CN109212111A - 获得重楼提取液的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出了获得重楼提取液的方法及其应用。该方法包括：(1)将重楼样品分别在醇溶液与水中进行超声处理和离心处理，以便获得重楼醇上清和重楼水上清液，所述重楼样品在所述醇溶液和水中的质量体积分数相同；(2)将至少一部分所述重楼醇上清液进行浓缩处理；(3)将浓缩处理产物进行水复溶处理，并将水复溶处理产物与至少一部分所述重楼水上清液进行混合处理，混合处理产物为所述重楼提取液，所述至少一部分重楼醇上清液的体积与所述至少一部分重楼水上清液的体积相同。

Description

获得重楼提取液的方法及其应用

技术领域

本发明涉及药物分析领域，具体地，本发明涉及获得重楼提取液的方法及其应用，更具体地，本发明涉及获得重楼提取液的方法、建立重楼特征图谱的方法以及评价重楼质量的方法。

背景技术

重楼为百合科植物云南重楼Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.或七叶一枝花Paris polyphylla Smith var.chinensis(Franch.)Hara.的干燥根茎，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊之效，临床上常用于镇静、止痛、止血、抗肿瘤和治疗炎性疾病等。

重楼药材以野生资源为主，由于根茎生长缓慢，加上逐年大量采挖使得野生重楼资源严重枯竭。虽然近几年已开始人工栽培重楼，但供不应求的供需矛盾日益突出，货紧价扬的现象频现，导致市场上很多重楼药材根本达不到国家对重楼药材的质量标准要求，严重影响了重楼药材及其相关成药的质量和疗效。另外，重楼药材的产地、生长环境以及生长年限等各不相同，导致其质量参差不齐，优劣难辨，同样无法保证其用药的安全性和有效性。

因此，如何全面、准确地反映重楼药材的整体质量，进而提高重楼临床应用的安全性和有效性，对开发利用重楼具有重要意义。

发明内容

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

核苷和皂苷都是重楼的主要成分，如果只研究和评价其中的某一成分，无法全面、准确地反映重楼药材的整体质量。目前，现有技术是以重楼皂苷或核苷为评价指标对重楼药材进行质量控制的，缺少能够同时测定重楼多类成分的方法，导致对重楼药材整体质量的评价不够全面和准确，进而无法保证其用药的安全性和有效性。

究其原因，发明人发现，重楼中的两种主要成分-核苷类物质和皂苷类物质的性质差异较大，如有机溶剂对重楼中核苷类物质的分离效果影响很大(如出现峰塌陷、鬼峰等)，而重楼中的皂苷类物质又难溶于水，使得重楼两种主要成分难以用同一溶剂提取获得以便同时分离检测。在本申请中，发明人巧妙地将重楼的醇提液干燥后用水复溶，再与重楼的水提液混合，以此来获得重楼提取液用于重楼中主要成分的检测，有效解决了醇溶剂对核苷类物质的干扰而造成的峰塌陷等问题，同时保留了皂苷峰的响应，从而能够同时测定重楼的多类成分，全面、准确地评价重楼药材的整体质量，为高效开发、利用重楼资源提供了技术参考。

为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种获得重楼提取液的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：

(1)将重楼样品分别在醇溶液与水中进行超声处理和离心处理，以便获得重楼醇上清和重楼水上清液，所述重楼样品在所述醇溶液和水中的质量体积分数相同；

(2)将至少一部分所述重楼醇上清液进行浓缩处理；

(3)将浓缩处理产物进行水复溶处理，并将水复溶处理产物与至少一部分所述重楼水上清液进行混合处理，混合处理产物为所述重楼提取液，所述至少一部分重楼醇上清液的体积与所述至少一部分重楼水上清液的体积相同。

发明人发现，通过上述提取方法，既可以确保完全提取重楼中的核苷、甾酮和皂苷类物质，提取效率高，又可以以此来获得重楼提取液用于重楼中主要成分的检测，有效解决了醇溶剂对核苷类物质的干扰而造成的峰塌陷等问题，同时保留皂苷峰的响应，从而能够同时测定重楼的多类成分，全面、准确地评价重楼药材的整体质量，为高效开发、利用重楼资源提供了技术参考。

