CN114924021B - 一种桃红四物汤方剂的检测方法 - Google Patents
一种桃红四物汤方剂的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种桃红四物汤颗粒的检测方法，涉及药品检测技术领域。该检测方法能通过薄层色谱技术对桃红四物汤颗粒进行鉴别，该检测方法中的第一展开剂包括甲苯、乙酸乙酯、甲醇和甲酸，第二展开剂包括三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和水；同时，该检测方法还能通过高效液相色谱技术对桃红四物汤颗粒进行指纹图谱检测。
Description
技术领域
本发明涉及药品检测技术领域，特别是涉及一种桃红四物汤方剂的检测方法。
背景技术
桃红四物汤源自清代柴得华的《妇科冰鉴》，原文记载“血多有块，色紫稠黏者，有瘀停也，桃红四物汤随其流以逐之”；具有活血祛瘀，养血调经之功效，主治妇女月经不调，血多有块，色紫质粘，腹痛腹胀等。临床用于血行瘀滞所致的妇科病症，例如闭经、痛经、更年期综合征、不孕症、慢性盆腔炎等。桃红四物汤方剂由酒地黄、酒当归、酒白芍、川芎、燀桃仁和酒红花等6味药味组成，是清代以来临床应用广泛的经典名方，具有良好的临床价值和开发前景。
目前我国未批准桃红四物汤方剂中成药上市，因此未有法定标准的桃红四物汤方剂的质量控制方法。如何建立桃红四物汤方剂药味准确、科学、快捷的质量控制方法，来保障桃红四物汤方剂的质量，以及如何评估桃红四物汤方剂成药过程的科学性，是开展桃红四物汤方剂必须解决的关键问题。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供一种桃红四物汤方剂的检测方法，该检测方法能通过薄层色谱技术对桃红四物汤方剂进行鉴别，并且能够通过高效液相色谱技术对桃红四物汤方剂进行检测。
为了达到上述目的，本发明提供了一种桃红四物汤方剂的检测方法，
该检测方法包括：薄层色谱鉴别方法，所述鉴别方法包括以下步骤：制备薄层供试品溶液：称取待测桃红四物汤方剂，加水溶解，有机溶剂萃取，得到有机溶剂萃取液，蒸干，得到残渣，加有机溶剂溶解，得到薄层供试品溶液；制备第一对照药材溶液：称取第一对照药材，加水，回流提取，滤过，得到滤液，有机溶剂萃取，得到有机溶液萃取液，蒸干，得到残渣，加有机溶剂溶解，得到第一对照药材溶液；所述第一对照药材包括以下对照药材中的至少1种：川芎、当归、白芍或地黄；第一薄层色谱分析：吸取所述薄层供试品溶液、所述第一对照药材溶液，分别点于同一薄层板，以第一展开剂展开，取出，晾干，进行第一检视；所述第一展开剂包括：甲苯、乙酸乙酯、甲醇和甲酸；制备第二对照药材溶液：称取第二对照药材，加水，回流提取，滤过，得到滤液，有机溶剂萃取，得到有机溶剂萃取液，蒸干，得到残渣，加有机溶剂溶解，得到第二对照药材溶液；所述第二对照药材包括红花；第二薄层色谱分析：吸取所述薄层供试品溶液、所述第二对照药材溶液，分别点于同一薄层板，以第二展开剂展开，取出，晾干，进行第二检视；所述第二展开剂包括：三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和水。采用上述溶剂作为展开剂，仅需采用2个薄层色谱展开系统，进行2次薄层展开检测实验，就能检测出桃红四物汤方剂中川芎、当归、白芍、地黄和红花5种药味的检测能力；同时具有有机溶剂使用量少，绿色环保，检测次数少，检测成本低，检测速度快，效率高等优势。
在其中一个实施例中，所述第一展开剂中，甲苯、乙酸乙酯、甲醇和甲酸的体积比为13-17：4-6：2-4：1-2；所述第二展开剂中，三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为13-17：35-45：20-24：8-12。采用上述体积比的溶剂作为第一展开剂，具有一次检测就能检测川芎、当归、白芍、地黄4种药味的能力，具有有机溶剂使用量少，绿色环保，检测成本低，快速高效等优势；采用上述体积比的溶剂作为第二展开剂，具有斑点分离好，清晰集中，快速科学，稳定灵敏等优势。
在其中一个实施例中，所述第一薄层色谱分析步骤中，所述第一检视包括以下步骤：采用紫外光对薄层板进行检视，对川芎和当归进行检测；喷涂香草醛硫酸溶液，加热，在日光下检视薄层板，对白芍和地黄进行检测。
在其中一个实施例中，所述第二薄层色谱分析步骤中，所述第二检视包括以下步骤：对薄层板喷涂硫酸乙醇溶液，加热，采用紫外光进行检视，对红花进行检测。
在其中一个实施例中，所述检测方法还包括指纹图谱检测方法，所述指纹图谱检测方法包括以下步骤：
制备液相供试品溶液：精密称取待测桃红四物汤方剂，加水溶解，混合均匀，滤过，取滤液，得到液相供试品溶液；制备对照品溶液：精密称取对照品，加甲醇溶解，得到所述对照品溶液；高效液相色谱检测：分别精密吸取所述对照品溶液与所述液相供试品溶液，注入高效液相色谱仪以预定液相条件测定。
在其中一个实施例中，所述对照品包括以下原料中的至少1种：没食子酸、绿原酸、羟基红花黄色素、芍药苷或阿魏酸。
在其中一个实施例中，所述预定液相条件包括：固定相：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相：以乙腈为流动相A，体积百分比浓度为0.05％的磷酸水溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式。
在其中一个实施例中，所述梯度洗脱的条件为：0min-60min，流动相A的体积百分数由5％变化至25％；60min-90min，流动相A的体积百分数由25％变化至85％。
