CN107478749B - 一种桃红四物汤的药物制剂的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种桃红四物汤的药物制剂的检测方法。该方法，通过优化提取溶剂、提取时间、提取方法，使得桃红四物汤的药物制剂中各化学成分实现最大程度地被提取，通过优化色谱柱、流动相、流动相的洗脱方式，使得桃红四物汤的药物制剂中的各化学成分实现较好的分离，从而建立了针对该药物制剂的指纹图谱的方法，获得了较为全面的图谱信息；进一步通过优化选择7号峰羟基红花黄色素A作为指纹图谱中的内参考峰，确认了共有特征峰7号峰羟基红花黄色素A，8号峰芍药苷和9号峰阿魏酸，并确定了桃红四物汤颗粒的11个共有特征峰的相对保留时间，能够结合该指纹图谱中多个色谱峰的信息，能够全面地、系统地检测桃红四物汤颗粒的质量。

Description

一种桃红四物汤的药物制剂的检测方法

技术领域

本发明属于药物分析领域，具体涉及一种桃红四物汤的药物制剂的检测方法。

背景技术

桃红四物汤为调经要方之一，是《玉机微义》转引的《医垒元戎》中的一个方子，也称加味四物汤，桃红四物汤这一方名始于见《医宗金鉴》。该方由四物汤加味桃仁、红花而成，功效为养血活血。现代研究表明，桃红四物汤具有扩张血管、抗炎、抗疲劳、抗休克、调节免疫功能、降脂、补充微量元素、抗过敏等作用。

中药成分复杂，药效部位常常不是单一成分，以某种单一成分作为质量控制指标已越来越不适应中药质量控制的要求。因此，中药指纹图谱技术应运而生。中药指纹图谱技术源于指纹鉴定学，利用现代信息技术和质量分析手段较全面的反映了中药所含化学成分的种类和数量。对于中药材，指纹图谱可以用来鉴别真伪、评判优劣；对于中成药，指纹图谱可以鉴别产品真伪，评判制备工艺的合理性，有效地控制产品质量。现阶段中药的有效成分大多数尚不明确，中药指纹图谱的整体性和模糊性正好适应这一特点，较单一成分的质量控制方法更具有科学性和全面性。目前，国际上已认可将中药指纹图谱作为中药质量的控制模式。高效液相色谱法具有分离效能高、分析速度快等优点，已成为当今指纹图谱的主要分析手段。为了桃红四物汤颗粒进行质量检测和质量控制，谭晓虹等对桃红四物汤水提液中没食子酸、芍药苷和红花黄色素含量进行了测定，杨辉等通过ISC-HPLC法对桃红四物汤中酚类物质进行了同时测定，王雁梅等对桃红四物汤中阿魏酸的含量进行了测定。然而，上述对桃红四物汤的质量控制方法中，往往是选取桃红四物汤中某个化学成分或一两个中药材中的已知成分或一类化学成分进行含量测定，用其含量的多少判定质量好坏。但由于中药材质量受产地、气候、季节等多方面影响，导致所含成分的种类及含量往往不稳定，这导致只检测其中单一成分的含量具有一定片面性。因此，以上方法均不能系统、全面的反映桃红四物汤颗粒的内在质量。

因此，建立一种能够全面地、系统地检测桃红四物汤颗粒的方法，特别是建立桃红四物汤的指纹图谱的方法，对于其全面质量检测和整体质量控制具有重要意义。

发明内容

为此，本发明提出一种建立桃红四物汤的药物制剂的指纹图谱的方法，进而提供一种桃红四物汤的药物制剂的检测方法。

为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案来实现的：

本发明提供一种桃红四物汤的药物制剂的检测方法，

该方法包括如下建立桃红四物汤的药物制剂的指纹图谱的方法的步骤：

取待测药物制剂1～5重量份，精密称定，置20～100mL具塞锥形瓶中，精密加入水或体积浓度为20％～70％的甲醇水溶液或甲醇10～50体积份，称定重量，超声处理10～30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

取羟基红花黄色素A适量，加水或体积浓度为20％～70％的甲醇水溶液或甲醇制成每1mL含羟基红花黄色素A 50～200μg的溶液，即得对照品溶液；

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0.05％～0.3％磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；流速为0.8～1.2mL/min，柱温为25～35℃，检测波长为210-400nm，理论板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于3000；

分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各5～20μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得；

所述重量份与所述体积份的关系为g/mL。

优选地，本发明上述桃红四物汤的药物制剂的检测方法，按如下程序进行梯度洗脱：0-12min，A：B为2％：98％；12-16min，A：B为2％：98％→5％：95％；16min，A：B为5％：95％；16-50min，A：B为5％：95％→18％：82％；50min，A：B为18％：82％；50-65min，A：B为18％：82％→27％：73％；65min，A：B为27％：73％；65-75min，A：B为27％：73％→50％：50％，75min，A：B为50％：50％。

进一步优选地，本发明上述桃红四物汤的药物制剂的检测方法，以PhenomenexLuna C18色谱柱为色谱柱。

进一步优选地，本发明上述桃红四物汤的药物制剂的检测方法，所述建立桃红四物汤的药物制剂的指纹图谱的方法具体如下：

取待测药物制剂1.7重量份，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为20％的甲醇水溶液25体积份，称定重量，超声处理10分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

取羟基红花黄色素A适量，加体积浓度为25％的甲醇水溶液制成每1mL含羟基红花黄色素A100μg的溶液，即得对照品溶液；

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按如下程序进行梯度洗脱：0-12min，A：B为2％：98％；12-16min，A：B为2％：98％→5％：95％；16min，A：B为5％：95％；16-50min，A：B为5％：95％→18％：82％；50min，A：B为18％：82％；50-65min，A：B为18％：82％→27％：73％；65min，A：B为27％：73％；65-75min，A：B为27％：73％→50％：50％，75min，A：B为50％：50％；流速为1.0mL/min，柱温为30℃，检测波长为275nm，理论板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于3000；

分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。

进一步优选地，本发明上述桃红四物汤的药物制剂的检测方法，还包括如下鉴别或含量测定方法中的至少一种：

B、桃仁、白芍、苦杏仁苷和芍药苷的鉴别

取待测药物制剂1～5重量份，研细，加甲醇10～50体积份，超声处理10～60分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水5～20体积份微热使溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂，用体积浓度为1～10％的氨溶液10～100体积份洗脱，弃去氨液，再用水10～50体积份洗脱，弃去水液，继用体积浓度为10％～40％的乙醇水溶液10～50体积份洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1～5体积份使溶解，作为供试品溶液；

另取桃仁对照药材粗粉0.1～0.5重量份，加60～90℃的石油醚5～20体积份，加热回流0.5～2小时，滤过，弃去石油醚，药渣挥干，加甲醇5～20体积份，加热回流0.5～2小时，放冷，滤过，取滤液作为桃仁对照药材溶液；

取白芍对照药材粉末0.1～1重量份，加甲醇5～20体积份，超声处理5～30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇0.5～2体积份使溶解，作为白芍对照药材溶液；