根据本发明的实施例，上述方法还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述醇溶液为乙醇溶液或甲醇溶液。发明人发现，所述醇溶液为乙醇溶液或甲醇溶液时，对皂苷类物质的提取更完全，提取效果更好，进而，重楼中皂苷类物质的检测结果更加准确。

根据本发明的实施例，所述乙醇溶液中乙醇的体积浓度为70％～90％。发明人发现，提取溶剂的浓度与提取效果紧密相关。若乙醇溶液中乙醇的浓度过低，会造成皂苷的溶解度过小，导致无法充分提取皂苷类物质，进而使得皂苷类物质检测结果的准确度降低，同时检测谱图中还会出现峰形塌陷等情况，使得检测效果较差；若乙醇溶液中乙醇的浓度过高，会造成提取溶剂的浪费。所述乙醇溶液中乙醇的浓度为70％～90％时，提取溶剂对皂苷类物质的提取更完全，提取效果更好，进而，重楼中皂苷类物质的检测结果更加准确。

根据本发明的实施例，所述甲醇溶液中甲醇的体积浓度为70％～100％。发明人发现，提取溶剂的浓度与提取效果紧密相关。若甲醇溶液中甲醇的浓度过低，会造成皂苷的溶解度过小，导致无法充分提取皂苷类物质，进而使得皂苷类物质检测结果的准确度降低，同时检测谱图中还会出现峰形塌陷等情况，使得检测效果较差。所述甲醇溶液中甲醇的浓度为70％～100％时，提取溶剂对皂苷类物质的提取更完全，提取效果更好，进而，重楼中皂苷类物质的检测结果更加准确。

根据本发明的实施例，所述重楼样品与所述醇溶液或所述水的质量体积比为1g：(8～15)mL。发明人发现，所述重楼样品与所述醇溶液或所述水的质量体积比为1g：(8～15)mL时，所述醇溶液或所述水对所述重楼样品中的有效成分的提取更完全，提取效果更好，且提取效率更高。

根据本发明的实施例，所述超声处理的时间为20～30min。发明人发现，所述超声处理的时间为20～30min时，既可以使提取溶剂充分提取重楼中的有效成分，又可防止有效成分的降解或打断破坏，重楼中核苷、甾酮和皂苷类物质的检测结果更加准确。

根据本发明的实施例，所述离心处理是在5000rpm的条件下进行不少于10min。发明人发现，所述离心处理在5000rpm的条件下进行不少于10min时，可以充分沉淀杂质而将有效成分保留在上清液中，重楼中核苷、甾酮和皂苷类物质的检测结果更加准确。

根据本发明的实施例，在所述水复溶处理过程中，进一步包括超声处理，进而可以有效促进重楼醇提取物的水溶解。

根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：将所述混合处理产物进行过滤处理，以便除去混合处理产物中的固体杂质或异物，同时驱除溶解的气体，防止不溶性物质对后续的液相色谱检测系统造成堵塞，保证检测结果的准确性。

根据本发明的实施例，所述过滤处理是通过0.22μm微孔滤膜进行的。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种建立重楼特征图谱的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：依据上述任一项所述的方法获得重楼提取液；对所述重楼提取液进行液相色谱-质谱检测；以及依据液相色谱-质谱检测结果，建立所述重楼特征图谱。

发明人发现，通过上述提取方法，重楼中的核苷、甾酮和皂苷类提取物可以被高效提取，并且对上述核苷、甾酮和皂苷类提取物进行液相色谱分析得到的液相色谱图中各峰的分离度良好，通过质谱分析，可获知相应峰所对应的物质，从而可以有效建立重楼特征图谱。根据本发明的实施例，上述建立重楼特征图谱的方法准确度高，稳定性好，且获得的色谱图的特征峰保留时间稳定，信息全面，包含了重楼中核苷、甾酮和皂苷三类主要成分的信息。

