CN114910576B - 一种桂枝芍药知母汤中附子单酯型生物碱成分的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药品检测技术领域，具体涉及一种桂枝芍药知母汤中附子单酯型生物碱成分的检测方法，包括以下步骤：制备参照物溶液、供试品溶液，分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪进行分析，测定，记录色谱图，分别得到参照物色谱图谱和供试品指纹图谱，从而制得桂枝芍药知母汤中附子的标准指纹图谱；本发明操作方便、快捷，以其得出的相似度结果，对制剂指纹图谱进行评价，结论较为客观、准确，能够更全面、有效地对桂枝芍药知母汤中附子相关成分进行质量监控，保障临床用药安全。

Description

一种桂枝芍药知母汤中附子单酯型生物碱成分的检测方法

技术领域

本发明属于药品检测技术领域，具体为一种桂枝芍药知母汤中附子单酯型生物碱成分的检测方法。

背景技术

桂枝芍药知母汤属于2018年国家中医药管理局会同国家药品监督管理局制订《古代经典名方目录(第一批)》中的100首经典名方之一。出自东汉名家张仲景《金匮要略》一书，该方由桂枝、附子(炮)、芍药、麻黄、生姜、白术、知母、防风和甘草九味药组成。其中桂枝和附子为君药，桂枝辛甘温，温通经脉，善利关节而祛风邪；附子辛甘大热，为通十二经纯阳之要药；两药合用能祛风除湿以通脉，温经散寒以助阳。麻黄、防风、白术为臣药，麻黄辛微苦温，防风辛甘微温，白术苦甘温，三者合用能疏风散寒，祛湿止痛。知母、芍药和生姜为佐药，知母清热滋阴，白芍养血和营，生姜和胃止呕。甘草为使药，调和诸药。本方具祛风除湿，温经宣痹，养阴清热之功，以桂枝、芍药、知母在方中的特殊性而命名，称之为桂枝芍药知母汤。

经典名方是指至今仍广泛应用、疗效确切、具有明显特色与优势的古代中医典籍所记载的方剂。中药汤剂是传统中医临床用药的主流，其中的经典名方更是中医药数千年临床实践的结晶，具有组方合理、疗效确切、安全性高等特点，为中医药理论的精髓之一，但煎煮、携带不便，标准难以统一，严重影响其临床应用，因此简便易用、满足现代生活节奏的经典名方标准颗粒的研发意义重大。经典名方临床疗效确切，运用现代分析技术对其质量进行控制，不仅保障了复方制剂的质量稳定，也能更好的促进经典名方的临床应用。中国专利文献：CN113049724A在2021年6月9日公开了桂枝芍药知母汤组合物的指纹图谱构建方法和检测方法，以没食子酸、儿茶素、芍药内酯苷、盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱等22种物质作为对照品，检测波长为210nm；中国专利文献：CN201910542068.5在2020年12月22日公开了一种UPLC-MS法鉴定桂枝芍药知母汤中主要有效成分，通过对桂枝芍药知母汤的提取物进行梯度洗脱，再采用电喷雾离子源，在正、负离子模式下进行扫描，共观察到31个主要色谱峰，鉴定出其中的28个化合物。桂枝芍药知母汤中附子具有回阳救逆，补火助阳，散寒止痛等功效，但附子作为有毒中药，其质量关系临床用药安全。乌头碱类化合物作为附子中的主要活性成分临床药效显著，但同时也是毒性成分，因此常将乌头碱类成分含量的高低作为评价附子质量的重要指标。2020版《中国药典》将附子中单酯型生物碱类成分苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱以及苯甲酰次乌头原碱总量作为附子及其饮片的质量控制指标，规定3种单酯型生物碱总量不得少于0.010％，用作有效成分的含量限量检测。目前关于桂枝芍药知母汤的基础研究工作仍较少，现有技术中皆未对桂枝芍药知母汤中附子相关成分进行质量监控，而附子作为毒性中药，对其质量的把控显得尤为重要。为了能够全面、有效的控制桂枝芍药知母汤中附子的相关药效成分及毒性成分，保障用药的安全和疗效，本发明建立的桂枝芍药知母汤附子指纹图谱，为物质基础的研究提供方法依据，有利于指导工作生产，全面控制制剂质量，保障临床用药安全。

