CN1670529B - 一种复方血栓通制剂hplc指纹图谱的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及以天然植物药材原料制成的复方血栓通制剂HPLC指纹图谱的构建方法，包括供试品溶液的制备；对照品溶液的制备；用高效液相色谱仪测定，以对照品的色谱峰相对保留时间和峰面积为1，计算供试品相对保留时间和相对峰面积，即得到复方血栓通制剂HPLC指纹图谱。并由此方法所得到的复方血栓通制剂HPLC标准指纹图谱在203nm下归属于三七的指纹图谱具有5个共有峰；归属于黄芪的指纹图谱具有2个共有峰；归属于丹参的指纹图谱具有2个共有峰；归属于玄参的指纹图谱具有2个共有峰；在270nm下归属于丹参的指纹图谱具有3个共有峰；归属于玄参的指纹图谱具有1个共有峰。

Description

一种复方血栓通制剂HPLC指纹图谱的构建方法
技术领域
本发明涉及以天然植物药材原料制成的复方血栓通制剂HPLC指纹图谱的构建方法，以及由此方法所得到的复方血栓通制剂HPLC标准指纹图谱。
背景技术
中药指纹图谱是指某种或某几种中药材中所共有的，具有特征性的某类成分的色谱或光谱的图谱。当前，中药指纹图谱质量控制技术作为控制中药质量均一性和稳定性的检测手段，是中药现代化的关键技术之一，这对有效地控制中药材的质量有重要意义。色谱指纹图谱质量控制技术是当前中药质量研究的亮点。对于成份复杂的中药，过去那种以单一有效成份作为其质量控制指标的做法是不全面的，用“盲人摸象”做比喻是再贴切不过的了。而色谱指纹图谱质量控制模式则以色谱分析为手段，从中获取反映中药内在质量的信息，通过对指纹特征的分析比较，评价中药内在质量的真实性、一致性和稳定性，这是现阶段综合评价中药质量的最优技术，国家药品监督管理局已要求中药制剂实施指纹图谱质量控制。据报道，日本汉方药主要生产企业在于20世纪80年代就已经在企业内部采用液相指纹图谱控制质量，美国、德国、法国等国家亦对植物草药采用指纹图谱质量控制技术。随着中医中药的推广应用，指纹图谱作为中草药及其提取物质量控制方法，目前已为国际所共识。但目前中药植物的指纹图谱往往采用单一植物，例如中国专利申请CN1233951A丹参药材指纹图谱建立的方法及其标准指纹图谱。对多种中药材合成的中成药复方制剂的质量图谱研究仍处于起步阶段。复方血栓通制剂是纯中药制剂，由三七、黄芪、丹参、玄参四味药材组成，具有活血化瘀，益气养阴的功效，用于治疗血瘀兼气阴两虚证的视网膜静脉栓塞以及用于血瘀兼气阴两虚的稳定性劳累型心绞痛。复方血栓通胶囊生产时采用50％乙醇提取工艺，故其成品中成分既有水溶性成分又有脂溶性成分，成分复杂，极性相差大，质量标准项下采用TLC分别以三七、黄芪、丹参的对照药材和原儿茶醛对照品在各特定色谱条件下的薄层斑点为对照鉴别，并采用薄层扫描测定人参皂苷Rg1和Rb1的总量，其不足之处在于：
1、没有对四味药材中的化学成分进行全面、系统的检测。
2、没有对玄参进行检测。
3、不能全面监控中间体，成品的质量。
4、不能监控生产工艺的稳定性。
发明内容
本发明的目的是克服上述现有技术中的不足之处而提供一种通过对复方血栓通制剂HPLC指纹图谱的研究，摸索出一种复方血栓通制剂药材的质量控制方法，该指纹图谱质量控制方法能全面反映复方血栓通制剂的质量，还可依据成品、半成品的指纹图谱的变化来追根溯源寻找工艺操作中的问题。并采用HPLC线性梯度洗脱在一个流动相系统首次利用不同检测波长，同时检出复方中的全部四味药材成分，从色谱峰的特征和相似度结果判断复方血栓通制剂样品的合格与否，从整体上全面反映药材内在质量的复方血栓通制剂HPLC指纹图谱的构建方法，本发明还提供了复方血栓通制剂的标准指纹图谱。
本发明的目的可以通过以下措施来达到：这种复方血栓通制剂HPLC指纹图谱的构建方法，其特殊之处在于它包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：精密称取复方血栓通制剂0.1g～10.0g，用50％～100％甲醇提取1～3次，每次10～60分钟，每次10～100ml，滤过，合并滤液，蒸干，适当净化，用甲醇配成供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：精密称取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、三七皂苷R1、丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮IIA、哈帕酯苷适量，加乙腈使溶解，分别制成对照品溶液：人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1，人参皂苷Re，三七皂苷R1分别为1mg/ml，隐丹参酮、丹参酮IIA分别为0.2mg/ml，丹参酮I为0.5mg/ml，哈帕酯苷为0.1mg/ml；
(3)复方血栓通制剂HPLC指纹图谱的测定：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，进样，用高效液相色谱仪测定，以对照品的色谱峰相对保留时间和峰面积为1，计算供试品的相对保留时间和相对峰面积，即得到复方血栓通制剂HPLC指纹图谱。
所述高效液相色谱仪中的色谱柱，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：水∶乙腈，水(％)85～43∶乙腈(％)15～57；线性梯度洗脱；T(min)：0～180；柱温：10～50℃；检测波长：203nm，270nm。
供试品指纹图谱采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行评价，各检测波长下的相似度均大于0.80。
其成分之一的三七、玄参、黄芪、丹参四味药材的HPLC指纹图谱的构建方法，与复方血栓通制剂具有相同的检测条件并分别得到各自药材的指纹图谱。
复方血栓通制剂的剂型是任何一种药剂学上所说的剂型。
本发明的目的还可以通过以下措施来达到：这种利用权利要求1所述复方血栓通制剂HPLC指纹图谱的构建方法得到的HPLC指纹图谱，其特殊之处在于，所述复方血栓通制剂HPLC指纹图谱在203nm下归属于三七的指纹图谱具有14个特征峰；归属于黄芪的指纹图谱具有2个特征峰；归属于丹参的指纹图谱具有2个特征峰；归属于玄参的指纹图谱具有3个特征峰；在270nm下归属于丹参的指纹图谱具有3个特征峰；归属于玄参的指纹图谱具有1个特征峰；所述图谱的图形如说明书附图中的图1、图2所示的图谱。
本发明的目的还可以通过以下措施来达到：这种利用权利要求1所述复方血栓通制剂HPLC指纹图谱的构建方法得到的HPLC指纹图谱，其殊之处在于，
所述复方血栓通制剂HPLC指纹图谱203nm的共有峰为〔1〕、〔2〕、〔3〕、〔4〕、〔7〕、〔8〕、〔11〕、〔14〕、〔17〕、〔31〕、〔39〕11个峰；其中：归属于三七的共有峰为〔2〕、〔3〕、〔4〕、〔14〕、〔17〕5个峰；归属于玄参的共有峰为〔1〕、〔8〕2个峰；归属于黄芪的共有峰为〔7〕、〔11〕2个峰；归属于丹参的共有峰为〔31〕、〔39〕2个峰；所述图谱的图形如说明书附图中的图1所示的图谱；