根据本发明的实施例，上述方法还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述液相色谱采用下列条件：

检测波长：260nm和/或203nm，

采用乙腈-水体系进行梯度洗脱，

洗脱条件：

色谱柱为Welch Ultimate AQ-C₁₈色谱柱(4.6×150mm，5μm)，

进样量为10-15μL，

流速为0.8-1.0mL/min，以及

柱温为20-30℃。

发明人发现，洗脱条件与检测效果密切相关，在根据本发明实施例的洗脱条件下进行液相色谱检测时，检测结果可达到基线分离，分离度良好，出峰全面。根据本发明的实施例，上述液相色谱分析条件下的建立重楼特征图谱的方法准确度更高，稳定性更好，且获得的色谱图的特征峰保留时间稳定，信息全面，包含了重楼中核苷、甾酮和皂苷三类主要成分的信息。

根据本发明的实施例，检测波长为在0～40min采用260nm，在40～90min采用203nm。发明人发现，检测波长与检测效果密切相关。由于核苷和皂苷成分的紫外吸收有很大的差别，若采用单一检测波长，如260nm或203nm，无法全面、准确地同时分析和检测核苷和皂苷两类成分。在上述色谱条件下，色谱图基线稳定，分离时间适中，出峰全面，且各色谱峰的分离度和峰形较好，有利于建立重楼特征图谱。根据本发明的实施例，上述液相色谱分析条件下的建立重楼特征图谱的方法准确度更高，稳定性更好，且获得的色谱图的特征峰保留时间稳定，信息全面，包含了重楼中核苷、甾酮和皂苷三类主要成分的信息。

根据本发明的实施例，在流动相水和乙腈中分别加入0.1％的甲酸，以提高质谱检测时待测样品的离子化效率。

根据本发明的实施例，液相色谱检测色谱图中6.16min、7.48min、9.17min、16.17min、17.18min、18.94min、20.39min、21.36min、29.98min、55.26min、56.54min、67.44min、68.75min以及70.48min处的峰构成所述重楼特征图谱，其中6.16min代表胞苷，7.48min代表鸟嘌呤，9.17min代表尿苷，16.17min代表腺嘌呤，17.18min代表鸟苷，18.94min代表胸苷，20.39min代表腺苷，21.36min代表3′-脱氧腺苷，29.98min代表β-蜕皮甾酮，55.26min代表重楼皂苷VII，56.54min代表重楼皂苷H，67.44min代表重楼皂苷Ⅱ，68.75min代表薯蓣皂苷，70.48min代表重楼皂苷Ⅰ。发明人发现，上述色谱峰的峰形和分离度良好，出峰全面，特征峰保留时间稳定，选择上述色谱峰建立的重楼特征图谱，准确度更高，稳定性更好，谱图信息更加全面，包含了重楼中核苷、甾酮和皂苷三类主要成分的信息。

根据本发明的实施例，所述质谱采用下列条件：电喷雾离子源，干燥气N₂，干燥气流速10L/min，干燥气体温度330℃，雾化压力50psi，毛细管电压4000V，扫描方式为正离子模式，扫描范围100-1500m/z。根据本发明的实施例，上述质谱条件下可对色谱图中相应位置的峰所对应的物质进行鉴定和分析，进而准确建立重楼特征图谱。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种评价待测重楼质量的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：依据上述任一项所述的方法获得待测重楼的重楼提取液；对所述重楼提取液进行液相色谱检测，以便获得液相色谱检测结果，所述液相色谱检测是按照前面所描述的液相色谱条件进行的；将所述液相色谱检测色谱图与重楼特征图谱进行比对，以便评价所述待测重楼的质量，所述重楼特征图谱是依据前面所描述的方法建立的。其中，所述重楼特征图谱是预定重楼对照样品的特征图谱，它可以在评价待测重楼质量操作前预先建立，也可以在评价待测重楼质量操作时建立。

发明人发现，通过上述提取方法，重楼中的核苷、甾酮和皂苷类提取物可以被高效提取，并且对上述核苷、甾酮和皂苷类提取物进行液相色谱分析得到的色谱分析图中各峰的分离度良好，将所述色谱图与重楼特征图谱进行比对即可定性分析确定待测重楼样品的质量优劣。其中，所述比对可以将所述液相色谱检测色谱图与重楼特征图谱中的峰位置、峰面积、峰形等参数进行比对，以便获知待测重楼样品的质量优劣，例如，如果重楼特征图谱由色谱图中6.16min、7.48min、9.17min、16.17min、17.18min、18.94min、20.39min、21.36min、29.98min、55.26min、56.54min、67.44min、68.75min以及70.48min处的峰构成，那么可以通过比对确定待测重楼样品的色谱图中是否在6.16min、7.48min、9.17min、16.17min、17.18min、18.94min、20.39min、21.36min、29.98min、55.26min、56.54min、67.44min、68.75min以及70.48min处出峰，和/或确定在6.16min、7.48min、9.17min、16.17min、17.18min、18.94min、20.39min、21.36min、29.98min、55.26min、56.54min、67.44min、68.75min以及70.48min处的峰的峰形或峰面积，来获知待测重楼样品的质量优劣。根据本发明实施例的评价重楼质量的方法准确度高，稳定性好，可以全面、准确地评价重楼药材的整体质量。