发明内容

本发明的目的在于提供一种桂枝芍药知母汤中附子单酯型生物碱成分的检测方法，包括以下步骤：

S1、参照物溶液的制备：精密称定苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、次乌头碱、新乌头碱，分别加入盐酸甲醇溶液，制成每1ml含苯甲酰乌头原碱5μg-20μg、苯甲酰次乌头原碱5μg-20μg、苯甲酰新乌头原碱5μg-20μg、次乌头碱5μg-20μg和新乌头碱5μg-20μg的混合参照物溶液；

S2、供试品溶液的制备：称取桂枝芍药知母汤溶液，加入盐酸溶液和水定容至刻度，使溶液中盐酸浓度为0.1mol/L，密塞，称定重量，然后超声处理并持续振摇，放冷，再称定重量，然后用盐酸溶液补足减失的重量，摇匀离心，滤过，取需续滤液10ml，加在固相萃取柱上，依次以水、氨溶液、甲醇、乙腈洗脱，待洗脱液流尽后，放置，继续用乙腈-浓氨试液洗脱，收集洗脱液，减压干燥回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈-0.1％磷酸溶液溶解，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

S3、检测：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液1～2μl，注入液相色谱仪进行分析，测定，记录色谱图，分别得到参照物色谱图谱和供试品指纹图谱，制得桂枝芍药知母汤附子的标准指纹图谱。

进一步的，所述步骤S2中的乙腈-浓氨试液中乙腈与浓氨的体积比为90:10。

进一步的，所述步骤S2中的乙腈-0.1％磷酸溶液中乙腈与磷酸的体积比为20：80。

进一步的，所述固相萃取柱为以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂200mg/6ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱，且所述固相萃取柱为一次性使用。

进一步的，所述桂枝芍药知母汤溶液的量为0.5g附子生饮片量。

进一步的，所述桂枝芍药知母汤按如下方法制备：

按重量份计称取如下饮片：桂枝12g，白芍9g，知母12g，麻黄6g，炮附片6g，防风12g，生姜15g，白术5g，甘草6g；共九味饮片置于砂锅中，加1400ml水，浸泡，加盖，煮沸，保持微沸至煎液400ml，趁热过滤，即得桂枝芍药知母汤溶液。

进一步的，所述步骤S3的色谱分析条件为：采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，柱温为30℃，以乙腈-体积分数为0.1％磷酸溶液为流动相系统进行梯度洗脱，流速控制为0.25ml/min，指纹图谱的检测波长为235nm，理论板数按苯甲酰新乌头原碱计算≥3000，梯度洗脱程序为：

0-2分钟，乙腈5％-16％，体积分数为0.1％的磷酸水溶液95％-84％；

2-13分钟，乙腈16％-35％，体积分数为0.1％的磷酸水溶液84％-65％；

13-17分钟，乙腈35％-60％，体积分数为0.1％的磷酸水溶液65％-40％；

17-22分钟，乙腈60％-95％，体积分数为0.1％的磷酸水溶液40％-5％；

22-26分钟，乙腈95％-5％，体积分数为0.1％的磷酸水溶液5％-95％。

进一步的，所述步骤S3的标准指纹图谱包括8个特征峰，以4号峰苯甲酰新乌头原碱色谱峰为S峰，各特征峰的相对保留时间分别为：1号峰相对保留时间RRT为0.477，2号峰相对保留时间RRT为0.516，3号峰相对保留时间RRT为0.833，4号(S)峰相对保留时间RRT为1.000，5号峰相对保留时间RRT为1.044，6号峰相对保留时间RRT为1.063，7号峰相对保留时间RRT为1.090和8号峰相对保留时间RRT为1.150。

进一步的，所述步骤S3的标准指纹图谱中的4、8号色谱峰分别与苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱参照物色谱峰保留时间相对应。