所述复方血栓通制剂HPLC指纹图谱270nm的共有峰为〔2〕、〔4〕、〔5〕、〔6〕4个峰，归属于玄参的共有峰为〔2〕号峰；归属于丹参的共有峰为〔4〕、〔5〕、〔6〕3个峰。所述图谱的图形如说明书附图中的图2所示的图谱。由HPLC指纹图谱各指纹特征峰共同组成了复方血栓通制剂的指纹图谱特征，可以完整的对复方血栓通制剂所含的4味植物药材作出色谱鉴定。
利用DAD检测器对主要峰进行峰纯度检查，通过UV吸收曲线的比较确定：
203nm：1号峰为安格洛苷，2号峰为三七皂苷R1、3号峰为人参皂苷Rg1、4号峰为人参皂苷Re、14号峰为人参皂苷Rb1、8号峰为哈帕酯苷、31号峰为隐丹参酮、39号峰为丹参酮IIA；
270nm：2号峰为哈帕酯苷、4号峰为隐丹参酮、5号峰为丹参酮I、6号峰为丹参酮IIA。
本发明相比现有技术具有如下优点：
1、HPLC线性梯度洗脱在一个流动相系统首次利用不同检测波长，同时检出复方中的全部四味药材。
2、更全面地监控原料药材、中间体和成品的质量，监控生产工艺的稳定性。
3、该法建立的指纹图谱适用于国产柱和进口柱，不同的仪器，即具有良好的重现性和更好的适用性。
4、选用HPLC作为检测方法，超声法作为提取方法，固相萃取作为纯化方法，选用的方法和试验条件易于推广、便于执行，即具有良好的可行性。
5、该法建立的指纹图谱能够表达该产品的特征(包括8个已知成分，都为纯)，即具有良好的专属性。
6、更加准确、全面地评价其质量，为更加合理、规范使用药材提供科学依据。
7、所建立的指纹图谱涵盖了部版标准及药典标准，而且比它们有所提高(可以进行定量)。
8、固相萃取法净化效果好、回收率高、重现性好，所需溶剂少。
9、本发明制作该指纹图谱的方法简单、准确可靠、适用于复方血栓通制剂的质量控制。
附图说明
图1是复方血栓通胶囊203nm的HPLC参照指纹图谱。
图2是复方血栓通胶囊270nm的HPLC参照指纹图谱。
图3是203nm归属于三七的共有峰UV扫描图。
图4是270nm归属于黄芪的共有峰UV扫描图。
图5是270nm归属于丹参的共有峰UV扫描图。
图6是203nm，270nm归属于玄参的共有峰UV扫描图。
图7是复方血栓通胶囊精密度(203nm)结果示意图。
图8是复方血栓通胶囊精密度(270nm)结果示意图。
图9是复方血栓通胶囊稳定性(203nm)结果示意图。
图10是复方血栓通胶囊稳定性(270nm)结果示意图。
图11是复方血栓通胶囊重现性(203nm)结果示意图。
图12是复方血栓通胶囊重现性(270nm)结果示意图。
图13是复方血栓通胶囊成品(203nm)指纹图谱相似度示意图。
图14是复方血栓通胶囊成品(270nm)指纹图谱相似度示意图。
图15是270nm归属于玄参的共有峰UV扫描图。
图16是玄参指纹图谱峰纯度的主要色谱图。
图17是玄参指纹图谱的色谱峰。
图18是玄参指纹图谱相似度结果的色谱图。
图19是三七指纹图谱各共有峰紫外扫描曲线图。
图20是三七指纹图谱色谱峰示意图。
图21是三七指纹图谱相似度结果示意图。
图22是丹参指纹图谱各共有峰紫外扫描曲线示意图。
图23是丹参指纹图谱丹参指纹(270nm)图谱。
图24是丹参指纹图谱相似度结果示意图。
图25是黄芪指纹图谱的色谱峰。
图26是黄芪指纹图谱各共有峰紫外扫描曲线示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详述：
复方血栓通制剂包括：胶囊剂(软胶囊、硬胶囊)、片剂、滴丸剂、合剂等口服制剂，并由玄参、三七、丹参、黄芪四种组份制成。
实施例1：复方血栓通胶囊HPLC指纹图谱的构建方法及复方血栓通胶囊HPLC指纹图谱
1、仪器与试药
1.1仪器
电子分析天平；超声波清洗器；旋转蒸发仪；超纯水器；ODS固相萃取小柱；液相色谱仪；高效液相色谱-质谱系统的色谱仪；紫外检测器；质谱检测器。
色谱柱：
①Merck Lichrospher Rp-18e：5μm，250×4.0mm；
②Agilent Hypersil：5μm，250×4.0mm；
③依利特Lichrosorb Rp-18e：5μm，250×4.6mm；
④迪马Diamonsil C18：5μm，250×4.6mm；
⑤大连依利特Hypersil C18：5μm，250×4.0mm
1.2试药
对照品
对照药材
2、方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱：高效液相色谱仪中的色谱柱，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：水∶乙腈，水(％)85~43∶乙腈(％)15~57；线性梯度洗脱；T(min)：0~180；柱温：30℃；检测波长：203nm，270nm。
根据成品工艺，主要成分包括了从极性较大的皂苷到极性较小的丹参酮，故使用ODS柱。
根据文献，人参皂苷Rg1和人参皂苷Re很难分离，因此，采用这两个峰作为衡量色谱柱的指标。
比较色谱柱：Agilent Hypersil：5μm，250×4.0mm；
            Merck Lichrospher Rp-18e：5μm，250×4.0mm；
            Diamonsil C18：5μm，250×4.6mm；
            Elite Lichrosorb Rp-18e：10μm，250×4.6mm；
            Hypersil C18：5μm，250×4.0mm
发现Agilent色谱柱(Hypersil填料)的理论塔板数以人参皂苷Rb1计算不小于90000，可使人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的分离度达到1.0；
两者的分离度达不到1.0时，分离度变化前后相似度差别＜0.02。
除了这两个峰，其他色谱峰采用不同色谱柱后分离度和基线无明显差别。
3、指纹图谱测定
3.1指纹图谱制备
(1)供试品溶液的制备：精密称取复方血栓通胶囊内容物1.5g，用70％甲醇30ml超声提取2次，每次30分钟，滤过，滤液回收溶剂至近干，用水2ml溶解样品上固相萃取小柱，加6ml水分次淋洗，淋洗液弃去，用10ml甲醇分次洗脱，洗脱液收集至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：精密称取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、三七皂苷R1、丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮IIA、哈帕酯苷适量，加乙腈使溶解，分别制成对照品溶液：人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1，人参皂苷Re，三七皂苷R1分别为1mg/ml，隐丹参酮、丹参酮IIA分别为0.2mg/ml，丹参酮I为0.5mg/ml，哈帕酯苷为0.1mg/ml；