根据本发明的实施例，上述方法还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述比对是通过中药色谱指纹图谱相似度评价软件进行的。发明人发现，采用本领域技术人员公知的中药色谱指纹图谱相似度评价软件进行所述比对时，所述评价重楼质量的方法更加简便、快捷，效率更高。

附图说明

图1是根据本发明实施例的不同提取溶剂的滇重楼HPLC图谱，

其中，A1为对照品图谱，B1为水提取液图谱，C1为30％乙醇提取液图谱，D1为90％乙醇提取液图谱，E1为纯甲醇提取液图谱，F1为纯甲醇提取液水复溶物+水提取液的图谱，G1为90％乙醇提取液+水提取液的图谱，H1为30％乙醇提取液水复溶物+水提取液的图谱，I1为90％乙醇提取液水复溶物+水提取液的图谱，

峰1代表尿苷，峰2代表鸟苷，峰3代表腺苷，峰4代表重楼皂苷VII，峰5代表薯蓣皂苷，峰6代表重楼皂苷Ⅰ，峰7代表重楼皂苷V；

图2是根据本发明实施例的图1的前20min的放大图；

图3是根据本发明的实施例的不同梯度洗脱的滇重楼HPLC图谱，

其中，A2为色谱条件1下检测获得的图谱，B2为色谱条件2下检测获得的图谱；

图4是根据本发明实施例的切换波长与非切换波长的滇重楼HPLC图谱，

其中，A3为260nm/203nm切换波长的图谱，B3为波长为203nm的图谱，C3为波长为260nm的图谱；

图5是根据本发明的实施例的对照品和S5样品的HPLC图谱，

其中，A4为对照品图谱，B4为S5样品图谱，

峰2代表胞苷，峰3代表鸟嘌呤，峰4代表尿苷，峰5代表腺嘌呤，峰6代表鸟苷，峰7代表腺胸苷，峰8代表腺苷，峰9代表3′-脱氧腺苷，峰10代表β-蜕皮甾酮，峰11代表重楼皂苷VII，峰12代表重楼皂苷H，峰13代表重楼皂苷Ⅱ，峰14代表薯蓣皂苷，峰15代表重楼皂苷Ⅰ，峰16代表重楼皂苷V；

图6是根据本发明实施例的10批滇重楼药材的HPLC特征图谱；

图7是根据本发明实施例的滇重楼与其他产地重楼药材的HPLC图谱比较示意图。

具体实施方式

为能进一步解释本发明的特征、技术手段以及所达到的具体目的、功能，解析本发明的优点与方案，结合以下附图与具体实施方式对本发明的详述进行进一步地解释。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容后，本领域技术人员可以对本发明做各种修改和改动，这些等价形式同样落于本发明所要求保护的范围内。

为了便于理解，发明人对本申请所建立的重楼有效成分分析方法的前期开发过程(如实施例1和2所述)、方法的重复性(如实施例3所述)以及该方法的应用(如实施例4和5所述)作如下进一步的详细阐述。

以下实施例中所用的药材来源、实验仪器以及实验试剂如下所述。

1.药材来源

药材来源如下表1所示。

表1：重楼药材来源

NO.	产地	NO.	产地	NO.	产地
						S1	云南	S6	云南维西	S11	广西
S2	云南	S7	云南维西	S12	安徽大别山
						S3	云南西双版纳	S8	云南兰坪	S13	安徽大别山
S4	云南保山	S9	云南玉龙	S14	广东韶关
						S5	云南武定	S10	云南龙陵	S15	广东韶关