本发明还提供上述桂枝芍药知母汤中附子单酯型生物碱成分的检测方法在桂枝芍药知母汤中附子的质量检测和质量控制中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明提供的桂枝芍药知母汤中附子指纹图谱可同时检测出桂枝芍药知母汤附子的单酯型生物碱成分，全面反映桂枝芍药知母汤中附子质量信息，从而全面、有效地控制桂枝芍药知母汤制剂产品的质量；

2、本发明提供的桂枝芍药知母汤中附子指纹图谱参照中药注射剂指纹图谱的要求，经过对供试品的提取溶剂和指纹图谱色谱条件进行系统筛选，建立了指纹图谱分析方法；

3、本发明对桂枝芍药知母汤中附子指纹图谱分析方法进行了方法学考察，以相似度为评价指标，考察精密度、稳定性、重复性和中间精密度，方法学考察结果良好；

4、本发明提供的在建立桂枝芍药知母汤中附子的UPLC指纹图谱测定方法过程中，通过将测定的5批桂枝芍药知母汤中附子色谱图导入相似度评价系统，选择其中相对保留时间稳定且分离度较好的色谱峰作为特征峰并确定为共有峰，经多次试验研究，最终确定8个特征峰。同时采用中位数法来建立桂枝芍药知母汤的标准指纹图谱，基于多批供试品的指纹色谱图中的共有峰检测结果的基础上，生成了对照指纹图谱，作为本品指纹图谱标准，从而达到能够更全面、有效地控制制剂质量的目的。

5、本发明提供的桂枝芍药知母汤中附子指纹图谱采用国家药典委员会提供“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”，经多批样品的试验研究，所得出的评价结论基本一致，使用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”评价指纹图谱的相似度，操作方便、快捷，以其得出的相似度结果，对制剂指纹图谱进行评价，结论较为客观、准确。

附图说明

图1为参照物溶液、供试品溶液、空白溶液的特征色谱图；

图2为5批桂枝芍药知母汤中附子特征图谱拟合图；

图3为桂枝芍药知母汤中附子特征图谱对照指纹图谱图；

图4为附子阴性、附子阳性、桂枝芍药知母溶液特征图谱对比图；

图5为指纹图谱测定中200～400nm扫描光谱3D图；

图6检测波长210nm～280nm色谱图；

图7为不同流动相洗脱系统考察色谱图；

图8为不同供试品溶剂处理方法考察色谱图；

图9为固相萃取柱不同载样量对比考察图；

图10为为固相萃取柱一次使用与二次重复使用特征图谱对比图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。

基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围，以下实施例对本发明做进一步的描述，但该实施例并非用于限制本发明的保护范围。

本发明实施例的试药及仪器：

新乌头碱(批号：110799-201608，中国食品药品检定研究院)；次乌头碱(批号：DST200318-058，成都德斯特生物技术有限公司)；苯甲酰新乌头原碱(批号：111795-201805，中国食品药品检定研究院)；苯甲酰次乌头原碱(批号：DST200805-057，成都德斯特生物技术有限公司)；苯甲酰乌头原碱(批号：111794-202006，中国食品药品检定研究院)；磷酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，色谱纯)；盐酸(广州化学试剂厂，分析纯)，氨水(广州化学试剂厂，分析纯)；固相萃取柱(MCX SPE Cartridges 200mg/6ml，广州信谱徕科学仪器有限公司)；桂枝芍药知母汤组合物(自制)，甲醇(美国BCR公司，色谱纯)、乙睛(美国BCR公司，色谱纯)；水为超纯水。

仪器：Waters H-class超高效液相色谱仪；Waters PDA检测器；Empower工作站；Waters Acquity UPLC BEH C18(2.1×150mm，1.7μm)色谱柱；万分之一分析天平(AL104，梅特勒-托利多公司)；十万分之一分析天平(MS105DU，梅特勒-托利多公司)；超声清洗机(KQ-500DE昆山市超声仪器有限公司)；超纯水系统(默克股份有限公司，MILLIPORE SynergyUV)。

实施例1、本发明桂枝芍药知母汤中附子单酯型生物碱成分的检测方法

S1、参照物溶液的制备:

精密称定苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、次乌头碱、新乌头碱混合参照物溶液取苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、次乌头碱、新乌头碱，加体积分数为0.01％的盐酸甲醇溶液溶解制成每1ml含苯甲酰乌头原碱18μg、苯甲酰次乌头原碱17μg、苯甲酰新乌头原碱16μg、次乌头碱19μg和新乌头碱20μg的溶液，作为混合参照物溶液；

S2、供试品溶液的制备:

称取如下饮片：桂枝12g，白芍9g，知母12g，麻黄6g，炮附片6g，防风12g，生姜15g，白术5g，甘草6g；共九味饮片置于5L砂锅中，加1400ml水，浸泡30分钟，加盖，加煮沸，保持微沸至煎液400ml，趁热用350目滤布滤过，即得桂枝芍药知母汤溶液；

精密称定相当于0.5g附子生饮片量的桂枝芍药知母汤溶液，于50ml容量瓶中，加入盐酸溶液和水定容至刻度，使溶液中盐酸浓度为0.1mol/L，密塞，称定重量，然后超声处理(功率400W，频率40kHz)40分钟并持续振摇，放冷，再称定重量，然后用0.1mol/L盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，离心(转速为每分钟5000转)10分钟，滤过，取需续滤液10ml，加在固相萃取柱上，依次以水3ml，氨溶液水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，继续用乙腈-浓氨试液(体积比为90：10)的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压干燥回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈-体积分数0.1％磷酸溶液(体积比为20：80)的混合溶液5ml使溶解，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

S3、检测：

按照如下色谱条件：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，柱温30℃，以乙腈-体积分数为0.1％磷酸溶液为流动相系统进行梯度洗脱，流速控制为0.25ml/min，指纹图谱的检测波长为235nm，理论板数按苯甲酰新乌头原碱计算≥3000，梯度洗脱程序为：

0-2分钟，乙腈5％-16％，体积分数为0.1％的磷酸水溶液95％-84％；

2-13分钟，乙腈16％-35％，体积分数为0.1％的磷酸水溶液84％-65％；

13-17分钟，乙腈35％-60％，体积分数为0.1％的磷酸水溶液65％-40％；

17-22分钟，乙腈60％-95％，体积分数为0.1％的磷酸水溶液40％-5％；

22-26分钟，乙腈95％-5％，体积分数为0.1％的磷酸水溶液5％-95％，

分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液2μl，注入液相色谱仪进行分析，测定，记录色谱图，分别得到参照物色谱图谱和供试品指纹图谱，制得桂枝芍药知母汤附子的标准指纹图谱。

试验例1、方法学考察

(1)专属性试验

分别精密吸取实施例1制备的参照物溶液和供试品溶液以及空白溶剂各1μl，注入液相色谱仪，按照指纹图谱方法测定，结果见图1，发现供试品色谱中与对照品色谱相应位置出现相对应色谱峰，空白样品上没有相应峰，表明阴性无干扰，本发明提供的桂枝芍药知母汤中附子单酯型生物碱成分的检测方法专属性强。

(2)精密度试验

按照指纹图谱精密度规定方法操作，取实施例1制备的桂枝芍药知母汤组合物制备供试品溶液，连续进样6次，将色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”软件计算相似度，结果相似度均在0.95以上，表明本发明中使用的仪器精密度良好。

(3)稳定性试验

按照指纹图谱稳定性测定方法操作，取实施例1制备的桂枝芍药知母汤组合物制备供试品溶液，于制备完成后的第0、4、8、12、20、24h分别进样测定，将色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”软件计算相似度，结果相似度均在0.95以上，表明本发明制备的供试品溶液在制备完成后的24h内稳定性良好。

(4)重复性试验

按照指纹图谱重复性测定方法操作，取实施例1制备的桂枝芍药知母汤组合物制备供试品溶液，共6份，分别进样测定，将色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”软件计算相似度，结果相似度均在0.95以上，表明本发明提供的桂枝芍药知母汤中附子单酯型生物碱成分的检测方法重复性良好。