(3)复方血栓通胶囊HPLC指纹图谱的测定：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，进样，用高效液相色谱仪测定，以对照品的色谱峰相对保留时间和峰面积为1，计算相对保留时间和相对峰面积，即得到复方血栓通胶囊HPLC指纹图谱。
3.2共有峰确定按照实验方法，对所有复方血栓通胶囊进行分析，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行评价，共有峰列表如下：
成品在203nm的共有峰列表如下：
  编号   峰号   纯否   归属药材   色谱峰确证名称
  1   1   +   玄参   安格洛苷
  2   2   +   三七   三七皂苷R<sub>1</sub>
  3   3   +   三七   人参皂苷Rg<sub>1</sub>
  4   4   +   三七   人参皂苷Re
  5   6   -   -   -
  6   7 +   黄芪   -
  7   8   +   玄参   哈帕酯苷
  编号   峰号   纯否   归属药材   色谱峰确证名称
  8   10   +   三七   -
  9   11   -   黄芪   -
  10   12   -   三七   -
  11   13   -   三七   -
  12   14   +   三七   人参皂苷Rb<sub>1</sub>
  13   16   +   三七   -
  14   17   +   三七   -
  15   19   +   三七   -
  16   21   +   -   -
  17   22   +   -   -
  18   23   +   三七   -
  19   24   +   -   -
  20   25   +   -   -
  21   27   +   -   -
  22   30   -   玄参   -
  23   31   +   丹参   隐丹参酮
  24   34   +   -   -
  25   35   +   -   -
  26   36   +   三七   -
  27   37   +   三七   -
  编号   峰号   纯否   归属药材   色谱峰确证名称
  28   38   -   三七   -
  29   39   +   丹参   丹参酮IIA
成品在270nm的共有峰列表如下
  编号   峰号   纯否   归属药材   色谱峰确证名称
  1   1   -   -   -
  2   2   +   玄参   哈帕酯苷
  3   4   +   丹参   隐丹参酮
  4   5   丹参   丹参酮I
  5   6   +   丹参   丹参酮IIA
3.3共有特征峰的描述
所述复方血栓通胶囊HPLC指纹图谱203nm的共有峰为〔1〕、〔2〕、〔3〕、〔4〕、〔6〕、〔7〕、〔8〕、〔10〕、〔11〕、〔12〕、〔13〕、〔14〕、〔16〕、〔17〕、〔19〕、〔21〕、〔22〕、〔23〕、〔24〕、〔25〕、〔27〕、〔30〕、〔31〕、〔34〕、〔35〕、〔36〕、〔37〕、〔38〕、〔39〕29个峰，其中：归属于三七的共有峰为〔2〕、〔3〕、〔4〕、〔10〕、〔12〕、〔13〕、〔14〕、〔16〕、〔17〕、〔19〕、〔23〕、〔36〕、〔37〕、〔38〕；归属于玄参的共有峰为〔1〕、〔8〕、〔30〕；归属于黄芪的共有峰为〔7〕、〔11〕；归属于丹参的共有峰为〔31〕、〔39〕。
所述复方血栓通胶囊HPLC指纹图谱在203nm下归属于三七的指纹图谱具有14个特征峰；归属于黄芪的指纹图谱具有2个特征峰；归属于丹参的指纹图谱具有2个特征峰；归属于玄参的指纹图谱具有3个特征峰；所述图谱的图形如说明书附图中的图1所示的图谱。
利用DAD检测器对主要峰进行峰纯度检查，通过UV吸收曲线的比较确定：
203nm：1号峰为安格洛苷，2号峰为三七皂苷R1、3号峰为人参皂苷Rg1、4号峰为人参皂苷Re、14号峰为人参皂苷Rb1、8号峰为哈帕酯苷、31号峰为隐丹参酮、39号峰为丹参酮IIA。
所述复方血栓通胶囊HPLC指纹图谱270nm的共有峰为〔1〕、〔2〕、〔4〕、〔5〕、〔6〕5个峰，归属于玄参的共有峰为〔2〕号峰；归属于丹参的共有峰为〔4〕、〔5〕、〔6〕。在270nm下归属于丹参的指纹图谱具有3个特征峰；归属于玄参的指纹图谱具有1个特征峰；所述图谱的图形如说明书附图中的图2所示的图谱。
利用DAD检测器对主要峰进行峰纯度检查，通过UV吸收曲线的比较确定：
270nm：2号峰为哈帕酯苷、4号峰为隐丹参酮、5号峰为丹参酮I、6号峰为丹参酮IIA。
3.4指纹图谱精密度试验
取同一个复方血栓通胶囊溶液，连续进样6次，检测指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行评价。结果显示仪器的精密度很好，各检测波长下的相似度均大于0.80。
相似度结果如下：
203nm
S1 S2 S3 S4 S5 S6   对照指纹图谱
  S1   1.000   1.000   1.000   0.999   1.000   1.000   1.000
  S2   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000
  S3   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000
  S4   0.999   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000
  S5   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000
  S6   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000
  对照指纹图谱 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
270nm
S1 S2 S3 S4 S5 S6   对照指纹图谱
  S1   1.000   1.000   1.000   0.999   1.000   1.000   1.000
  S2   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000
  S3   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000
  S4   0.999   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000
  S5   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000
S1 S2 S3 S4 S5 S6   对照指纹图谱
  S6   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000