取苦杏仁苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.5～5mg的溶液，作为苦杏仁苷对照品溶液；

取芍药苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.5～3mg的溶液，作为芍药苷对照品溶液；

照薄层色谱法试验，分别吸取桃仁对照药材溶液、白芍对照药材溶液、苦杏仁苷对照品溶液、芍药苷对照品溶液和供试品溶液各1～10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为15∶40∶22∶10的三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水在5～10℃放置5～20小时的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茴香醛试液，于105℃加热至斑点显色清晰；

C、当归和川芎的鉴别

取待测药物制剂2～10重量份，研细，加20～100体积份甲醇，超声处理10～60分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10～40体积份使溶解，用乙醚萃取1～3次，每次10～30体积份，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇1～5体积份使溶解，作为供试品溶液；

取当归对照药材0.1～1重量份，加水10～50体积份，超声处理5～30分钟，离心，上清液蒸至近干，加甲醇10～30体积份，超声5～30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水5～20体积份使溶解，用乙醚萃取1～3次，每次5～20体积份，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇1～5体积份使溶解，作为当归对照药材溶液；

取川芎对照药材0.5～3重量份，加水10～30体积份，超声处理10～30分钟，离心，上清液蒸至近干，加甲醇10～30体积份，超声5～30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水5～20体积份使溶解，用乙醚萃取1～3次，每次5～20体积份，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇1～3体积份使溶解，制成川芎对照药材溶液；

照薄层色谱法试验，分别吸取当归对照药材溶液5～15μL、川芎对照药材溶液各5～15μL和供试品溶液2～10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为4∶1∶1∶0.1的环己烷：二氯甲烷：乙酸乙酯：甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365mn下检视；

D、红花和羟基红花光色素A的鉴别

取待测药物制剂0.5～5重量份，研细，加体积浓度为50％～90％的丙酮溶液5～20体积份，密塞，超声处理5～30分钟，静置，取上清液作为供试品溶液；

取红花对照药材0.1～1重量份，加体积浓度为50％～90％的丙酮溶液5～20体积份，密塞，超声处理5～30分钟，静置，取上清液作为红花对照药材溶液；

再取羟基红花黄色素A对照品，加甲醇制成每1mL含0.1～1mg的溶液，作为对照品溶液；

照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液、红花对照药材溶液、羟基红花黄色素A对照品溶液各1～5μL，分别点于同一聚酰胺薄膜板上，以体积浓度为4∶2∶7的甲醇-甲酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365mn下检视；

E、苦杏仁苷的含量测定

取待测药物制剂1～3重量份，研细，精密称定，置20～100mL具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为10％～50％的甲醇水溶液10～50体积份，称定重量，超声处理5～30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

取苦杏仁苷对照品适量，精密称定，加50～90％甲醇制成每1mL含苦杏仁苷100～500μg的溶液，即得对照品溶液；

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以含有体积浓度为10～20％的四氢呋喃的乙腈为流动相A、含有体积浓度为0.05～0.2％的磷酸的水为流动相B，以A：B体积比为5∶95混合液为流动相，柱温25～35℃，流速0.5～1.5mL/min；检测波长为270～280mn，理论板数按苦杏仁苷峰计算应不低于5000；

分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各5～20μL，注入液相色谱仪，测定，即得；

F、羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸的含量测定

取待测药物制剂1～3重量份，研细，精密称定，置20～100mL具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为10％～50％的甲醇水溶液10～50体积份，称定重量，超声处理5～30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

分别精密称定羟基红花黄色素A、芍药苷和阿魏酸对照品适量，加甲醇制成每1mL含羟基红花黄色素A 50～150μg、芍药苷150～250μg、阿魏酸10～30μg的混合溶液，即得对照品溶液；

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以含有体积浓度为0.05～0.15％的磷酸水溶液为流动相B，按照如下程序进行进行梯度洗脱：0-3min，A：B为13％：87％；3-4min，A：B为13％：87％→10％：90％；4-60min，A：B为10％：90％；羟基红花黄色素A的检测波长为400nm，芍药苷的检测波长为230nm，阿魏酸的检测波长为316nm，按照如下梯度波长进行检测：0-16min，检测波长为400nm；16-17min，检测波长为400nm→230nm；17-45min，检测波长为230nm；45-46min，检测波长为230nm→316nm；46-60min，检测波长为316nm；理论板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于5000；

分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各5～20μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

进一步优选地，本发明上述桃红四物汤的药物制剂的检测方法，所述鉴别或含量测定方法具体如下：

B、桃仁、白芍、苦杏仁苷和芍药苷的鉴别

取待测药物制剂3重量份，研细，加甲醇25体积份，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10体积份微热使溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂，用体积浓度为4％的氨溶液50体积份洗脱，弃去氨液，再用水30体积份洗脱，弃去水液，继用体积浓度为20％的乙醇水溶液30体积份洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2体积份使溶解，作为供试品溶液；

另取桃仁对照药材粗粉0.2重量份，加60～90℃的石油醚10体积份，加热回流1小时，滤过，弃去石油醚，药渣挥干，加甲醇10体积份，加热回流1小时，放冷，滤过，取滤液作为桃仁对照药材溶液；

取白芍对照药材粉末0.5重量份，加甲醇10体积份，超声处理10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1体积份使溶解，作为白芍对照药材溶液；

取苦杏仁苷对照品，加甲醇制成每1mL含2mg的溶液，作为苦杏仁苷对照品溶液；

取芍药苷对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为芍药苷对照品溶液；

照薄层色谱法试验，分别吸取桃仁对照药材溶液、白芍对照药材溶液、苦杏仁苷对照品溶液、芍药苷对照品溶液和供试品溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为15∶40∶22∶10的三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水在5～10℃放置12小时的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茴香醛试液，于105℃加热至斑点显色清晰；

C、当归和川芎的鉴别

取待测药物制剂5重量份，研细，加50体积份甲醇，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20体积份使溶解，用乙醚萃取2次，每次20体积份，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇2体积份使溶解，作为供试品溶液；

取当归对照药材0.5重量份，加水20体积份，超声处理15分钟，离心，上清液蒸至近干，加甲醇20体积份，超声15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10体积份使溶解，用乙醚萃取2次，每次10体积份，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇2体积份使溶解，作为当归对照药材溶液；

取川芎对照药材1重量份，加水20体积份，超声处理15分钟，离心，上清液蒸至近干，加甲醇20体积份，超声15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10体积份使溶解，用乙醚萃取2次，每次10体积份，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇2体积份使溶解，制成川芎对照药材溶液；

照薄层色谱法试验，分别吸取当归对照药材溶液10μL、川芎对照药材溶液各10μL和供试品溶液5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为4∶1∶1∶0.1的环己烷：二氯甲烷：乙酸乙酯：甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365mn下检视；