(5)中间精密度试验

由不同实验人员在不同日期按照指纹图谱重复性测定方法操作，取实施例1制备的桂枝芍药知母汤组合物制备供试品溶液，共6份，分别进样测定，将色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”软件计算相似度，结果相似度均在0.95以上，表明本发明提供的桂枝芍药知母汤中附子单酯型生物碱成分的检测方法中间精密度良好。

以上试验结果表明，本发明提供的桂枝芍药知母汤中附子单酯型生物碱成分的检测方法的专属性强、稳定性良好、重复性良好、中间精密度良好，能作为控制桂枝芍药知母汤附子的质量控制手段。

试验例2、共有峰的确定及对照指纹图谱的建立

(1)试验方法：按照实施例1的供试品制备方法，分别制备5批相当于0.5g生饮片量的桂枝芍药知母汤溶液，然后制备供试品溶液，进样，测定，将5批供试品溶液色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”，采用中位数法进行全谱匹配，确定其共有特征峰为8个，以4号苯甲酰新乌头原碱色谱峰为S峰，计算5批样品共有峰相对保留时间结果如下：

1号峰相对保留时间RRT为0.477，RSD％为0.85％；

2号峰相对保留时间RRT为0.516，RSD％为0.41％；

3号峰相对保留时间RRT为0.833，RSD％为0.84％；

4号峰相对保留时间RRT为1.000，RSD％为0.80％；

5号峰相对保留时间RRT为1.044，RSD％为0.71％；

6号峰相对保留时间RRT为1.063，RSD％为0.68％；

7号峰相对保留时间RRT为1.090，RSD％为0.64％；

8号峰相对保留时间RRT为1.150，RSD％为0.60％

其中，8号S峰是参照物的色谱峰：

采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012年版)对5批桂枝芍药知母汤样品进行拟合(见图2)，生成桂枝芍药知母汤附子对照指纹图谱(见图3)，采用夹角余弦法计算样品相似度，结果表明，5批桂枝芍药知母汤相似度评价结果见下表：

表1、5份桂枝芍药知母汤组合物相似度评价结果

由表1可知，5批桂枝芍药知母汤相似度评价在0.935～0.985之间，相似度较高，表明本发明制备的桂枝芍药知母汤化学成分稳定，对于检测桂枝芍药知母汤中附子单酯型生物碱成分的结论较为客观、准确，精确度更高。

试验例3、附子阳性、桂枝芍药知母汤附子阴性、桂枝芍药知母汤的对比考察

(1)试验方法：分别取相当于0.5g附子生饮片量的附子阳性溶液、桂枝芍药知母汤附子阴性溶液以及桂枝芍药知母汤溶液，按照实施例1的制备供试品溶液制备方法进行制备，分别得到3组供试品溶液，然后按照实施例1的检测步骤进行检测。

(2)试验结果：见图4可知，桂枝芍药知母汤中附子苯甲酰新乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱成分分离较好，且阴性中无明显干扰，表明本发明提供的桂枝芍药知母汤中附子单酯型生物碱成分的检测方法可分离鉴别桂枝芍药知母汤中附子单酯型乌头碱类成分。

对比例1

本对比例与实施例1的区别在于：检测波长的不同，本对比例的检测波长为210nm，其余的步骤、参数等完全相同。

对比例2

本对比例与实施例1的区别在于：检测波长的不同，本对比例的检测波长为254nm，其余的步骤、参数等完全相同。

对比例3

本对比例与实施例1的区别在于：检测波长的不同，本对比例的检测波长为280nm，其余的步骤、参数等完全相同。

对比例4

本对比例与实施例1的区别在于：流动相系统为乙腈-体积分数0.2％醋酸水系统，其余参数、方法等都完全相同。

对比例5

本对比例与实施例1的区别在于：供试品溶液制备方法不同，其余的步骤、参数等完全相同。

本对比例的供试品溶液通过乙醚萃取：称取相当于1.0g附子生饮片量的桂枝芍药知母汤对应实物40g，在60℃以下减压回收溶剂至干，得残渣，然后添加乙醚100ml、氨试液8ml，超声处理30分钟，接着分离乙醚液，乙醚液用稀盐酸振摇提取4次，每次15ml，然后合并提取液，用浓氨试液调节pH值至10，再用乙醚振摇提取4次，每次25ml，然后合并乙醚提取液，蒸干，残渣用无水乙醇溶解成5ml，通过0.22μm微孔滤膜过滤，得到供试品溶液。