  对照指纹图谱   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000
3.5指纹图谱稳定性试验：取一个编号的复方血栓通胶囊样品溶液，分别在0、4、8、12、24、48小时进样，检测指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行评价。结果显示，稳定性良好，相似度均大于0.80。
相似度结果如下：
203nm
  0h   4h   8h   12h   24h   48h   对照指纹图谱
  0h   1.000   0.986   1.000   1.000   1.000   0.998   1.000
  4h   0.986   1.000   0.986   0.986   0.986   0.983   0.990
  8h   1.000   0.986   1.000   1.000   1.000   0.998   1.000
  12h   1.000   0.986   1.000   1.000   1.000   0.998   1.000
  24h   1.000   0.986   1.000   1.000   1.000   0.998   1.000
  48h   0.998   0.983   0.998   0.998   0.998   1.000   0.998
  对照指纹图谱   1.000   0.990   1.000   1.000   1.000   0.998   1.000
270nm
  0h   4h   8h   12h   24h   48h   对照指纹图谱
  0h   1.000   1.000   1.000   0.999   1.000   1.000   1.000
  4h   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000
  8h   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000
  0h   4h   8h   12h   24h   48h   对照指纹图谱
  12h   0.999   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000
  24h   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000
  48h   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000
  对照指纹图谱   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000
3.6指纹图谱重现性试验
取同一批复方血栓通胶囊6份，按药材样品溶液制备项下方法制备，分别进样，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行评价。结果显示样品溶液很好，相似度均大于0.80。
相似度结果如下：
203nm
  S1   S2   S3   S4   S5   S6   对照指纹图谱
  S1   1.000   1.000   0.998   0.998   0.998   0.998   0.999
  S2   1.000   1.000   0.998   0.998   0.998   0.998   0.999
  S3   0.998   0.998   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000
  S4   0.998   0.998   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000
  S5   0.998   0.998   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000
  S6   0.998   0.998   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000
  对照指纹图谱   0.999   0.999   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000
270nm
  S1   S2   S3   S4   S5   S6   对照指纹图谱
  S1   1.000   0.999   0.983   0.989   0.973   0.990   0.991
  S2   0.999   1.000   0.980   0.987   0.969   0.989   0.989
  S3   0.983   0.980   1.000   0.996   0.987   0.990   0.998
  S1   S2   S3   S4   S5   S6   对照指纹图谱
  S4   0.989   0.987   0.996   1.000   0.977   0.990   0.996
  S5   0.973   0.969   0.987   0.977   1.000   0.993   0.989
  S6   0.990   0.989   0.990   0.990   0.993   1.000   0.996
  对照指纹图谱   0.991   0.989   0.998   0.996   0.989   0.996   1.000
由HPLC指纹图谱各指纹特征峰共同组成了复方血栓通胶囊的指纹图谱特征，可以完整的对复方血栓通胶囊所含的4味植物药材作出色谱鉴定。
实施例2：玄参HPLC指纹图谱的构建方法
1、仪器与试药
1.1仪器
电子分析天平；超声波清洗器；旋转蒸发仪；超纯水器；ODS固相萃取小柱；液相色谱仪；高效液相色谱-质谱系统的色谱仪；紫外检测器；质谱检测器。
色谱柱：
①Merck Lichrospher Rp-18e：5μm，250×4.0mm；
②Agilent Hypersil：5μm，250×4.0mm；
③依利特Lichrosorb Rp-18e：5μm，250×4.6mm；
④迪马Diamonsil C18：5μm，250×4.6mm；
⑤大连依利特Hypersil C18：5μm，250×4.0mm
1.2试药
样品均为广东众生药业股份有限公司投产药材，为药典规定的品种，按《中国药典》收载的药材标准进行检验，均为合格药材。
2、方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：水(％)85~43∶乙腈(％)15~57；T(min)：0~180；检测波长：270nm；柱温：30℃。
3、指纹图谱测定
3.1指纹图谱制备