D、红花和羟基红花光色素A的鉴别

取待测药物制剂2重量份，研细，加体积浓度为80％的丙酮溶液10体积份，密塞，超声处理15分钟，静置，取上清液作为供试品溶液；

取红花对照药材0.5重量份，加体积浓度为80％的丙酮溶液10体积份，密塞，超声处理15分钟，静置，取上清液作为红花对照药材溶液；

再取羟基红花黄色素A对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；

照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液、红花对照药材溶液、羟基红花黄色素A对照品溶液各2μL，分别点于同一聚酰胺薄膜板上，以体积浓度为4∶2∶7的甲醇-甲酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365mn下检视；

E、苦杏仁苷的含量测定

取待测药物制剂1.7重量份，研细，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为20％的甲醇水溶液25体积份，称定重量，超声处理10分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

取苦杏仁苷对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每1mL含苦杏仁苷250μg的溶液，即得对照品溶液；

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以含有体积浓度为13％的四氢呋喃的乙腈为流动相A、含有体积浓度为0.1％的磷酸的水为流动相B，以A：B体积比为5∶95混合液为流动相，柱温30℃，流速1.0mL/min；检测波长为275mn，理论板数按苦杏仁苷峰计算应不低于5000；

分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得；

F、羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸的含量测定

取待测药物制剂1.7重量份，研细，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为20％的甲醇水溶液25体积份，称定重量，超声处理10分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

分别精密称定羟基红花黄色素A、芍药苷和阿魏酸对照品适量，加甲醇制成每1mL含羟基红花黄色素A 100μg、芍药苷200μg、阿魏酸20μg的混合溶液，即得对照品溶液；

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以含有体积浓度为0.1％的磷酸水溶液为流动相B，按照如下程序进行进行梯度洗脱：0-3min，A：B为13％：87％；3-4min，A：B为13％：87％→10％：90％；4-60min，A：B为10％：90％；羟基红花黄色素A的检测波长为400nm，芍药苷的检测波长为230nm，阿魏酸的检测波长为316nm，按照如下梯度波长进行检测：0-16min，检测波长为400nm；16-17min，检测波长为400nm→230nm；17-45min，检测波长为230nm；45-46min，检测波长为230nm→316nm；46-60min，检测波长为316nm；理论板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于5000；

分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

进一步优选地，本发明上述桃红四物汤的药物制剂的检测方法，所述桃红四物汤的原料药组成为：桃仁7.2～10.8重量份、红花4.8～7.2重量份、当归12～18重量份、川芎6.4～9.6重量份、白芍8～12重量份、熟地12～18重量份。

进一步优选地，本发明上述桃红四物汤的药物制剂的检测方法，所述桃红四物汤的原料药组成为：桃仁9重量份、红花6重量份、当归15重量份、川芎8重量份、白芍10重量份、熟地15重量份。

进一步优选地，本发明上述桃红四物汤的药物制剂的检测方法，

所述桃红四物汤的药物制剂通过以下方法制备而成：分别取选定重量份的桃仁、红花、当归、川芎、白芍和熟地，加水煎煮，滤过，滤液减压浓缩至60℃下相对密度约为1.2～1.4，干燥，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的药物制剂；

所述药物制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。

更进一步优选地，本发明上述桃红四物汤的药物制剂的检测方法，

所述桃红四物汤的药物制剂通过以下方法制备而成：分别取选定重量份的桃仁、红花、当归、川芎、白芍和熟地，加水煎煮1～3次，每次加水5～10倍量，每次煎煮20～80分钟，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至60℃下相对密度约为1.2～1.4，干燥，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的药物制剂。

更进一步优选地，本发明上述桃红四物汤的药物制剂的检测方法，

所述桃红四物汤的药物制剂通过以下方法制备而成：分别取选定重量份的桃仁、红花、当归、川芎、白芍和熟地，加水煎煮二次，第一次加水10倍量，浸泡30分钟，煎煮60分钟，第二次加水8倍量，煎煮30分钟，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至60℃下相对密度约为1.3，干燥，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的药物制剂。

所述药学上可接受的辅料为：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素纳等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：PEG6000、PEG4000、虫蜡等。

进一步优选地，本发明上述桃红四物汤的药物制剂的检测方法，所述桃红四物汤的药物制剂的标准指纹图谱中，包括11个共有特征峰，以7号峰为内参考峰，各峰号的相对保留时间分别为：1号峰0.15，2号峰0.16，3号峰0.28，4号峰0.30，5号峰0.44，6号峰0.90，7号峰1，8号峰1.15，9号峰1.31，10号峰1.57，11号峰1.63；其中，7号峰为羟基红花黄色素A，8号峰为芍药苷，9号峰为阿魏酸。

本发明还提供上述方法在桃红四物汤的药物制剂的质量检测和质量控制中的应用。

与现有技术相比，本发明的上述技术方案具有以下优点：

(1)本发明所述建立桃红四物汤的药物制剂的方法，以桃红四物汤的药物制剂为检测对象，通过优化提取溶剂、提取时间、提取方法，使得桃红四物汤的药物制剂中各化学成分实现最大程度地被提取，通过优化色谱柱、流动相、流动相的洗脱方式，使得桃红四物汤的药物制剂中的各化学成分实现较好的分离，从而建立了针对该药物制剂的指纹图谱的方法，获得了较为全面的图谱信息；

(2)本发明所述建立桃红四物汤的药物制剂的方法，进一步通过优化选择7号峰羟基红花黄色素A作为指纹图谱中的内参考峰，确认了共有特征峰7号峰羟基红花黄色素A，8号峰芍药苷和9号峰阿魏酸，并确定了桃红四物汤颗粒的11个共有特征峰的相对保留时间，能够结合该指纹图谱中多个色谱峰的信息，能够全面地、系统地检测桃红四物汤颗粒的质量；

(3)本发明所述建立桃红四物汤的药物制剂的指纹图谱的方法具有稳定性高、精密度高、重复性好等优点；

(4)本发明所述建立桃红四物汤的药物制剂的指纹图谱的方法，进一步结合该药物制剂的其他成分的鉴别或含量测定方法，更加有利于其全面质量检测和整体质量控制，从而有助于提高该药物使用的安全性和稳定性。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：

图1是本发明桃红四物汤颗粒中桃仁、白芍、苦杏仁苷和芍药苷的鉴别TLC色谱图，其中，1为桃仁阴性制剂样品，2为白芍阴性制剂样品，3、4、5为供试品溶液，6为苦杏仁苷和芍药苷混合标准品，7为桃仁对照药材，8为白芍对照药材；

图2是本发明桃红四物汤颗粒中当归和川芎的鉴别TLC色谱图，其中，1、2、3为三批供试品溶液，4为川芎对照药材，5为当归对照药材，6为川芎和当归阴性制剂样品；

图3是本发明桃红四物汤颗粒中红花和羟基红花黄色素A的鉴别TLC色谱图，1为红花阴性制剂样品，2、3、4为三批供试品溶液，5为羟基红花黄色素A，6为红花对照药材；

图4是本发明桃红四物汤颗粒中苦杏仁苷的含量测定的HPLC色谱图，由上至下依次为供试品溶液、苦杏仁苷、辅料和桃仁阴性制剂样品；

图5是本发明桃红四物汤颗粒中羟基红花黄色素A、芍药苷和阿魏酸的含量测定的HPLC色谱图，由上至下依次为供试品溶液、辅料、红花阴性制剂样品、白芍阴性制剂样品、当归和川芎阴性制剂样品；