2.实验仪器

Agilent1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；Agilent6120型HPLC-MS(美国安捷伦科技有限公司)；Welch Ultimate AQ-C18色谱柱(4.6×150mm，5μm)；XPE205型十万分之一电子天平(美国梅特勒-托利多仪器有限公司)；Milli-Q超纯水系统(德国默克密理博公司)；ST40R型冷冻离心机(美国赛默飞世尔科技公司)；JAC-2010P超声波清洗机(上海君翼仪器设备有限公司)；DFT-50手提式高速万能粉碎机(温州市林大机械有限公司)。

3.实验试剂

乙腈(色谱纯，德国默克公司)和水。尿苷(98％，上海诗丹德生物技术有限公司，批号3555)，鸟苷(98％，中国食品药品检定研究院，批号111977-201501)，腺苷(99％，中国食品药品检定研究院，批号110879-201703)；薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷V和重楼皂苷VII均为自制，HPLC-DAD(面积归一化法)检测纯度均大于98.0％。

4.对照品溶液的制备

精密称取尿苷3.36mg、鸟苷2.77mg、腺苷4.77mg、重楼皂苷VII4.95mg、薯蓣皂苷4.97mg、重楼皂苷Ⅰ4.76mg和重楼皂苷V8.76mg，置10mL量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀备用。

实施例1重楼提取液制备考察

取重楼粉末(过三号筛)0.5g，精密称定4份，置10mL离心管中，分别加入水、30％乙醇、90％乙醇和甲醇溶液各5mL，称重，混匀，超声提取30min，取出，放置室温，并分别使用相应的提取溶剂补重，5000rpm离心10min，取上清液过0.22μm微孔滤膜，即得。

另取0.5mL醇提液上清液，加入0.5mL水提液上清液，混合均匀，过0.22μm微孔滤膜，即得醇提取液+水提取液。

另取0.5mL醇提液上清液，挥干，加0.5mL水超声复溶，再加入0.5mL水提液上清液，混合均匀，过0.22μm微孔滤膜，即得醇提取液水复溶物+水提取液。

HPLC色谱条件为：色谱柱为Welch Ultimate AQ-C18(4.6×150mm，5μm)，以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱：0～7min，0％乙腈；7～20min，0％→3％乙腈；20～25min，3％→20％乙腈；25～35min，20％→30％乙腈；35～60min，30％→45％乙腈；60～80min，45→50％乙腈；80～85min，50％→0％乙腈；85～90min，0％乙腈。流速1.0mL/min；柱温30℃；进样量15μL；检测波长：0～40min，260nm；40～90min，203nm。

按上述色谱条件对供试品和对照品进行测定，并记录色谱图，结果如图1和图2所示。

由结果可知，水提液(B1)和低浓度乙醇提取液(C1)主要成分是核苷，皂苷含量较低；高浓度醇提液(D1和E1)主要成分是皂苷，且乙醇(D1)提取效果较甲醇(E1)好，检测基线稳定。核苷和皂苷均是重楼主要成分，但单一溶剂难以同时提取两种成分，继而无法全面、准确反应重楼的整体质量。发明人尝试将重楼醇提液与水提液直接1:1混合进样，发现有机溶液的存在对核苷类成分的分离效果影响很大(G1)，进一步将醇提液挥干后用水复溶，再与水提取液1:1混合进样检测(F1、H1、G1)，结果表明，重楼水提液与90％乙醇的水复溶物1:1混合可有效提取重楼药材中的核苷和皂苷类成分(G1)，得到含有丰富波长信息的色谱图，可更全面、准确地评价重楼药材的质量优劣。

根据上述重楼提取液制备的考察过程，最终确定的提取方法可概括为：重楼粉末(过三号筛)0.5g，精密称定2份，置10mL离心管中，分别加入水和90％乙醇溶液5mL，称重，混匀，超声提取30min，取出，放置室温，并分别使用相应的提取溶剂水和90％乙醇补重，5000rpm离心10min。取0.5mL醇提液的上清液，挥干，加0.5mL水超声复溶，再加入0.5mL水提液的上清液，混合均匀，过0.22μm微孔滤膜，备用。