(1)供试品溶液的制备：取玄参粉末1g，精密称定，加70％甲醇20ml，超声处理2次，每次30分钟滤过，滤液减压回收至近干，用水2ml溶解样品上固相萃取小柱，加6ml水分次淋洗，淋洗液弃去，用10ml甲醇分次洗脱，洗脱液收集至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液；
(2)高效液相色谱分析：精密吸取供试品溶液20μl进样，色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：水(％)85～43∶乙腈(％)15～57；T(min)：0～180；柱温：30℃；检测波长：270nm，得到玄参HPLC指纹图谱。
3.2共有峰确定
对所有玄参药材的样品进行分析，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行评价。所述图谱的图形如说明书附图中的图16所示的图谱。
共有峰列表如下：
  编号   峰号   纯否   色谱峰确证名称
  1   1   +   安格洛苷
  2   5   +   哈帕酯苷
  3   9   +   -
  4   10   +   -
3.3指纹图谱精密度试验
取同一个玄参药材溶液连续进样6次，检测指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行评价，结果显示仪器的精密度很好，相似度均大于0.80。
相似度结果如下：
  S1   S2   S3   S4   S5   S6   对照指纹图谱
  S1   1.000   0.999   1.000   0.999   0.999   0.999   1.000
  S2   0.999   1.000   1.000   1.000   0.999   0.999   1.000
  S3   1.000   1.000   1.000   1.000   0.999   0.999   1.000
  S4   0.999   1.000   1.000   1.000   0.999   0.999   1.000
  S5   0.999   0.999   0.999   0.999   1.000   1.000   0.999
  S6   0.999   0.999   0.999   0.999   1.000   1.000   0.999
  对照指纹图谱   1.000   1.000   1.000   1.000   0.999   0.999   1.000
3.4指纹图谱稳定性试验
取一个编号的药材样品溶液，分别在0、4、8、12、24、48小时进样，检测指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行评价。结果显示样品溶液很好，相似度均大于0.80。
相似度结果如下
  0h   4h   8h   12h   24h   48h   对照指纹图谱
  0h   1.000   0.999   1.000   0.999   0.999   0.998   1.000
  4h   0.999   1.000   1.000   1.000   0.999   0.997   1.000
  8h   1.000   1.000   1.000   1.000   0.999   0.998   1.000
  12h   0.999   1.000   1.000   1.000   0.999   0.998   1.000
  24h   0.999   0.999   0.999   0.999   1.000   0.999   0.999
  48h   0.998   0.997   0.998   0.998   0.999   1.000   0.998
  对照指纹图谱   1.000   1.000   1.000   1.000   0.999   0.998   1.000
3.5指纹图谱重现性试验
取同一批玄参药材6份，按药材样品溶液制备项下方法制备，分别进样，检测指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行评价。结果显示样品溶液很好，相似度均大于0.80。
相似度结果如下：
  S1   S2   S3   S4   S5   S6   对照指纹图谱
  S1   1.000   1.000   1.000   0.998   1.000   1.000   1.000
  S2   1.000   1.000   1.000   0.998   1.000   0.999   1.000
  S3   1.000   1.000   1.000   0.998   1.000   1.000   1.000
  S4   0.998   0.998   0.998   1.000   0.998   0.998   0.999
  S5   1.000   1.000   1.000   0.998   1.000   1.000   1.000
  S6   1.000   0.999   1.000   0.998   1.000   1.000   1.000
  对照指纹图谱   1.000   1.000   1.000   0.999   1.000   1.000   1.000
相似度评价
本品的指纹图谱与共有模式图谱经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》比较，相似系数应不得低于0.80。
  S1   S2   S3   S4   对照指纹图谱
  S1   1.000   0.993   0.986   0.912   0.992
  S2   0.993   1.000   0.988   0.890   0.986
  S3   0.986   0.988   1.000   0.865   0.979
  S4   0.912   0.890   0.865   1.000   0.938
  对照指纹图谱   0.992   0.986   0.979   0.938   1.000
实施例3：三七HPLC指纹图谱的构建方法
1、仪器与试药
1.1仪器
电子分析天平；超声波清洗器；旋转蒸发仪；超纯水器；ODS固相萃取小柱；液相色谱仪；高效液相色谱-质谱系统的色谱仪；紫外检测器；质谱检测器。
色谱柱：
①Merck Lichrospher Rp-18e：5μm，250×4.0mm；
②Agilent Hypersil：5μm，250×4.0mm；
③依利特Lichrosorb Rp-18e：5μm，250×4.6mm；
④迪马Diamonsil C18：5μm，250×4.6mm；
⑤大连依利特Hypersil C18：5μm，250×4.0mm
1.2试药
样品均为广东众生药业股份有限公司投产药材，为药典规定的品种，按《中国药典》收载的药材标准进行检验，均为合格药材。
2、方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：水(％)85~43∶乙腈(％)15~57；线性梯度洗脱；T(min)：0~180；检测波长：203nm；柱温：30℃。