对比例6

本对比例与实施例1的区别在于：供试品溶液处理过程中的固相萃取柱为二次重复利用，其余的步骤、参数等全部一样。

本对比例的供试品溶液的制备方法为：将实施例1使用过的固相萃取柱重新预处理后，取相同的续滤液10ml，加在该固相萃取柱上，依次以水3ml、氨溶液(体积比为5：100)、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，继续用乙腈-浓氨试液(体积比为90：10)的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压干燥回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈-0.1％磷酸溶液(20：80)的混合溶液5ml使溶解，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

对比例7

本对比例与实施例1的区别在于：桂枝芍药知母汤溶液的量为1.0g附子生饮片量，其余的步骤、参数等全部一样。

试验例4、指纹图谱色谱条件的考察

(1)检测波长的考察

采用二极管阵列检测器对实施例1制备的供试品溶液进行全波长检测，三维图谱见图5，并同时收集实施例1、对比例1-3的供试品指纹图谱，见图6可知，实施例1的附子成分峰信息量最大，附子相关成分信息体现更为完全，即是波长235nm为检测本发明桂枝芍药知母汤中附子的单酯型生物碱成分指纹图谱的最佳检测波长。

(2)色谱系统的考察

分析实施例1和对比例4的供试品指纹图谱检测，见图7可知：实施例1的指纹图谱的基线平稳，色谱峰峰型和分离效果明显优于对比例4，所以流动相乙腈-体积分数0.1％的磷酸水为本发明的最佳流动相。

试验例5、供试品溶液制备方法的考察

(1)乙醚萃取供试品制备方法和固相萃取供试品制备方法对桂枝芍药知母汤组合物的附子指纹图谱的提取效果考察

将实施例1、对比例5得到的附子指纹图谱进行比较，见图8可知，对比例5得到的附子指纹图谱，虽然峰分离较好，但方法操作复杂，且会使用到乙醚等危险试剂；而实施例1的附子指纹图谱的峰分离效果最佳，峰形较好，且所用溶剂较为常用，说明本发明选择固相萃取对桂枝芍药知母汤中附子的单酯型生物碱成分的检测效果更好；

(2)固相萃取柱载样量考察

将实施例1、对比例7得到的附子指纹图谱进行比较，见图9可知，对比例7的指纹图谱中的附子单酯型生物碱总峰面积为实施例1的指纹图谱的附子单酯型生物碱总峰面积的1.60，峰4和峰8分别为附子的1.57和1.64，不成线性关系，说明本发明采用0.5g附子生饮片量的桂枝芍药知母汤溶液组合物在固相萃取柱上未载样过量；

(3)固相萃取柱二次利用的考察

将实施例1、对比例6得到的附子指纹图谱进行比较，见图10可知，实施例1与对比例6得到的附子指纹图谱的总峰面积虽然差别不大，但是对比例6的峰4分离的峰形较差，出现双峰情况，所以说明本发明采用固相萃取柱一次性使用制备供试品溶液对于检测桂枝芍药知母汤中附子单酯型生物碱成分的精密度更好。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (9)

1.一种桂枝芍药知母汤中附子生物碱成分的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、参照物溶液的制备：精密称定苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、次乌头碱、新乌头碱，分别加入盐酸甲醇溶液，制成每1ml含苯甲酰乌头原碱5μg-20μg、苯甲酰次乌头原碱5μg-20μg、苯甲酰新乌头原碱5μg-20μg、次乌头碱5μg-20μg和新乌头碱5μg-20μg的混合参照物溶液；