实施例2色谱条件考察

Welch Ultimate AQ-C18色谱柱(4.6×150mm，5μm)，流动相为乙腈-水，梯度洗脱，切换波长检测，进样量15μL，流速1.0mL/min，柱温30℃。其中，梯度洗脱和切换波长检测条件如下：

条件1：0～7min，0％乙腈；7～15min，0％→3％乙腈；15～20min，3％→30％乙腈；20～40min，30％→45％乙腈；40～60min，45％→50％乙腈；60～65min，50％乙腈；65～70min，50％→0％乙腈；70～75min，0％乙腈。检测波长：0～30min，260nm；30～75min，203nm。

条件2：0～7min，0％乙腈；7～20min，0％→3％乙腈；20～25min，3％→20％乙腈；25～35min，20％→30％乙腈；35～60min，30％→45％乙腈；60～80min，45→50％乙腈；80～85min，50％→0％乙腈；85～90min，0％乙腈。检测波长：0～40min，260nm；40～90min，203nm。

在上述两种色谱条件下，取供试品溶液分别进样，记录色谱图，结果如图3所示。

由图3可知，供试品溶液在色谱条件2(B2)下检测时可达到基线分离，分离度良好，出峰较多。

核苷和皂苷成分的紫外吸收有很大的差别，单一波长检测无法全面、准确地分析多个核苷和皂苷成分。在色谱条件2下，取供试品溶液分别进样，考察不同波长下的出峰情况。图4可知，260nm波长下(C3)核苷成分出峰较多，峰形较好，基线稳定，但基本检测不到皂苷成分。同样地，203nm波长下(B3)皂苷成分出峰较多，分离度良好，但核苷峰峰形不理想。而260nm/203nm切换波长检测(A3)可有效解决上述问题，同时分离重楼中核苷和皂苷成分，且各峰峰形较好，分离时间适中，分离度良好，从而获得更多波长信息。

根据上述色谱条件的考察过程确定的色谱条件为：Welch Ultimate AQ-C18色谱柱(4.6×150mm，5μm)，流动相为乙腈-水，梯度洗脱(0～7min，0％乙腈；7～20min，0％→3％乙腈；20～25min，3％→20％乙腈；25～35min，20％→30％乙腈；35～60min，30％→45％乙腈；60～80min，45→50％乙腈；80～85min，50％→0％乙腈；85～90min，0％乙腈)；流速1.0mL/min，进样量15μL，柱温30℃；检测波长：0～40min，260nm；40～90min，203nm。

实施例3方法学考察

1.精密度考察

取S5重楼样品的供试品溶液，按上述确定的最终色谱条件连续进样6次，记录各峰的峰面积并计算RSD值，结果如下表2所示，RSD均小于2％，表明仪器精密度良好。

表2：精密度考察结果

2.重复性考察

取S5重楼样品粉末6份，按上述方法制备供试品溶液，按上述确定的最终色谱条件进行测定，记录各峰的峰面积并计算RSD值，结果如下表3所示，RSD均小于3％，表明方法重复性良好。

表3：重复性考察结果

3.稳定性考察

取S5重楼样品的供试品溶液，按上述确定的最终色谱条件24h内分次进样，记录各峰的峰面积并计算RSD值，结果如下表4所示，RSD均小于2％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

表4：稳定性考察结果

综上所述，本发明中所述的分析方法重复性好，按上述提取方法得到的供试品溶液24h内保持稳定，本发明建立的方法可有效应用于重楼药材的特征图谱分析。

实施例4 HPLC-MS定性分析成分

液相色谱条件：往流动相水-乙腈中分别加入0.1％甲酸，其他色谱条件同实施例2确定的最终色谱条件相同。

质谱检测条件：电喷雾离子源，干燥气(N₂)流速10L/min；干燥气体温度330℃；雾化压力50psi；毛细管电压4000V；扫描方式为正离子模式；扫描范围100-1500m/z。

