CN107607653B

CN107607653B - 测定玄参提取物指纹图谱的方法

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Publication number: CN107607653B
Application number: CN201711097516.2A
Authority: CN
Inventors: 王红敏; 盛卫国; 范明松; 刘承伟; 何爱琴
Original assignee: Yangtze River Pharmaceutical Group Co Ltd
Current assignee: Yangtze River Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority date: 2017-11-08
Filing date: 2017-11-08
Publication date: 2020-09-04
Anticipated expiration: 2037-11-08
Also published as: CN107607653A

Abstract

一种测定玄参提取物指纹图谱的方法。该方法以水作为提取溶剂制备玄参提取物，以玄参提取物为检测对象，建立了针对玄参药材、饮片、提取物和制剂的指纹图谱方法，获得了较为全面的图谱信息，确认了玄参提取物的共有峰10个，其中6个峰得到指认。结合该指纹图谱中多个色谱峰的信息，能够全面地、快速地检测其质量，有利于其全面质量检测和质量控制。本发明提供的方法对于指导在临床用药及生产过程中对于原料药有效的投料指导、确保质量的可靠具有积极作用；操作简便、快捷，对中药玄参提取物质量进行评价，结论较为客观、准确。

Description

测定玄参提取物指纹图谱的方法

技术领域

本发明涉及一种识别化合物方法，尤其涉及一种获得提取自玄参提取物指纹图谱的方法，以实现对利用玄参开发药物的质量监测，使得检测过程更稳定。

背景技术

玄参为玄参科植物玄参(Scrophularia ningpoensis Hemsl.)的干燥根。性甘、苦、咸，微寒。归肺、胃、肾经。功能清热凉血，滋阴降火，解毒散结。用于热入营血，温毒发斑，热病伤阴，舌绛烦渴，津伤便秘，骨蒸劳嗽，目赤，咽痛，白喉，瘰疬，痈肿疮毒。始载于《神农本草经》，被列为中品。玄参在传统方剂中有大量应用，如养阴清肺汤、清营汤、百合固金汤等。同时玄参在《中华人民共和国药典》收录的现代中成药中也有广泛使用，如养阴清肺膏、清热解毒口服液、清瘟解毒丸等。

玄参中主要含环烯醚萜类、苯丙素苷类和芳香糖苷类等成分。其中，环烯醚萜苷类化合物哈巴苷(C₁₅H₂₄O₁₀)和哈巴俄苷(C₂₄H₃₀O₁₁)为《中国药典》规定的含测指标成分。然而仅测定某类成分的含量，难以客观、有效地评价或控制玄参药材的质量。中国发明专利ZL200810184570.5公开了一种玄参配方颗粒及其制备方法和质量控制方法，将红外光谱技术应用于中药的质量控制，快速地解决了中药宏观质量控制中的一个首要问题——中药真伪的鉴定，但是该方法所采用的红外指纹图谱进行质量鉴别，其专属性不强。中国发明专利申请201610423663.3公开了一种建立玄参的药物制剂的指纹图谱的方法，采用高效液相法建立指纹图谱，获得了哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸等化合物的3个色谱峰，但特征峰较少。此外，采用通用的反相C-18柱，使得分析所用的时间偏长。因此，建立一种能够快速全面地、快速地检测玄参提取物的方法，对于其全面质量检测和整体质量控制具有重要意义。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种测定玄参提取物指纹图谱的方法，该方法可有效地监控玄参药材、饮片、中间品和制剂的质量，保证其在临床或生产应用时的有效、安全和稳定。

本发明提供的一种测定玄参提取物指纹图谱的方法，包括：

取玄参提取物，加水，35KHz～60KHz超声提取2分钟～10分钟，过滤(如：采用孔径为0.22μm滤膜过滤)，取续滤液，即得供试品溶液；

取哈巴苷对照品、哈巴俄苷对照品、毛蕊花糖苷对照品、桃叶珊瑚苷对照品、安格洛苷C对照品和肉桂酸对照品，制成对照品溶液；

将供试品溶液和对照品溶液分别吸取2μl，分别于高效液相色谱仪上样，流速为0.7ml·min^-1，检测波长205nm～215nm，流动相A为0.03v/v％磷酸水溶液，流动相B为乙腈，采用流动相A和流动相B相混合的洗脱方式洗脱，流动相B在各个洗脱时间的用量变化如下：