3、指纹图谱测定
3.1指纹图谱制备
(1)供试品溶液的制备：取三七粉末0.75g，精密称定，加70％甲醇15ml，超声处理2次，每次30分钟，滤过，滤液减压回收溶剂至近干，用水2ml溶解样品上固相萃取小柱，加6ml水分次淋洗，淋洗液弃去，用10ml甲醇分次洗脱，洗脱液收集至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：精密称取各种对照品适量，加乙腈使溶解，分别制成：人参皂苷Rg11mg/ml，人参皂苷Rb11mg/ml，人参皂苷Re0.2mg/ml，三七皂苷R10.2mg/ml；
(3)三七HPLC指纹图谱的测定：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，进样，用高效液相色谱仪测定，以对照品的色谱峰相对保留时间和峰面积为1，计算相对保留时间和相对峰面积，即得到三七HPLC指纹图谱。所述图谱的图形如说明书附图中的图20所示的图谱。
3.2共有峰确定
精密吸取供试品溶液20μl，进样，测定，应有如下共有峰：
  编号   峰号   纯否   色谱峰确证名称
  1   3   +   三七皂苷R<sub>1</sub>
  2   4   +   人参皂苷Rg<sub>1</sub>
  3   5   +   人参皂苷Re
  4   12   +   -
  5   14   +   -
  6   15   +   -
  7   16   +   人参皂苷Rb1
  8   17   +   -
  9   18   +   -
  10   19   +   -
  11   20   -   -
  12   25   -   -
  13   27   -   -
  14   28   -   -
  15   29   -   -
三七指纹图谱通过紫外吸收曲线的比较定性，确定：3号峰为三七皂苷R1、4号峰为人参皂苷Rg1、5号峰为人参皂苷Re、16号峰为人参皂苷Rb1。
4.3指纹图谱精密度试验
取同一个三七药材溶液连续进样6次，检测指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行评价，结果显示仪器的精密度很好，相似度均大于0.80。
相似度结果如下：
  S1   S2   S3   S4   S5   S6   对照指纹图谱
  S1   1.000   0.999   0.999   0.999   0.999   0.995   0.999
  S2   0.999   1.000   1.000   0.999   0.999   0.995   1.000
  S3   0.999   1.000   1.000   1.000   1.000   0.995   1.000
  S4   0.999   0.999   1.000   1.000   1.000   0.995   1.000
  S5   0.999   0.999   1.000   1.000   1.000   0.995   1.000
  S6   0.995   0.995   0.995   0.995   0.995   1.000   0.997
  对照指纹图谱   0.999   1.000   1.000   1.000   1.000   0.997   1.000
3.4指纹图谱稳定性试验
取一个编号的药材样品溶液，分别在0、4、8、12、24、48小时进样，检测指纹图谱采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行评价。结果显示样品溶液很好，相似度均大于0.80。
相似度结果如下
  0h   4h   8h   12h   24h   48h   对照指纹图谱
  0h   1.000   0.999   0.999   0.999   0.996   0.996   0.999
  4h   0.999   1.000   1.000   1.000   0.996   0.995   0.999
  8h   0.999   1.000   1.000   1.000   0.996   0.995   0.999
  12h   0.999   1.000   1.000   1.000   0.996   0.995   0.999
  24h   0.996   0.996   0.996   0.996   1.000   0.998   0.998
  48h   0.996   0.995   0.995   0.995   0.998   1.000   0.998
  对照指纹图谱   0.999   0.999   0.999   0.999   0.998   0.998   1.000
3.5指纹图谱重现性试验
取同一批三七药材6份，按药材样品溶液制备项下方法制备，分别进样，检测指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行评价。结果显示样品溶液很好，相似度均大于0.80。
  S1   S2   S3   S4   S5   S6   对照指纹图谱
  S1   1.000   0.999   0.998   0.996   0.993   0.996   0.999
  S2   0.999   1.000   0.998   0.996   0.994   0.996   0.999
  S3   0.998   0.998   1.000   0.995   0.993   0.995   0.998
  S4   0.996   0.996   0.995   1.000   0.996   1.000   0.999
  S5   0.993   0.994   0.993   0.996   1.000   0.996   0.997
  S6   0.996   0.996   0.995   1.000   0.996   1.000   0.999
  对照指纹图谱   0.999   0.999   0.998   0.999   0.997   0.999   1.000
相似度结果如下：
相似度评价
本品的指纹图谱与共有模式图谱经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》比较，相似系数应不得低于0.80。
  S1   S2   S3   S4   S5   S6   对照指纹图谱
  S1   1.000   0.986   0.976   0.971   0.985   0.993   0.995
  S2   0.986   1.000   0.990   0.952   0.985   0.987   0.993
  S3   0.976   0.990   1.000   0.949   0.981   0.975   0.984