图6是本发明桃红四物汤颗粒中标准指纹图谱；

图7是本发明桃红四物汤颗粒标准指纹图谱及各药材提取物对照图；

图8是本发明桃红四物汤颗粒不同提取溶剂的指纹图谱对比图；

图9是本发明桃红四物汤颗粒不同提取时间的指纹图谱对比图；

图10是本发明桃红四物汤颗粒不同波长下指纹图谱对比图；

图11是本发明桃红四物汤颗粒指纹图谱3D图；

图12是本发明桃红四物汤颗粒指纹图谱于不同色谱柱的考察结果；

图13是本发明桃红四物汤颗粒不同流动相的指纹图谱对比图；

图14是本发明桃红四物汤颗粒不同流速的指纹图谱对比图；

图15是本发明桃红四物汤颗粒不同柱温的指纹图谱；

图16是本发明桃红四物汤颗粒精密度指纹图谱叠加图；

图17是本发明桃红四物汤颗粒精密度指纹图谱叠加匹配图；

图18是本发明桃红四物汤颗粒24h稳定性指纹图谱叠加图；

图19是本发明桃红四物汤颗粒24h稳定性指纹图谱叠加匹配图；

图20是本发明桃红四物汤颗粒重复性指纹图谱叠加图；

图21是本发明桃红四物汤颗粒重复性指纹图谱叠加匹配图；

图22是本发明桃红四物汤颗粒样品、辅料、20％甲醇的指纹图谱叠加图；

图23是本发明桃红四物汤颗粒样品两倍洗脱时间的指纹图谱；

图24是本发明桃红四物汤颗粒三批样品指纹图谱叠加图；

图25是本发明桃红四物汤颗粒三批样品指纹图谱叠加匹配图；

图26是本发明桃红四物汤颗粒对照指纹图谱；

图27是本发明桃红四物汤颗粒指纹图谱相关性对比图；

图28是本发明对比例1的HPLC色谱图。

具体实施方式

实施例1

桃红四物汤颗粒的原料药组成为：桃仁9g、红花6g、当归15g、川芎8g、白芍10g和熟地15g；

其制备方法为：分别取选定重量的桃仁、红花、当归、川芎、白芍和熟地，加水煎煮二次，第一次加水10倍量，浸泡30分钟，煎煮60分钟，第二次加水8倍量，煎煮30分钟，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至60℃下相对密度约为1.3，干燥，加入常规辅料，按照常规工艺，制成颗粒剂。

实施例2

本实施例建立桃红四物汤颗粒的指纹图谱的方法，包括如下步骤：

取待测桃红四物汤颗粒1.7g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为20％的甲醇水溶液25mL，称定重量，超声处理10分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

取羟基红花黄色素A适量，加体积浓度为25％的甲醇水溶液制成每1mL含羟基红花黄色素A100μg的溶液，即得对照品溶液；

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以Phenomenex Luna C18色谱柱为色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按如下程序进行梯度洗脱：0-12min，A：B为2％：98％；12-16min，A：B为2％：98％→5％：95％；16min，A：B为5％：95％；16-50min，A：B为5％：95％→18％：82％；50min，A：B为18％：82％；50-65min，A：B为18％：82％→27％：73％；65min，A：B为27％：73％；65-75min，A：B为27％：73％→50％：50％，75min，A：B为50％：50％；流速为1.0mL/min，柱温为30℃，检测波长为275nm，理论板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于3000；

分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。

实施例3

本实施例建立桃红四物汤颗粒的指纹图谱的方法，包括如下步骤：

取待测桃红四物汤颗粒1g，精密称定，置100mL具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为10％的甲醇水溶液50mL，称定重量，超声处理5分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

取羟基红花黄色素A适量，加体积浓度为10％的甲醇水溶液制成每1mL含羟基红花黄色素A 200μg的溶液，即得对照品溶液；

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以Phenomenex Luna C18色谱柱为色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.05％磷酸溶液为流动相B，按照如下程序进行进行梯度洗脱：0-3min，A：B为13％：87％；3-4min，A：B为13％：87％→10％：90％；4-60min，A：B为10％：90％；羟基红花黄色素A的检测波长为400nm，芍药苷的检测波长为230nm，阿魏酸的检测波长为316nm，按照如下梯度波长进行检测：0-16min，检测波长为400nm；16-17min，检测波长为400nm→230nm；17-45min，检测波长为230nm；45-46min，检测波长为230nm→316nm；46-60min，检测波长为316nm；流速为1.2mL/min，柱温为25℃，检测波长为275nm，理论板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于3000；

分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。

实施例4

本实施例建立桃红四物汤颗粒的指纹图谱的方法，包括如下步骤：

取待测桃红四物汤颗粒5g，精密称定，置20mL具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为50％的甲醇水溶液10mL，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

取羟基红花黄色素A适量，加体积浓度为50％的甲醇水溶液制成每1mL含羟基红花黄色素A 50μg的溶液，即得对照品溶液；

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以Phenomenex Luna C18色谱柱为色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.3％磷酸溶液为流动相B，按照如下程序进行进行梯度洗脱：0-3min，A：B为13％：87％；3-4min，A：B为13％：87％→10％：90％；4-60min，A：B为10％：90％；羟基红花黄色素A的检测波长为400nm，芍药苷的检测波长为230nm，阿魏酸的检测波长为316nm，按照如下梯度波长进行检测：0-16min，检测波长为400nm；16-17min，检测波长为400nm→230nm；17-45min，检测波长为230nm；45-46min，检测波长为230nm→316nm；46-60min，检测波长为316nm；流速为0.8mL/min，柱温为35℃，检测波长为275nm，理论板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于3000；

分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。

实施例5桃仁、白芍、苦杏仁苷和芍药苷的鉴别

本实施例桃仁、白芍、苦杏仁苷和芍药苷的鉴别包括如下步骤：

取待测桃红四物汤颗粒3g，研细，加甲醇25mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10mL微热使溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂(内径为2cm，柱高为10cm，加水20mL预洗一次)，用体积浓度为4％的氨溶液50mL洗脱，弃去氨液，再用水30mL洗脱，弃去水液，继用体积浓度为20％的乙醇水溶液30mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解，作为供试品溶液；

另取桃仁对照药材粗粉0.2g，加60～90℃的石油醚10mL，加热回流1小时，滤过，弃去石油醚，药渣挥干，加甲醇10mL，加热回流1小时，放冷，滤过，取滤液作为桃仁对照药材溶液；

取白芍对照药材粉末0.5g，加甲醇10mL，超声处理10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为白芍对照药材溶液；