0min～5min：流动相B为2v/v％，

5min～12min：流动相B由2v/v％提高至10v/v％，

12min～25min：流动相B由10v/v％提高至33v/v％，

25min～30min：流动相B由33v/v％提高至35v/v％，

30min～32min：流动相B为35v/v％。

一种玄参提取物的获取方式如：取玄参饮片，加9倍量水，浸泡0.5小时～1小时，加热提取0.5小时～2小时，即一煎；一煎后，按玄参饮片7倍量向药渣加水，提取0.5小时～2小时，即二煎；合并一煎和二煎的药液，减压浓缩干燥，得玄参提取物。

另一种玄参提取物的获取方式如：取玄参饮片，加9倍量水，浸泡0.5小时～1小时，加热提取0.5小时～2小时，即一煎；一煎后，按玄参饮片7倍量向药渣加水，提取0.5小时～2小时，即二煎；合并一煎和二煎的药液，减压浓缩至相对密度1.00～1.15的浓缩液，浓缩液真空冷冻干燥，得玄参提取物。

另一种玄参提取物的获取方式如：取玄参饮片，加9倍量水，浸泡0.5小时～1小时，加热提取0.5小时～2小时，即一煎；一煎后，按玄参饮片7倍量向药渣加水，提取0.5小时～2小时，即二煎；合并一煎和二煎的药液，减压浓缩至相对密度1.00～1.15的浓缩液，浓缩液喷雾干燥，得玄参提取物。

本发明提供的测定玄参提取物指纹图谱的方法，所用玄参提取物与水的比例为：1g(生药量)∶25ml～50ml。

每ml对照品溶液中分别含浓度10g/ml～100g/ml哈巴苷对照品、浓度10g/ml～100g/ml哈巴俄苷对照品、浓度10g/ml～100g/ml毛蕊花糖苷对照品、浓度10g/ml～100g/ml桃叶珊瑚苷对照品、浓度10g/ml～100g/ml安格洛苷C对照品和浓度10g/ml～100g/ml肉桂酸对照品。对照品溶液以甲醇溶液为溶剂，优先选择30v/v％以上甲醇溶液或甲醇。

高效液相色谱仪以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，规格为4.6mm×100mm，填料粒度为2.7μm。

玄参提取物指纹图谱中10个色谱峰被确定为共有色谱峰，通过与对照品保留时间的比较，确定相对保留时间0.407±1％的峰2为桃叶珊瑚苷，相对保留时间0.477±1％的峰3为哈巴苷，相对保留时间0.817±1％的峰5为毛蕊花糖苷，相对保留时间0.882±1％的峰8为安格洛苷C，相对保留时间1.000±1％的峰9为哈巴俄苷，以及相对保留时间1.054±1％的峰10为肉桂酸。

本发明技术方案实现的有益效果：

本发明测定玄参提取物指纹图谱的方法，特玄参药材、饮片的指纹图谱进行了研究，建立了玄参液相指纹图谱测定条件，并进行了方法学考察。

本发明提供的方法，根据6个产地13批样品，制定了玄参提取物液相指纹图谱标准，在生产过程中可有效的指导投料、规范生产操作，真正确保了临床用药的安全、有效、可靠。对所测得的指纹图谱的辨认，采用国家药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价系统，操作方便、快捷，以其得出的相似度结果，对药材指纹图谱进行评价，结论较为客观、准确。

附图说明

图1为本发明提供的对照品指纹图谱；其中，峰1为桃叶珊瑚苷，峰2为哈巴苷，峰3为毛蕊花糖苷，峰4为安格洛苷C，峰5为哈巴俄苷，峰6为肉桂酸；

图2为本发明提供的测定方法应用于13个批次玄参提取物而得到的指纹图谱；

图3为本发明测定玄参提取物的标准指纹图谱；其中，峰2为桃叶珊瑚苷，峰3为哈巴苷，峰5为毛蕊花糖苷，峰8为安格洛苷C，峰9为哈巴俄苷，峰10为肉桂酸。

具体实施方式

以下详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

实施例1 玄参药材采集

玄参采集信息如下表1

表1

实施例2 获得玄参提取物指纹图谱

(1)实验仪器、试剂及样品

对照品：哈巴苷、哈巴俄苷、桃叶珊瑚苷、毛蕊花糖苷、安格洛苷C和肉桂酸(中国药品生物制品检定研究院)。

仪器：Agilent 1260型高效液相色谱仪

(2)色谱条件及方法验证

①波长选择

玄参主要的活性成分为环烯醚萜类化合物，由于分子母核结构中缺少共轭双键类结构，大部分环烯醚萜类化合物，如：哈巴苷，在250nm以上的波长处没有吸收，因此在280nm～290nm波长下测得的玄参提取物的指纹图谱会丢失很多峰信息，故检测波长定为210nm。