S2、供试品溶液的制备：称取桂枝芍药知母汤溶液，加入盐酸溶液和水定容至刻度，使溶液中盐酸浓度为0.1mol/L，密塞，称定重量，然后超声处理并持续振摇，放冷，再称定重量，然后用盐酸溶液补足减失的重量，摇匀离心，滤过，取需续滤液10ml，加在固相萃取柱上，依次以水、氨溶液、甲醇、乙腈洗脱，待洗脱液流尽后，放置，继续用乙腈-浓氨试液洗脱，收集洗脱液，减压干燥回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈-0.1%磷酸溶液溶解，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

S3、检测：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液1～2μl，注入液相色谱仪进行分析，测定，记录色谱图，分别得到参照物色谱图谱和供试品指纹图谱，制得桂枝芍药知母汤附子的标准指纹图谱；

所述步骤S2中的固相萃取柱是以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，200mg/6ml；

所述步骤S3的色谱分析条件为：采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱型号为：Waters Acquity UPLC BEHC18，规格为：2.1×150mm，1.7μm，柱温为30℃，以乙腈-体积分数为0.1％磷酸溶液为流动相系统进行梯度洗脱，流速控制为0.25ml/min，指纹图谱的检测波长为235nm，理论板数按苯甲酰新乌头原碱计算≥3000，梯度洗脱程序为：

0-2分钟，乙腈5%-16%，体积分数为0.1%的磷酸水溶液95%-84%；

2-13分钟，乙腈16%-35%，体积分数为0.1%的磷酸水溶液84%-65%；

13-17分钟，乙腈35%-60%，体积分数为0.1%的磷酸水溶液65%-40%；

17-22分钟，乙腈60%-95%，体积分数为0.1%的磷酸水溶液40%-5%；

22-26分钟，乙腈95%-5%，体积分数为0.1%的磷酸水溶液5%-95%。

2.如权利要求1所述的桂枝芍药知母汤中附子生物碱成分的检测方法，其特征在于，所述步骤S2中的乙腈-浓氨试液中乙腈与浓氨的体积比为90:10。

3.如权利要求1所述的桂枝芍药知母汤中附子生物碱成分的检测方法，其特征在于，所述步骤S2中的乙腈-0.1%磷酸溶液中乙腈与磷酸的体积比为20：80。

4.如权利要求1所述的桂枝芍药知母汤中附子生物碱成分的检测方法，其特征在于，所述固相萃取柱为以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂200mg/6ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱，且所述固相萃取柱为一次性使用。

5.如权利要求1所述的桂枝芍药知母汤中附子生物碱成分的检测方法，其特征在于，所述桂枝芍药知母汤溶液的量为0.5g附子生饮片量。

6.如权利要求1所述的桂枝芍药知母汤中附子生物碱成分的检测方法，其特征在于，所述桂枝芍药知母汤按如下方法制备：

按重量份计称取如下饮片：桂枝12g，白芍9g，知母12g，麻黄6g，炮附片6g，防风12g，生姜15g，白术5g，甘草6g；共九味饮片置于砂锅中，加1400ml水，浸泡，加盖，煮沸，保持微沸至煎液400ml，趁热过滤，即得桂枝芍药知母汤溶液。

7.如权利要求1所述的桂枝芍药知母汤中附子生物碱成分的检测方法，其特征在于，所述步骤S3的标准指纹图谱包括8个特征峰，以4号峰苯甲酰新乌头原碱色谱峰为S峰，各特征峰的相对保留时间分别为：1号峰相对保留时间 RRT为0.477，2号峰相对保留时间 RRT为0.516，3号峰相对保留时间 RRT为0.833，4号（S）峰相对保留时间 RRT为1.000，5号峰相对保留时间 RRT为1.044，6号峰相对保留时间 RRT为1.063，7号峰相对保留时间 RRT为1.090和8号峰相对保留时间 RRT为1.150。

8.如权利要求1所述的桂枝芍药知母汤中附子生物碱成分的检测方法，其特征在于，所述步骤S3的标准指纹图谱中的4、8号色谱峰分别与苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱参照物色谱峰保留时间相对应。

9.权利要求1-8任一项所述的桂枝芍药知母汤中附子生物碱成分的检测方法在桂枝芍药知母汤中附子的质量检测和质量控制中的应用。