取苦杏仁苷对照品，加甲醇制成每1mL含2mg的溶液，作为苦杏仁苷对照品溶液；

取芍药苷对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为芍药苷对照品溶液；

照薄层色谱法试验，分别吸取桃仁对照药材溶液、白芍对照药材溶液、苦杏仁苷对照品溶液、芍药苷对照品溶液和供试品溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为15∶40∶22∶10的三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水在5～10℃放置12小时的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茴香醛试液，于105℃加热至斑点显色清晰。

桃仁、白芍、苦杏仁苷和芍药苷的鉴别TLC色谱图如图1所示。

供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

实施例6当归和川芎的鉴别

本实施例当归和川芎的鉴别包括如下步骤：

取待测桃红四物汤颗粒5g，研细，加50mL甲醇，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20mL使溶解，用乙醚萃取2次，每次20mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解，作为供试品溶液；

取当归对照药材0.5g，加水20mL，超声处理15分钟，离心，上清液蒸至近干，加甲醇20mL，超声15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10mL使溶解，用乙醚萃取2次，每次10mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解，作为当归对照药材溶液；

取川芎对照药材1g，加水20mL，超声处理15分钟，离心，上清液蒸至近干，加甲醇20mL，超声15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10mL使溶解，用乙醚萃取2次，每次10mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解，制成川芎对照药材溶液；

照薄层色谱法试验，分别吸取当归对照药材溶液10μL、川芎对照药材溶液各10μL和供试品溶液5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为4∶1∶1∶0.1的环己烷：二氯甲烷：乙酸乙酯：甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365mn下检视。

当归和川芎的鉴别TLC色谱图如图2所示。

供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同顔色的荧光斑点。

实施例7红花和羟基红花光色素A的鉴别

本实施例当归和川芎的鉴别包括如下步骤：

取待测桃红四物汤颗粒2g，研细，加体积浓度为80％的丙酮溶液10mL，密塞，超声处理15分钟，静置，取上清液作为供试品溶液；

取红花对照药材0.5g，加体积浓度为80％的丙酮溶液10mL，密塞，超声处理15分钟，静置，取上清液作为红花对照药材溶液；

再取羟基红花黄色素A对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；

照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液、红花对照药材溶液、羟基红花黄色素A对照品溶液各2μL，分别点于同一聚酰胺薄膜板上，以体积浓度为4∶2∶7的甲醇-甲酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365mn下检视。

红花和羟基红花光色素A的鉴别TLC色谱图如图3所示。

供试品色谱中，应在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

实施例8苦杏仁苷的含量测定

本实施例苦杏仁苷的含量测定包括如下步骤：

取待测桃红四物汤颗粒1.7g，研细，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为20％的甲醇水溶液25mL，称定重量，超声处理10分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

取苦杏仁苷对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每1mL含苦杏仁苷250μg的溶液，即得对照品溶液；

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以含有体积浓度为13％的四氢呋喃的乙腈为流动相A、含有体积浓度为0.1％的磷酸的水为流动相B，以A：B体积比为5∶95混合液为流动相，柱温30℃，流速1.0mL/min；检测波长为275mn，理论板数按苦杏仁苷峰计算应不低于5000；

分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

苦杏仁苷的含量测定的HPLC色谱图如图4所示。

待测桃红四物汤颗粒每袋含桃仁以苦杏仁苷(C₂₀H₂₇NO₁₁)计，不得少于30.0mg。

实施例9羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸的含量测定

本实施例羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸的含量测定包括如下步骤：

取待测桃红四物汤颗粒1.7g，研细，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为20％的甲醇水溶液25mL，称定重量，超声处理10分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

分别精密称定羟基红花黄色素A、芍药苷和阿魏酸对照品适量，加甲醇制成每1mL含羟基红花黄色素A 100μg、芍药苷200μg、阿魏酸20μg的混合溶液，即得对照品溶液；

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以含有体积浓度为0.1％的磷酸水溶液为流动相B，按照如下程序进行进行梯度洗脱：0-3min，A：B为13％：87％；3-4min，A：B为13％：87％→10％：90％；4-60min，A：B为10％：90％；羟基红花黄色素A的检测波长为400nm，芍药苷的检测波长为230nm，阿魏酸的检测波长为316nm，按照如下梯度波长进行检测：0-16min，检测波长为400nm；16-17min，检测波长为400nm→230nm；17-45min，检测波长为230nm；45-46min，检测波长为230nm→316nm；46-60min，检测波长为316nm；理论板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于5000；

分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸的含量测定的HPLC色谱图如图5所示。

待测桃红四物汤颗粒每袋含红花以羟基红花黄色素A(C₂₇H₃₂O₁₆)计，不得少于12.5mg；含白芍以芍药苷(C₂₃H₂₈O₁₁)计，不得少于37.0mg；含当归和川芎以阿魏酸(C₁₀H₁₀O₄)计，不得少于2.0mg。

对比例1

本对比例建立桃红四物汤颗粒的指纹图谱的方法与实施例2的区别仅在于：照如下程序进行进行梯度洗脱：0-5min，A：B为0％：100％；5-70min，A：B为0％：100％→35％：65％；70-80min，A：B为35％：65％；其余实验条件与操作步骤均与实施例2相同。

本对比例的HPLC色谱图如图28所示。由图28可知，10-20分钟的色谱峰分离度较差，因此该梯度洗脱条件无法应用于建立指纹图谱。

实验例桃红四物汤颗粒标准指纹图谱检测方法学研究

1、仪器与试药

ThermoFisher U-3000HPLC(真空脱气机、低压四元泵、自动进样器、柱温箱、UV检测器)；分析天平，型号：BS124S和BP211D；超声仪，KQ-250型数控超声波清洗器，功率：250W，频率：40kHz。

磷酸(A.R.)，Lot：20150411，厂家：天津市大茂化学试剂厂；

甲醇(A.R.)，Lot：20150520，厂家：天津赛孚世纪科技发展有限公司；

乙腈(HPLC)，Lot：AC-19051204，天津市彪仕奇科技发展有限公司；

水，纯净水。

样品：三批实施例1制备的桃红四物汤颗粒

对照品：羟基红花黄色素A、阿魏酸、毛蕊花糖苷、芍药苷、藁本内酯。

2、方法的选择

桃红四物汤颗粒的化学成分比较复杂，含有黄酮类、氰苷类、有机酸类、多糖类等，其中黄酮类为主要化学成分，因此选择HPLC方法最为合适，HPLC方法较其他方法具有准确度高、误差小、重现性好、应用广泛等优点。

3、参照物的选择及制备

桃红四物汤颗粒的标准指纹图谱如图6所示。由图6可知，桃红四物汤颗粒的标准指纹图谱中具有共同的11个色谱峰，以7号峰为内参考峰，各峰号的相对保留时间分别为：1号峰0.15，2号峰0.16，3号峰0.28，4号峰0.30，5号峰0.44，6号峰0.90，7号峰1，8号峰1.15，9号峰1.31，10号峰1.57，11号峰1.63；其中峰7(S)为羟基红花黄色素A，峰8为芍药苷，峰9为阿魏酸，峰1、2为桃仁中所含成分，峰3、4为白芍中所含成分，峰5、6为当归中所含成分，峰10、11为川芎中所含成分。