②流动相选择

玄参指纹图谱所用流动相系统多为乙腈-磷酸水系统、乙腈-甲酸水系统、甲醇-甲酸水系统、甲醇-乙酸水系统，考虑到在210nm检测条件下，甲醇、甲酸、乙酸有背景吸收，因此有机相定为乙腈-磷酸水系统。

③色谱柱的选择

分别对比了不同厂家和不同型号的色谱柱Merck LiChrospher 100 RP-C18(4.0×250mm，5μm)、Phenomenex Luna C18(4.6×250mm，5μm)、Agilent Eclipse XDB-C18(4.6×250mm，5μm)、Agilent Infinitylab Poroshell 120SB-C18(4.6×100mm，2.7μm)、WatersXselect HSS T3(4.6×250mm，5μm)、Waters Cortecs C18(4.6×150mm，2.7μm)、WatersCortecs C18(4.6×100mm，2.7μm)，结果表明：采用色谱柱Agilent InfinitylabPoroshell 120SB-C18(4.6×100mm，2.7μm)和Waters Cortecs C18(4.6×100mm，2.7μm)色谱峰峰型好，分离度高，且分析时间短。

④洗脱梯度的设定

洗脱梯度最终确定为：流动相为0.03v/v％磷酸水溶液(A)-乙腈(B)；洗脱条件为：0～5min：2％B→2％B，5～12min：2％B→10％B，12～25min：10％B→33％B，25～30min：10％B→33％B，30～32min：35％B→35％B。

⑤供试品溶液的制备

取生药量1g的玄参冻干粉，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加水50ml，超声(35KHz，280W)提取10min，放冷，补足减失的溶剂重量，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

⑥对照品溶液的制备

取哈巴苷对照品、哈巴俄苷、桃叶珊瑚苷、毛蕊花糖苷、安格洛苷C和肉桂酸对照品适量，精密称定，加30v/v％甲醇制成每1ml含哈巴苷60μg、哈巴俄苷20μg、桃叶珊瑚苷50μg、毛蕊花糖苷20μg、安格洛苷C80μg、肉桂酸10μg的混合溶液，摇匀，即得。

(3)色谱条件

以十八硅烷基建和硅胶为填充剂；流动相为0.03v/v％磷酸水溶液(A)-乙腈(B)；洗脱条件为：0～5min：2％B→2％B，5～12min：2％B→10％B，12～25min：10％B→33％B，25～30min：10％B→33％B，30～32min：35％B→35％B；流速为0.7ml·min^-1，进样体积为2μl；检测波长210nm。理论塔板数按哈巴俄苷计算应不低于5,000。

或色谱柱为Waters Cortecs C18(4.6×150mm，2.7μm)色谱柱；柱温为25℃；流动相为0.03％磷酸水溶液(A)-乙腈(B)；洗脱条件为：0～7.5min：2％B→2％B，7.5～18min：2％B→10％B，18～37.5min：10％B→33％B，37.5～48min：10％B→33％B，48～50min：35％B→35％B；流速为0.7ml·min-1，进样体积为2μl；检测波长210nm；

或色谱柱为Agilent Infinitylab Poroshell 120SB-C18(4.6×100mm，2.7μm)色谱柱；柱温为25℃；流动相为0.03v/v％磷酸水溶液(A)-乙腈(B)；洗脱条件为：0～5min：2％B→2％B，5～12min：2％B→10％B，12～25min：10％B→33％B，25～30min：10％B→33％B，30～32min：35％B一35％B；流速为0.7ml·min-1，进样体积为2μl；检测波长210nm。

(4)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，分别得到供试品溶液和对照品溶液的液相色谱图。

(5)利用国家药典委员会中药指纹图谱相似度评价系统，供试品溶液和对照品溶液的液相色谱图分别经过数据导入，多点校正和数据匹配，即得对照指纹图谱。

实施例3 方法验证

取提取物供试品溶液，连续进样6次，考察色谱峰的相对保留时间、相对峰面积比值的一致性，从而考察仪器的精密度，试验结果如表1～3所示。结果表明，各共有峰的相对保留时间比值的RSD值在1％以内，相对峰面积比值RSD值在3％以内，相似度＞0.99，表明仪器的精密度良好。

表1 玄参提取物指纹图谱方法学考察精密度试验结果(相对保留时间)

表2 玄参提取物指纹图谱方法学考察精密度试验结果(相对峰面积)

表3 玄参提取物指纹图谱方法学考察精密度试验结果(相似度)

(2)稳定性试验

取提取物供试品溶液，分别在0h、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、16h、20h、24h进行检测，以考察样品在24小时的稳定性，结果如表4～6所示。结果表明，各共有峰的相对保留时间比值的RSD值均小于2％，相似度大于0.90，说明样品溶液在24h内基本稳定。