  S4   0.971   0.952   0.949   1.000   0.972   0.965   0.975
  S5   0.985   0.985   0.981   0.972   1.000   0.982   0.992
  S6   0.993   0.987   0.975   0.965   0.982   1.000   0.993
  对照指纹图谱   0.995   0.993   0.984   0.975   0.992   0.993   1.000
实施例4：丹参HPLC指纹图谱的构建方法
1、仪器与试药
1.1仪器
电子分析天平；超声波清洗器；旋转蒸发仪；超纯水器；ODS固相萃取小柱；液相色谱仪；高效液相色谱-质谱系统的色谱仪；紫外检测器；质谱检测器。
色谱柱：
①Merck Lichrospher Rp-18e：5μm，250×4.0mm；
②Agilent Hypersil：5μm，250×4.0mm；
③依利特Lichrosorb Rp-18e：5μm，250×4.6mm；
④迪马Diamonsil C18：5μm，250×4.6mm；
⑤大连依利特Hypersil C18：5μm，250×4.0mm
1.2试药
样品均为广东众生药业股份有限公司投产药材，为药典规定的品种，按《中国药典》收载的药材标准进行检验，均为合格药材。
2、方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：水(％)85~43∶乙腈(％)15~57；线性梯度洗脱；T(min)：0~180；检测波长：270nm；柱温：30℃。理论塔板数以丹参酮IIA计算不小于4000。
3、指纹图谱测定
3.1指纹图谱制备
(1)供试品溶液的制备：取丹参粉末0.75g，精密称定，加70％甲醇15ml，超声处理2次，每次30分钟，滤过，滤液减压回收溶剂至近干，用水2ml溶解样品上固相萃取小柱，加6ml水分次淋洗，淋洗液弃去，用10ml甲醇分次洗脱，洗脱液收集至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：精密称取各种对照品适量，加乙腈使溶解，分别制成：丹参酮I 0.2mg/ml，隐丹参酮0.5mg/ml，丹参酮IIA 0.2mg/ml；
(3)丹参HPLC指纹图谱的测定：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，进样，用高效液相色谱仪测定，以对照品的色谱峰相对保留时间和峰面积为1，计算相对保留时间和相对峰面积，即得到丹参HPLC指纹图谱。所述图谱的图形如说明书附图中的图23所示的图谱。
3.2共有峰确定
丹参指纹图谱通过紫外吸收曲线的比较及液质联用定性确定：7号峰为隐丹参酮、8号峰为丹参酮I、10号峰为丹参酮IIA。
3.3指纹图谱精密度试验
取同一个丹参药材溶液连续进样6次，检测指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行评价。结果显示仪器的精密度很好，相似度均大于0.80。
  S1   S2   S3   S4   S5   S6   对照指纹图谱
  S1   1.000   0.995   0.996   0.997   0.995   0.995   0.997
  S2   0.995   1.000   0.999   0.995   0.995   0.995   0.998
  S3   0.996   0.999   1.000   0.995   0.995   0.995   0.998
  S1   S2   S3   S4   S5   S6   对照指纹图谱
  S4   0.997   0.995   0.995   1.000   0.995   0.996   0.998
  S5   0.995   0.995   0.995   0.995   1.000   0.997   0.998
  S6   0.995   0.995   0.995   0.996   0.997   1.000   0.998
  对照指纹图谱   0.997   0.998   0.998   0.998   0.998   0.998   1.000
3.4指纹图谱稳定性试验
取一个编号的药材样品溶液，分别在0、4、8、12、24、48小时进样，检测指纹图谱采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行评价。结果显示样品溶液很好，相似度均大于0.80。
相似度结果如下：
  0h   4h   8h   12h   24h   48h   对照指纹图谱
  0h   1.000   0.995   0.996   0.996   0.995   0.988   0.997
  4h   0.995   1.000   0.999   0.995   0.995   0.988   0.998
  8h   0.996   0.999   1.000   0.995   0.995   0.988   0.998
  12h   0.996   0.995   0.995   1.000   0.995   0.988   0.998
  24h   0.995   0.995   0.995   0.995   1.000   0.987   0.997
  48h   0.988   0.988   0.988   0.988   0.987   1.000   0.990
  对照指纹图谱   0.997   0.998   0.998   0.998   0.997   0.990   1.000
3.5指纹图谱重现性试验
  S1   S2   S3   S4   S5   S6   对照指纹图谱
  S1   1.000   0.998   0.991   0.991   0.991   0.990   0.997
  S2   0.998   1.000   0.991   0.991   0.990   0.990   0.997
  S3   0.991   0.991   1.000   0.984   0.983   0.982   0.990
  S1   S2   S3   S4   S5   S6   对照指纹图谱
  S4   0.991   0.991   0.984   1.000   0.999   0.999   0.998
  S5   0.991   0.990   0.983   0.999   1.000   1.000   0.997
  S6   0.990   0.990   0.982   0.999   1.000   1.000   0.997
  对照指纹图谱   0.997   0.997   0.990   0.998   0.997   0.997   1.000
取同一批丹参药材6份，按药材样品溶液制备项下方法制备，分别进样，检测指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行评价。结果显示样品溶液很好，相似度均大于0.80。