取对照品溶液和S5重楼样品的供试品溶液，按上述色谱条件和质谱条件进行分析检测，所得色谱图如图5所示。图5中共发现了15个色谱峰，通过重楼样品和对照品进行色谱峰比对的方法，鉴定了样品中6个色谱峰，包括3个核苷和3个皂苷(下表5)，分别是尿苷(峰4)、鸟苷(峰6)、腺苷(峰8)、重楼皂苷VII(峰11)、薯蓣皂苷(峰14)和重楼皂苷Ⅰ(峰15)。通过将样品色谱峰的质谱数据与文献报道进行对比，初步鉴定了样品中的另外8个色谱峰(下表5)，包括5个核苷、1个甾酮和2个皂苷，分别为胞苷(峰2)、鸟嘌呤(峰3)、腺嘌呤(峰5)、胸苷(峰7)、3′-脱氧腺苷(峰9)、β-蜕皮甾酮(峰10)、重楼皂苷H(峰12)和重楼皂苷Ⅱ(峰13)。

表5：重楼化学成分鉴定结果

实施例5重楼药材特征峰的确定和相似度评价

按实施例2确定的色谱条件对上表1中记载的S1～S10这10批滇重楼样品进行HPLC分析，得到相应的色谱图，将色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价软件(国家药典委员会，2012版)，以样品S5的色谱图为参照图谱，采用多点校正后进行自动匹配，生成滇重楼药材特征图谱对照图谱(参见图6)。由图6可知，15个共有峰能稳定重现，其中10号峰较为明显，分离度良好，保留时间稳定，表现出良好的相关性，经实施例4的HPLC-MS鉴定，可知该成分为β-蜕皮甾酮。

使用相关系数法对10批重楼样品进行评价，分别以核苷(峰1～9)、甾酮(峰10)或皂苷(峰11～15)成分作为特征峰进行相似度评价，其相似度结果见下表6，其中，R是软件拟合出来的图谱。

表6：10批滇重楼不同成分的相似度结果

由结果可知，若以核苷成分作为评价指标时，除了S8样品，其他样品的相似度均>0.9，说明10批滇重楼药材质量相差不大；然而，若以皂苷成分作为评价指标时，S6、S7和S9样品的相似度均<0.9，其他样品的相似度>0.9，说明10批滇重楼中个别产地药材质量相对较差。进一步地，若以核苷、甾酮和皂苷中两类或者三类成分共同作为评价指标时，越来越多样品的相似度<0.9，结果与单独以核苷或皂苷成分作为评价指标时大相径庭，提示不同产地滇重楼的内在质量实际上相差很大。

本发明进一步以8号峰(腺苷)为参照峰，计算其他共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果分别见表7和表8。结果显示，各共有峰的保留时间稳定，RSD％为0.10％～0.52％，说明HPLC特征图谱体系稳定。同时，不同样品相对峰面积相差较大，共有峰峰面积RSD％为16.19％～135.72％。因此，本发明建立的HPLC特征图谱可用于不同产地来源重楼的质量优劣区分。

表7：10批滇重楼样品色谱图共有峰的相对保留时间

表8：10批滇重楼样品色谱图共有峰的相对峰面积

Peak	S1	S2	S3	S4	S5	S6	S7	S9	S11	S12	RSD％
												1	0.521	0.028	0.555	0.106	0.163	0.157	0.153	1.651	0.176	0.481	70.14
2	0.122	0.072	0.120	0.189	0.264	0.184	0.194	2.983	0.122	0.190	33.59
												3	0.273	0.052	0.240	0.379	0.491	0.208	0.144	8.436	0.521	0.476	49.46
4	0.999	0.615	0.544	0.904	1.259	0.921	0.841	9.394	0.899	0.710	30.46
												5	0.458	0.178	0.363	0.278	0.367	0.235	0.265	7.279	0.288	0.406	16.19
6	0.325	0.291	0.145	0.058	0.189	0.357	0.317	0.706	0.133	0.040	76.50
												7	0.575	0.225	0.370	0.448	0.319	0.293	0.466	6.732	0.294	0.234	34.05
8	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	41.49
												9	0.521	0.296	0.391	0.489	0.313	0.282	0.511	3.607	0.331	0.244	40.12
10	4.106	6.826	6.440	2.639	0.884	0.247	0.349	39.014	0.842	1.618	108.43
												11	0.361	0.197	0.519	2.000	0.463	1.443	2.270	3.464	0.576	0.119	107.76
12	0.701	0.100	0.812	1.742	1.506	3.782	4.701	2.066	0.450	0.069	132.30
												13	0.422	1.914	1.131	5.982	0.540	0.351	0.088	16.481	2.386	2.146	109.87
14	0.961	2.041	7.873	1.442	0.196	0.811	0.207	27.254	0.323	0.615	135.72
												15	2.256	2.081	3.379	6.416	2.562	1.461	0.074	48.582	1.266	1.738	70.00