取各药材含量测定使用的对照品溶液，照指纹图谱检测方法检测，对应色谱峰见图7，图谱中羟基红花黄色素A的色谱峰峰型、与相邻色谱峰分离效果均较好，故确定使用该成分为指纹图谱参照物。

4、供试品溶液制备

4.1提取溶剂考察

取实施例1制备的桃红四物汤颗粒，研细，取1g，精密称定，置50ml具塞三角瓶内，称取5份，分别加入25mL溶剂(水、20％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、甲醇)，称重，超声20min，放冷后，补重，摇匀，滤过，进高效液相检测，结果如图8所示。结果显示，不同浓度的甲醇溶液对色谱峰的数目影响不大。

4.2提取时间考察

取实施例1制备的桃红四物汤颗粒，研细，取1g，精密称定，置50mL具塞三角瓶内，称取3份，均加入25mL70％甲醇，称重，分别超声10min、20min、30min，放冷后，补重，摇匀，滤过，进高效液相检测，检测结果见图9。由图9可知，提取时间对色谱峰的数目影响不大，即选择提取10min即可。

5、色谱条件与系统适用性试验

5.1检测波长的考察

采用二极管阵列检测器对颗粒样品进行全波长检测，根据收集的三维图谱，并同时收集210nm、235nm、254nm、275nm、320nm、400nnm波长处的图谱，结果如图10～图11所示。综合考察，由图10～图11可知，颗粒样品在275nm波长处的各色谱峰相应比较均衡，因此最后确定275nm为桃红四物颗粒指纹图谱的检测波长。

5.2色谱柱的考察

分别考察了Agilent Zorbax SB-C18、Phenomenex Luna C18、Alchrom Bohd-AQC18三种色谱柱，结果如图12所示。由图12可知，Phenomenex Luna C18色谱柱分离效果好，峰形较好，故选用Phenomenex Luna C18色谱柱，并规定理论板数按羟基红花黄色素A计算不得低于5000。

5.3流动相的考察

选择三种流动相系统：乙腈-0.1％磷酸溶液梯度系统、乙腈-0.1％甲酸溶液梯度系统和乙腈-水梯度系统，结果如图13所示。由图13可知，以乙腈-0.1％磷酸溶液梯度系统为佳，各色谱峰分离度好，保留时间适中，故选择乙腈-0.1％磷酸溶液梯度系统为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱流程见表1。

表1梯度洗脱比例表

时间(分钟)	乙腈(％)	0.1％酸溶液(％)
			0～12	2→2	98→98
12～16	2→5	98→95
			16～50	5→18	95→82
50～65	18→27	82→73
			65～75	27→50	73→50

5.4流速的考察

分别用0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min的流速进行测定，考察本品在流速发生微小变化时各个色谱峰的变化情况，结果如图14所示。由图14可知，流速选择1.0mL/min即可。

5.5柱温的考察

不同柱温考察：分别设计25℃、30℃、35℃柱温进行测定，考察本品在柱温发生变化时各个色谱峰的相对保留时间的变化，结果如图15所示。结果显示，柱温选择30℃即可。

通过上述考察研究，最后确定指纹图谱的色谱条件为：选用Phenomenex Luna C18色谱柱；以乙腈-0.1％磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长为275nm。

6、方法学考察

6.1精密度实验

取实施例1制备的，按实施例2中供试品溶液的制备方法制备，连续进样6次，检测指纹图谱，实验结果如图16～图17所示，相似度计算结果见表2。由表2可知，各色谱峰的相似度均达到0.95以上，符合指纹图谱的要求，说明仪器精密度良好。

表2精密度考察结果

6.2稳定性实验

取实施例1制备的桃红四物汤颗粒，按正文供试品溶液的制备方法制备，分别在0、3、6、12、15、18小时检测指纹图谱，实验结果见图18-图19，相似度计算结果见表3。由表3可知，各色谱峰的相似度均达到0.95以上，符合指纹图谱的要求，说明溶液至少在20小时内稳定。

表3稳定性考察结果

6.3重复性实验

取本品，按正文供试品溶液的制备方法制备供试品6份，检测指纹图谱，实验结果见图20-图21，相似度计算结果见表4。由表4可知，各色谱峰的相似度均达到0.95以上，说明该方法的重复性良好，符合指纹图谱的要求。

表4重复性考察结果

6.4样品指纹图谱分析

通过方法学验证，证明此方法可行，因此我们对三批生产颗粒样品(批号2016080501、2016080502、2016080503)进行了指纹图谱分析，结果见图24-图25，相似度结果见表5。

说明：方法学考察所使用的样品为大生产样品，以下分别是空白流动相、20％甲醇溶剂、辅料、二倍保留时间的供试品(图22-图23)的图谱。二倍保留时间的供试品图谱证明供试品在75分钟后再无其他色谱峰。

表5三批颗粒样品的相似度结果

6.5参照图谱的确定

对3批代表性供试品指纹图谱的检测结果进行了分析、比较，选择批号为2016080501的供试品的指纹图谱作为参照图谱。因为该供试品相对保留时间较接近于4批供试品的平均相对保留时间，且相似度、分离度较好，为较典型的指纹图谱。

6.6共有指纹峰的标定

对3批代表性供试品指纹图谱的检测结果，取每批供试品指纹图谱中都出现的典型色谱峰作为共有指纹峰，共11个共有峰，其中7号峰为羟基红花黄色素A的色谱峰，以“S”表示，各色谱峰分别以1～11的序号表示。见图26。

6.7部分共有峰的峰形描述

本品指纹图谱显示11个色谱峰，其中：1和2号峰极性较大，出峰较早，3和4保留时间较接近，色谱峰较大，5、10色谱峰较大，分离度较好，6和11号峰较小，7(S)峰为羟基红花黄色素A，8号峰为芍药苷，9号峰为阿魏酸。

6.8桃红四物汤颗粒的指纹图谱相似度检测标准的制定

利用药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统，2012版》软件，将三批试生产颗粒样品的指纹图谱进行了相似度计算，计算结果见表6，并生成对照图谱，结果见图26。由图26可知，具有共同的11个色谱峰，其中峰7(S)为羟基红花黄色素A，峰8为芍药苷，峰9为阿魏酸；三批颗粒与共有模式相比，相似度值均高于0.950，因目前数据量少，故暂规定：本品供试品指纹图谱中应分别呈现与对照指纹图谱色谱峰保留时间相同的色谱峰。按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.90。

6.9桃红四物汤颗粒的相关性考察

为进一步说明上述各色谱峰的来源，我们进行了相关性考察。照“颗粒制备工艺”，分别制备桃仁、红花、当归、川芎、白芍、熟地黄药材单煎液，计算取样量，提取液减压蒸干后按照“供试品溶液的制备方法”分别制成各单味药材供试品溶液，在已确定的色谱条件下，分别检测药材供试品溶液和成品供试品溶液，确定颗粒样品指纹图谱中各峰色谱的归属，色谱图如图27所示。