相似度结果如下：
相似度评价
本品的指纹图谱与共有模式图谱经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》比较，相似系数应不得低于0.80。
丹参指纹图谱270nm相似度结果：
  S1   S2   S3   S4   对照指纹图谱
  S1   1.000   0.994   0.999   0.989   0.998
  S2   0.994   1.000   0.995   0.981   0.999
  S3   0.999   0.995   1.000   0.990   0.999
  S4   0.989   0.981   0.990   1.000   0.987
  对照指纹图谱   0.998   0.999   0.999   0.987   1.000
实施例5：黄芪HPLC指纹图谱的构建方法
1、仪器与试药
1.1仪器
电子分析天平；超声波清洗器；旋转蒸发仪；超纯水器；ODS固相萃取小柱；液相色谱仪；高效液相色谱-质谱系统的色谱仪；紫外检测器；质谱检测器。
色谱柱：
①Merck Lichrospher Rp-18e：5μm，250×4.0mm；
②Agilent Hypersil：5μm，250×4.0mm；
③依利特Lichrosorb Rp-18e：5μm，250×4.6mm；
④迪马Diamonsil C18：5μm，250×4.6mm；
⑤大连依利特Hypersil C18：5μm，250×4.0mm
1.2试药
样品均为广东众生药业股份有限公司投产药材，为药典规定的品种，按《中国药典》收载的药材标准进行检验，均为合格药材。
2、方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：水(％)85～43∶乙腈(％)15～57；线性梯度洗脱；T(min)：0～180；检测波长：270nm；柱温：30℃。
3、指纹图谱测定
3.1指纹图谱制备
复方血栓通胶囊成分之一的黄芪HPLC指纹图谱的构建方法包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取黄芪粉末约1g，精密称定，加70％甲醇20ml，超声处理2次，每次30分钟，滤过，滤液减压回收溶剂至近干，用水2ml溶解样品上固相萃取小柱，加6ml水分次淋洗，淋洗液弃去，用10ml甲醇分次洗脱，洗脱液收集至10ml量瓶中，加甲醇至刻度摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液；
(2)高效液相色谱分析：精密吸取供试品溶液20μl进样，色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：水(％)85~43∶乙腈(％)15～57；线性梯度洗脱；T(min)：0～180；柱温：30℃；检测波长：270nm；得到黄芪HPLC指纹图谱。所述图谱的图形如说明书附图中的图25所示的图谱。
3.2共有峰确定
精密吸取供试品溶液20μl，进样，按上述项下色谱条件进行测定，应有如下共有峰：
  编号   峰号   纯否   色谱峰确证名称
  1   1   -   -
  2   2   +   -
  3   3   +   -
  4   4   +   -
  5   9   -   -
  6   10   +   -
  7   11   +   -
  8   12   +   -
以上所述仅为本发明专利的较佳实施例，凡依本发明专利要求范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明专利权利要求的涵盖范围。

Claims (3)

1.一种复方血栓通制剂HPLC指纹图谱的构建方法，其特征是它包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：精密称取复方血栓通制剂0.1g～10.0g，用50％～100％甲醇提取1～3次，每次10～60分钟，每次10～100ml，滤过，合并滤液，蒸干，适当净化，用甲醇配成供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：精密称取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、三七皂苷R1、丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮IIA、哈帕酯苷适量，加乙腈使溶解，分别制成对照品溶液：人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1，人参皂苷Re，三七皂苷R1分别为1mg/ml，隐丹参酮、丹参酮IIA分别为0.2mg/ml，丹参酮I为0.5mg/ml，哈帕酯苷为0.1mg/ml；
(3)复方血栓通制剂HPLC指纹图谱的测定：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，进样，用高效液相色谱仪测定，以对照品的色谱峰相对保留时间和峰面积为1，计算供试品的相对保留时间和相对峰面积，即得到复方血栓通制剂HPLC指纹图谱；
其中所述高效液相色谱仪中的色谱柱，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：水∶乙腈，水(％)85～43∶乙腈(％)15～57；线性梯度洗脱；T(min)：0～180；柱温：10～50℃；检测波长：203nm，270nm；
其中供试品指纹图谱采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行评价，各检测波长下的相似度均大于0.80；
其中所述复方血栓通制剂HPLC指纹图谱在203nm下归属于三七的指纹图谱具有14个特征峰；归属于黄芪的指纹图谱具有2个特征峰；归属于丹参的指纹图谱具有2个特征峰；归属于玄参的指纹图谱具有3个特征峰；在270nm下归属于丹参的指纹图谱具有3个特征峰；归属于玄参的指纹图谱具有1个特征峰；所述图谱的图形如说明书附图中的图1、图2所示的图谱。
2.根据权利要求1所述的复方血栓通制剂HPLC指纹图谱的构建方法，其特征是，其成分之一的三七、玄参、黄芪、丹参四味药材的HPLC指纹图谱的构建方法，与复方血栓通制剂具有相同的检测条件并分别得到各自药材的指纹图谱。
3.根据权利要求1所述的复方血栓通制剂HPLC指纹图谱的构建方法，其特征是，利用DAD检测器对主要峰进行峰纯度检查，通过UV吸收曲线的比较确定：
203nm：1号峰为安格洛苷，2号峰为三七皂苷R1、3号峰为人参皂苷Rg1、4号峰为人参皂苷Re、14号峰为人参皂苷Rb1、8号峰为哈帕酯苷、31号峰为隐丹参酮、39号峰为丹参酮IIA；
270nm：2号峰为哈帕酯苷、4号峰为隐丹参酮、5号峰为丹参酮I、6号峰为丹参酮IIA。
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