由于地域、生长环境、气候、生长年限等不同，很难保证不同产地、不同批次重楼药材质量的均一性。本发明除了研究滇重楼，还进一步比较了其他5个产地重楼(上表1中记载的S11～S15)的质量优劣，结果如图7所示。由结果可知，不同产地重楼的核苷、甾酮和皂苷成分的出峰情况相差较大，仅用一类成分并不能全面、准确地反映其整体质量，需结合3类成分共同评价重楼的质量优劣。本发明建立的方法是一种综合的重楼质量控制方法，为完善重楼药材及其产品的质量评价标准提供了参考依据。

Claims (10)

1.一种获得重楼提取液的方法，其特征在于，包括：

(1)将重楼样品分别在醇溶液与水中进行超声处理和离心处理，以便获得重楼醇上清和重楼水上清液，所述重楼样品在所述醇溶液和水中的质量体积分数相同；

(2)将至少一部分所述重楼醇上清液进行浓缩处理；

(3)将浓缩处理产物进行水复溶处理，并将水复溶处理产物与至少一部分所述重楼水上清液进行混合处理，混合处理产物为所述重楼提取液，所述至少一部分重楼醇上清液的体积与所述至少一部分重楼水上清液的体积相同。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述醇溶液为乙醇溶液或甲醇溶液；

优选地，所述乙醇溶液中乙醇的体积浓度为70％～90％；

优选地，所述甲醇溶液中甲醇的体积浓度为70％～100％。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重楼样品与所述醇溶液或所述水的质量体积比为1g：(8～15)mL；

任选地，所述超声处理的时间为20～30min；

任选地，所述离心处理是在5000rpm的条件下进行不少于10min；

优选地，在所述水复溶处理过程中，进一步包括超声处理；

优选地，进一步包括将所述混合处理产物进行过滤处理；

任选地，所述过滤处理是通过0.22μm微孔滤膜进行的。

4.一种建立重楼特征图谱的方法，其特征在于，包括：

依据权利要求1～3任一项所述的方法获得重楼提取液，

对所述重楼提取液进行液相色谱-质谱检测，以及

依据液相色谱-质谱检测结果，建立所述重楼特征图谱。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述液相色谱采用下列条件：

检测波长：260nm和/或203nm，

采用乙腈-水体系进行梯度洗脱，

洗脱条件：

进样量为10-15μL，

流速为0.8-1.0mL/min，以及

柱温为20-30℃。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述检测波长为在0-40min采用260nm，在40-90min采用203nm。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在流动相水和乙腈中分别加入0.1％的甲酸。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，液相色谱检测色谱图中6.16min、7.48min、9.17min、16.17min、17.18min、18.94min、20.39min、21.36min、29.98min、55.26min、56.54min、67.44min、68.75min以及70.48min处的峰构成所述重楼特征图谱，其中6.16min代表胞苷，7.48min代表鸟嘌呤，9.17min代表尿苷，16.17min代表腺嘌呤，17.18min代表鸟苷，18.94min代表胸苷，20.39min代表腺苷，21.36min代表3′-脱氧腺苷，29.98min代表β-蜕皮甾酮，55.26min代表重楼皂苷VII，56.54min代表重楼皂苷H，67.44min代表重楼皂苷Ⅱ，68.75min代表薯蓣皂苷，70.48min代表重楼皂苷Ⅰ。

9.一种评价待测重楼质量的方法，其特征在于，包括：

依据权利要求1～3任一项所述的方法获得待测重楼的重楼提取液；

对所述重楼提取液进行液相色谱检测，以便获得液相色谱检测结果，所述液相色谱检测是按照权利要求5～7中任一项所限定的液相色谱条件进行的；

将所述液相色谱检测色谱图与重楼特征图谱进行比对，以便评价所述待测重楼的质量，所述重楼特征图谱是依据权利要求4～8任一项所述的方法建立的。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述比对是通过中药色谱指纹图谱相似度评价软件进行的。