分析颗粒指纹图谱中5～75min的色谱峰，色谱峰较明显的有21个色谱峰，通过单味药材图谱对比分析这21个色谱峰归属，结果如表6所示。

表6桃红四物汤颗粒指纹图谱色谱峰归属

由表6可知，色谱峰14代表的为羟基红花黄色素A，色谱峰15代表的为芍药苷，色谱峰16代表的为阿魏酸。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (9)

1.一种桃红四物汤的药物制剂的检测方法，其特征在于，

该方法包括如下建立桃红四物汤的药物制剂的指纹图谱的方法的步骤：

取待测药物制剂1~5重量份，精密称定，置20~100mL具塞锥形瓶中，精密加入水或体积浓度为20%~70%的甲醇水溶液或甲醇10~50体积份，称定重量，超声处理10~30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

取羟基红花黄色素A适量，加水或体积浓度为20%~70%的甲醇水溶液或甲醇制成每1mL含羟基红花黄色素A50~200μg的溶液，即得对照品溶液；

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0.05%~0.3%磷酸溶液为流动相B，按如下程序进行梯度洗脱：0-12min，A：B为2%：98%；12-16min，A：B为2%：98%→5%：95%；16min，A：B为5%：95%；16-50min，A：B为5%：95%→18%：82%；50min，A：B为18%：82%；50-65min，A：B为18%：82%→27%：73%；65min，A：B为27%：73%；65-75min，A：B为27%：73%→50%：50%，75min，A：B为50%：50%；流速为0.8~1.2mL/min，柱温为25~35℃，检测波长为210-400nm，理论板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于3000；

分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各5~20μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得；

所述重量份与所述体积份的关系为g/mL；

还包括如下鉴别或含量测定方法中的至少一种：

B、桃仁、白芍、苦杏仁苷和芍药苷的鉴别

取待测药物制剂1~5重量份，研细，加甲醇10~50体积份，超声处理10~60分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水5~20体积份微热使溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂，用体积浓度为1~10%的氨溶液10~100体积份洗脱，弃去氨液，再用水10~50体积份洗脱，弃去水液，继用体积浓度为10%~40%的乙醇水溶液10~50体积份洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1~5体积份使溶解，作为供试品溶液；

另取桃仁对照药材粗粉0.1~0.5重量份，加60~90℃的石油醚5~20体积份，加热回流0.5~2小时，滤过，弃去石油醚，药渣挥干，加甲醇5~20体积份，加热回流0.5~2小时，放冷，滤过，取滤液作为桃仁对照药材溶液；

取白芍对照药材粉末0.1~1重量份，加甲醇5~20体积份，超声处理5~30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇0.5~2体积份使溶解，作为白芍对照药材溶液；

取苦杏仁苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.5~5mg的溶液，作为苦杏仁苷对照品溶液；

取芍药苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.5~3mg的溶液，作为芍药苷对照品溶液；

照薄层色谱法试验，分别吸取桃仁对照药材溶液、白芍对照药材溶液、苦杏仁苷对照品溶液、芍药苷对照品溶液和供试品溶液各1~10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为15∶40∶22∶10的三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水在5~10℃放置5~20小时的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茴香醛试液，于105℃加热至斑点显色清晰；

C、当归和川芎的鉴别

取待测药物制剂2~10重量份，研细，加20~100体积份甲醇，超声处理10~60分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10~40体积份使溶解，用乙醚萃取1~3次，每次10~30体积份，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇1~5体积份使溶解，作为供试品溶液；

取当归对照药材0.1~1重量份，加水10~50体积份，超声处理5~30分钟，离心，上清液蒸至近干，加甲醇10~30体积份，超声5~30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水5~20体积份使溶解，用乙醚萃取1~3次，每次5~20体积份，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇1~5体积份使溶解，作为当归对照药材溶液；

取川芎对照药材0.5~3重量份，加水10~30体积份，超声处理10~30分钟，离心，上清液蒸至近干，加甲醇10~30体积份，超声5~30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水5~20体积份使溶解，用乙醚萃取1~3次，每次5~20体积份，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇1~3体积份使溶解，制成川芎对照药材溶液；

照薄层色谱法试验，分别吸取当归对照药材溶液5~15μL、川芎对照药材溶液各5~15μL和供试品溶液2~10μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以体积比为4∶1∶1∶0.1的环己烷：二氯甲烷：乙酸乙酯：甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365mn下检视；

D、红花和羟基红花光色素A的鉴别

取待测药物制剂0.5~5重量份，研细，加体积浓度为50%~90%的丙酮溶液5~20体积份，密塞，超声处理5~30分钟，静置，取上清液作为供试品溶液；

取红花对照药材0.1~1重量份，加体积浓度为50%~90%的丙酮溶液5~20体积份，密塞，超声处理5~30分钟，静置，取上清液作为红花对照药材溶液；

再取羟基红花黄色素A对照品，加甲醇制成每1mL含0.1~1mg的溶液，作为对照品溶液；

照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液、红花对照药材溶液、羟基红花黄色素A对照品溶液各1~5μL，分别点于同一聚酰胺薄膜板上，以体积浓度为4∶2∶7的甲醇-甲酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365mn下检视；

E、苦杏仁苷的含量测定

取待测药物制剂1~3重量份，研细，精密称定，置20~100mL具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为10%~50%的甲醇水溶液10~50体积份，称定重量，超声处理5~30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

取苦杏仁苷对照品适量，精密称定，加50~90%甲醇制成每1mL含苦杏仁苷100~500μg的溶液，即得对照品溶液；

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以含有体积浓度为10~20%的四氢呋喃的乙腈为流动相A、含有体积浓度为0.05~0.2%的磷酸的水为流动相B，以A：B体积比为5∶95混合液为流动相，柱温25~35℃，流速0.5~1.5mL/min；检测波长为270~280mn，理论板数按苦杏仁苷峰计算应不低于5000；

分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各5~20μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.根据权利要求1所述的桃红四物汤的药物制剂的检测方法，其特征在于，在建立桃红四物汤的药物制剂的指纹图谱的方法的步骤中，以Phenomenex Luna C18色谱柱为色谱柱。

3.根据权利要求1或2所述的桃红四物汤的药物制剂的检测方法，其特征在于，所述建立桃红四物汤的药物制剂的指纹图谱的方法具体如下：

取待测药物制剂1.7重量份，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为20%的甲醇水溶液25体积份，称定重量，超声处理10分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

取羟基红花黄色素A适量，加体积浓度为25%的甲醇水溶液制成每1mL含羟基红花黄色素A100μg的溶液，即得对照品溶液；

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B；

分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。

4.根据权利要求1或2所述的桃红四物汤的药物制剂的检测方法，其特征在于，还包括如下含量测定方法：

F、羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸的含量测定

取待测药物制剂1~3重量份，研细，精密称定，置20~100mL具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为10%~50%的甲醇水溶液10~50体积份，称定重量，超声处理5~30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