表4 玄参提取物指纹图谱方法学考察稳定性试验结果(相对保留时间)

表5 玄参提取物指纹图谱方法学考察稳定性试验结果(相对峰面积)

表6 玄参提取物指纹图谱方法学考察稳定性试验结果(相似度)

(3)重复性试验

取同批玄参饮片6份，分别制备其提取物干粉，按照选定方法制备其供试品溶液，并按照选定的色谱条件进行检测，结果见表7～9所示。各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD值均小于3％，表明重复性良好。

表7 玄参提取物指纹图谱方法学考察重复性试验结果(相对保留时间)

表8 玄参提取物指纹图谱方法学考察重复性试验结果(相对峰面积)

表9 玄参提取物指纹图谱方法学考察重复性试验结果(相似度)

以上方法学考察结果表明，用本实施例提供的方法测定玄参提取物的指纹图谱，仪器精密度、样品稳定性、方法重复性均较好，能够准确测定该提取物的指纹图谱。

实施例四不同产地玄参提取物指纹图谱的相似度评价

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本)对13个批次玄参提取物指纹图谱进行相似度计算，结果见表10和表11。

表10 6个产地13批玄参提取物指纹图谱相对保留时间

表11 6个产地13批玄参提取物指纹图谱相似度计算结果

编号	对照指纹图谱
		1	0.930
2	0.980
		3	0.960
4	0.971
		5	0.942
6	0.947
		7	0.946
8	0.979
		9	0.950
10	0.939
		11	0.971
12	0.953
		13	0.952

Claims

1.一种测定玄参提取物指纹图谱的方法，其特征在于包括如下步骤：

取玄参提取物，加水，35KHz～60KHz超声提取2分钟～10分钟，过滤，取续滤液，即得供试品溶液，按生药量，所述的玄参提取物与所述水的比例为：1g∶25ml～50ml；

0min～5min：流动相B为2v/v％，

5min～12min：流动相B由2v/v％提高至10v/v％，

12min～25min：流动相B由10v/v％提高至33v/v％，

25min～30min：流动相B由33v/v％提高至35v/v％，

30min～32min：流动相B为35v/v％；

所述的玄参提取物的获取方式为：

取玄参饮片，加9倍量水，浸泡0.5小时～1小时，加热提取0.5小时～2小时，即一煎；一煎后，按玄参饮片7倍量向药渣加水，提取0.5小时～2小时，即二煎；合并一煎和二煎的药液，减压浓缩干燥，得玄参提取物；

所述的玄参来自6个产地，湖北恩施建始县龙坪镇、湖北恩施巴东县绿葱坡、重庆南川、贵州道真、浙江磐安和陕西镇坪；

2.根据权利要求1所述的测定玄参提取物指纹图谱的方法，其特征在于所述的玄参提取物的获取方式为：

取玄参饮片，加9倍量水，浸泡0.5小时～1小时，加热提取0.5小时～2小时，即一煎；一煎后，按玄参饮片7倍量向药渣加水，提取0.5小时～2小时，即二煎；合并一煎和二煎的药液，减压浓缩至相对密度1.00～1.15的浓缩液，浓缩液真空冷冻干燥，得玄参提取物。

3.根据权利要求1所述的测定玄参提取物指纹图谱的方法，其特征在于所述的玄参提取物的获取方式为：

取玄参饮片，加9倍量水，浸泡0.5小时～1小时，加热提取0.5小时～2小时，即一煎；一煎后，按玄参饮片7倍量向药渣加水，提取0.5小时～2小时，即二煎；合并一煎和二煎的药液，减压浓缩至相对密度1.00～1.15的浓缩液，浓缩液喷雾干燥，得玄参提取物。

4.根据权利要求1所述的测定玄参提取物指纹图谱的方法，其特征在于每ml所述的对照品溶液中分别含浓度10g/ml～100g/ml哈巴苷对照品、浓度10g/ml～100g/ml哈巴俄苷对照品、浓度10g/ml～100g/ml毛蕊花糖苷对照品、浓度10g/ml～100g/ml桃叶珊瑚苷对照品、浓度10g/ml～100g/ml安格洛苷C对照品和浓度10g/ml～100g/ml肉桂酸对照品。

5.根据权利要求1所述的测定玄参提取物指纹图谱的方法，其特征在于所述的对照品溶液以甲醇溶液为溶剂，所述的甲醇溶液为30v/v％以上甲醇溶液或甲醇。

6.根据权利要求1所述的测定玄参提取物指纹图谱的方法，其特征在于所述的高效液相色谱仪以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，规格为4.6mm×100mm，填料粒度为2.7μm。