任意一批次的牛膝药材，按实施例3中的处理方式，制备供试品溶液，分别在0h、2h、4h、6h及8h进样检测，结果如下表6。
表6 溶液稳定性考察结果
可知：相对标准偏差RSD值为1.20%，试验方法溶液稳定性符合要求。
五、耐用性考察
取任意一批次的牛膝药材，按实施例3中的处理方式，制备供试品溶液，分别在两台不同高效液相色谱仪、三根不同的色谱柱上进样检测，结果如下表7-8。
表7 耐用性考察结果（同一高效液相色谱仪、三根色谱柱）
表8 耐用性考察结果（同一色谱柱、两台高效液相色谱仪）
可知：相对标准偏差RSD值均低于6%，该检测方法耐用性符合要求。
六、准确度（加样回收）考察
取水龙骨素B 17.42mg，置于25mL容量瓶中，加甲醇适量，使其溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.6968mg/mL对照品溶液；
取已知含量的牛膝药材粉末0.5002g，精密称定，平行6份，分别加入水饱和正丁醇（用水：正丁醇=1:1配制）27mL，再加入上述所得0.6968mg/mL对照品溶液3mL，密塞，称定重量，浸泡过夜，超声处理（电磁波频率30～60 kHz，超声提取温度为15~30℃），放冷后以水饱和正丁醇（用水：正丁醇=1:1配制）补足重量，摇匀，离心（2000r/min），用甲醇10～20mL分3～5次洗涤离心管和残渣，合并上清液和洗液；然后，减压浓缩至干（温度60～80℃），残渣加甲醇使溶解，转移至5mL容量瓶中，加甲醇至刻度，取续滤液作为供试品溶液，注入高效液相色谱仪，测定，计算回收率，试验结果见表9。
表9 准确度（加样回收）考察结果
可知：回收率为84.70～91.73%，表明本方法具有较好的测定准确度。
七、样品检测
取牛膝药材（粉末）三批，按实施例3中对应步骤制备供试品溶液，取浓度为0.0580mg/mL的水龙骨素B对照品溶液和所得供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪中，记录色谱图，如图2所示，用峰面积外标一点法计算水龙骨素B含量，试验结果如下表10所示。
表10 三批牛膝药材的检测结果
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种测定牛膝中水龙骨素B含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
A．对照品溶液的制备：取对照品水龙骨素B，加甲醇溶解，按浓度呈梯度分布配制至少五份对照品溶液；
B．供试品溶液的制备：取供试品牛膝，干燥粉碎后，向牛膝药材粉末中加入水饱和正丁醇，密塞，称定重量，浸泡，超声处理，放冷后以水饱和正丁醇补足重量，摇匀，离心；用甲醇洗涤离心管和残渣，合并上清液和洗液，减压浓缩至干，残渣加甲醇使溶解，转移至容量瓶中，加甲醇至刻度，取续滤液作为供试品溶液；
C．标准曲线的绘制：取所得对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪中进行测定，记录对应的色谱图和峰面积；
以对照品溶液的浓度为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，计算得线性回归方程；
D．结果计算：取所得供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测定，将所得峰面积带入所述标准曲线的线性回归方程中，即得供试品牛膝中水龙骨素B的含量；
高效液相色谱仪内色谱条件满足：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；
色谱柱柱温：20～40℃；
检测器：UV-PAD检测器；
流动相：以乙腈为流动相A，以0.1%甲酸水溶液为流动相B；
流动相流速：0.8～1.2mL/min；
进样量：2～20μL；
检测波长：250nm；
流动相按下表进行梯度洗脱，具体为：
2.根据权利要求1所述的测定牛膝中水龙骨素B含量的方法，其特征在于，在步骤A中，所述对照品溶液中，水龙骨素B含量为0.0580～1.066mg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的测定牛膝中水龙骨素B含量的方法，其特征在于，在步骤A中，所述对照品溶液为五份，浓度分别为：0.0580mg/mL、0.1012mg/mL、0.2108mg/mL、0.5020mg/mL及1.066mg/mL。
4.根据权利要求1所述的测定牛膝中水龙骨素B含量的方法，其特征在于，在步骤B的水饱和正丁醇中，以水与正丁醇之间的体积比为1:1。
5.根据权利要求1或4所述的测定牛膝中水龙骨素B含量的方法，其特征在于，在步骤B的超声处理中，电磁波频率30～60 kHz，温度为15～30℃。
6.根据权利要求5所述的测定牛膝中水龙骨素B含量的方法，其特征在于，在步骤B中，所述离心速率为2000r/min。
7.根据权利要求1或6所述的测定牛膝中水龙骨素B含量的方法，其特征在于，在步骤B的减压浓缩中，温度60～80℃。
8.根据权利要求1所述的测定牛膝中水龙骨素B含量的方法，其特征在于，在步骤B中，取供试品牛膝，干燥粉碎后，称牛膝药材粉末1～5g，加入水饱和正丁醇10～40mL，密塞，称定重量，浸泡过夜，超声处理，放冷后以水饱和正丁醇补足重量，摇匀，离心，用甲醇10～20mL分3～5次洗涤离心管和残渣，合并上清液和洗液，减压浓缩至干，残渣加甲醇使溶解，转移至5～10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，取续滤液作为供试品溶液。
9.根据权利要求1所述的测定牛膝中水龙骨素B含量的方法，其特征在于，在步骤B中，所述方法的检测限可达到0.75μg/mL。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113567591A (zh) * | 2021-08-19 | 2021-10-29 | 暨南大学 | 一种高效液相色谱-dad法测定橡胶中防老剂4020的残留量的方法 |
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