分别精密称定羟基红花黄色素A、芍药苷和阿魏酸对照品适量，加甲醇制成每1mL含羟基红花黄色素A 50~150μg、芍药苷150~250μg、阿魏酸10~30μg的混合溶液，即得对照品溶液；

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以含有体积浓度为0.05~0.15%的磷酸水溶液为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0-3min，A：B为13%：87%；3-4min，A：B为13%：87%→10%：90%；4-60min，A：B为10%：90%；羟基红花黄色素A的检测波长为400nm，芍药苷的检测波长为230nm，阿魏酸的检测波长为316nm，按照如下梯度波长进行检测：0-16min，检测波长为400nm；16-17min，检测波长为400nm→230nm；17-45min，检测波长为230nm；45-46min，检测波长为230nm→316nm；46-60min，检测波长为316nm；理论板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于5000；

分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各5~20μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

5.根据权利要求4所述的桃红四物汤的药物制剂的检测方法，其特征在于，所述鉴别或含量测定方法具体如下：

B、桃仁、白芍、苦杏仁苷和芍药苷的鉴别

取待测药物制剂3重量份，研细，加甲醇25体积份，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10体积份微热使溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂，用体积浓度为4% 的氨溶液50体积份洗脱，弃去氨液，再用水30体积份洗脱，弃去水液，继用体积浓度为20%的乙醇水溶液30体积份洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2体积份使溶解，作为供试品溶液；

另取桃仁对照药材粗粉0.2重量份，加60~90℃的石油醚10体积份，加热回流1小时，滤过，弃去石油醚，药渣挥干，加甲醇10体积份，加热回流1小时，放冷，滤过，取滤液作为桃仁对照药材溶液；

取白芍对照药材粉末0.5重量份，加甲醇10体积份，超声处理10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1体积份使溶解，作为白芍对照药材溶液；

取苦杏仁苷对照品，加甲醇制成每1mL含2mg的溶液，作为苦杏仁苷对照品溶液；

取芍药苷对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为芍药苷对照品溶液；

照薄层色谱法试验，分别吸取桃仁对照药材溶液、白芍对照药材溶液、苦杏仁苷对照品溶液、芍药苷对照品溶液和供试品溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为15∶40∶22∶10的三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水在5~10℃放置12小时的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茴香醛试液，于105℃加热至斑点显色清晰；

C、当归和川芎的鉴别

取待测药物制剂5重量份，研细，加50体积份甲醇，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20体积份使溶解，用乙醚萃取2次，每次20体积份，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇2体积份使溶解，作为供试品溶液；

取当归对照药材0.5重量份，加水20体积份，超声处理15分钟，离心，上清液蒸至近干，加甲醇20体积份，超声15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10体积份使溶解，用乙醚萃取2次，每次10体积份，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇2体积份使溶解，作为当归对照药材溶液；

取川芎对照药材1重量份，加水20体积份，超声处理15分钟，离心，上清液蒸至近干，加甲醇20体积份，超声15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10体积份使溶解，用乙醚萃取2次，每次10体积份，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇2体积份使溶解，制成川芎对照药材溶液；

照薄层色谱法试验，分别吸取当归对照药材溶液10μL、川芎对照药材溶液各10μL和供试品溶液5μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以体积比为4∶1∶1∶0.1的环己烷：二氯甲烷：乙酸乙酯：甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365mn下检视；

D、红花和羟基红花光色素A的鉴别

取待测药物制剂2重量份，研细，加体积浓度为80%的丙酮溶液10体积份，密塞，超声处理15分钟，静置，取上清液作为供试品溶液；

取红花对照药材0.5重量份，加体积浓度为80%的丙酮溶液10体积份，密塞，超声处理15分钟，静置，取上清液作为红花对照药材溶液；

再取羟基红花黄色素A对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；

照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液、红花对照药材溶液、羟基红花黄色素A对照品溶液各2μL，分别点于同一聚酰胺薄膜板上，以体积浓度为4∶2∶7的甲醇-甲酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365mn下检视；

E、苦杏仁苷的含量测定

取待测药物制剂1.7重量份，研细，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为20%的甲醇水溶液25体积份，称定重量，超声处理10分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

取苦杏仁苷对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成每1mL含苦杏仁苷250μg的溶液，即得对照品溶液；

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以含有体积浓度为13%的四氢呋喃的乙腈为流动相A、含有体积浓度为0.1%的磷酸的水为流动相B，以A：B体积比为5∶95混合液为流动相，柱温30℃，流速1.0mL/min；检测波长为275mn，理论板数按苦杏仁苷峰计算应不低于5000；

分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得；

F、羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸的含量测定

取待测药物制剂1.7重量份，研细，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为20%的甲醇水溶液25体积份，称定重量，超声处理10分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

分别精密称定羟基红花黄色素A、芍药苷和阿魏酸对照品适量，加甲醇制成每1mL含羟基红花黄色素A 100μg、芍药苷200μg、阿魏酸20μg的混合溶液，即得对照品溶液；

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以含有体积浓度为0.1%的磷酸水溶液为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0-3min，A：B为13%：87%；3-4min，A：B为13%：87%→10%：90%；4-60min，A：B为10%：90%；羟基红花黄色素A的检测波长为400nm，芍药苷的检测波长为230nm，阿魏酸的检测波长为316nm，按照如下梯度波长进行检测：0-16min，检测波长为400nm；16-17min，检测波长为400nm→230nm；17-45min，检测波长为230nm；45-46min，检测波长为230nm→316nm；46-60min，检测波长为316nm；理论板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于5000；

分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

6.根据权利要求1或2所述的桃红四物汤的药物制剂的检测方法，其特征在于，所述桃红四物汤的原料药组成为：桃仁7.2~10.8重量份、红花4.8~7.2重量份、当归12~18重量份、川芎6.4~9.6重量份、白芍8~12重量份、熟地12~18重量份。

7.根据权利要求1或2所述的桃红四物汤的药物制剂的检测方法，其特征在于，

所述桃红四物汤的药物制剂通过以下方法制备而成：分别取选定重量份的桃仁、红花、当归、川芎、白芍和熟地，加水煎煮，滤过，滤液减压浓缩至60℃下相对密度为1.2~1.4，干燥，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的药物制剂；

所述药物制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。

8.根据权利要求1或2所述的桃红四物汤的药物制剂的检测方法，其特征在于，所述桃红四物汤的药物制剂的标准指纹图谱中，包括11个共有特征峰，以7号峰为内参考峰，各峰号的相对保留时间分别为：1号峰0.15，2号峰0.16，3号峰0.28，4号峰0.30，5号峰0.44，6号峰0.90，7号峰1，8号峰1.15，9号峰1.31，10号峰1.57，11号峰1.63；其中，7号峰为羟基红花黄色素A，8号峰为芍药苷，9号峰为阿魏酸。

9.权利要求1-8任一项所述的方法在桃红四物汤的药物制剂的质量检测和质量控制中的应用。

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