在其中一个实施例中，所述预定液相条件还包括：所述色谱柱为Agilent VenusilMP C18色谱柱；柱温：25-35℃。
在其中一个实施例中，所述桃红四物汤方剂的剂型为颗粒剂，所述颗粒剂的辅料包括：麦芽糊精。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的检测方法，能通过薄层色谱技术对桃红四物汤颗粒进行鉴别，该检测方法中的第一展开剂包括甲苯、乙酸乙酯、甲醇和甲酸，第二展开剂包括三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和水；同时，该检测方法还能通过高效液相色谱技术对桃红四物汤颗粒进行检测。
附图说明
图1为实施例3中自拟展开系统：甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(15：5：3：1.8)的薄层图谱，其中，A1为紫光灯下检视结果，B1为日光下检视结果。图2为实施例3中展开系统Ⅰ：乙酸乙酯-甲醇-甲酸(16：0.5：2)的薄层图谱，其中，A2为紫光灯下检视结果，B2为日光下检视结果。图3为实施例3中展开系统Ⅱ：环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(4：1：1：0.1)的薄层图谱，其中，A3为紫光灯下检视结果，B3为日光下检视结果。图4为实施例3中展开系统Ⅲ：三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40:5:10:0.2)的薄层图谱，其中，A4为紫光灯下检视结果，B4为日光下检视结果。图5为实施例3中展开系统Ⅳ：正己烷-乙酸乙酯(3:1)的薄层图谱，其中，A5为紫光灯下检视结果，B5为日光下检视结果。图6为实施例3中自拟展开系统：三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15：45：22：10)5510℃放置12小时的下层溶液薄层图谱。图7为实施例3中展开系统Ⅴ：乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7：2：3：0.4)薄层图谱。图8为实施例3中展开系统Ⅵ：正丁醇-冰醋酸-水(6：2.4：5)薄层图谱。图9为实施例4中指纹图谱，其中，图9中的a、b为采用甲醇为流动相A，采用体积百分比浓度为0.05％的磷酸水溶液为流动相B时，不同梯度洗脱条件得到的指纹图谱。图10-图15为实施例4中指纹图谱，其中，图10中的a、b，图11中的a、b，图12中的a、b，图13中的a、b，图14中的a、b，图15为采用乙腈为流动相A，采用体积百分比浓度为0.05％的磷酸水溶液为流动相B时，不同梯度洗脱条件得到的指纹图谱。图16-图21为实施例5中通过不同提取条件制备得到桃红四物汤颗粒，再采用实施例3中(13)的指纹图谱控制方法进行测定，得到的指纹图谱。图22为图16中a、b的对比结果图，其中，1为THSWT-T-20210608-01，2为THSWT-T-20210608-02。图23为图17的a、b和图18的a对比结果图，其中，3为THSWT-T-20210609-01，4为THSWT-T-20210609-02，5为THSWT-T-20210609-03。图24为图18的b和图19的a对比结果图，其中，6为THSWT-T-20210610-01，7为THSWT-T-20210610-02。图25为图19的b和图20的a对比结果图，其中，8为THSWT-T-20210611-01，9为THSWT-T-20210611-02。图26为图20的b和图21对比结果图，其中，10为THSWT-T-20210615-01，11为THSWT-T-20210902-01。图27为图16的a、图17的a和图18的b对比结果图，其中，12为THSWT-T-20210608-01，13为THSWT-T-20210609-01，14为THSWT-T-20210610-01。图28为图16的a、图19的b、图20的b对比结果图，其中，15为THSWT-T-20210608-01，16为THSWT-T-20210611-01，17为THSWT-T-20210615-01。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本实施例所用试剂、材料、设备如无特殊说明，均为市售来源；实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规实验方法。
实施例1
制备桃红四物汤颗粒。
处方饮片加水煎煮二次，每次加8倍水，煎煮30分钟，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.05～1.20(70℃)的清膏，加入适量麦芽糊精，搅匀，干燥，制成1000g颗粒，即得。
实施例2
一种桃红四物汤颗粒的薄层色谱鉴别方法。
1、制备薄层供试品溶液。
取实施例1制备得到的桃红四物汤颗粒3g，加水40ml使溶解，用乙酸乙酯萃取2次，每次40ml，合并乙酸乙酯萃取液，水浴蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为薄层供试品溶液。
2、制备第一对照药材溶液。
另取川芎对照药材、当归对照药材、白芍对照药材、地黄对照药材各1g，分别加水40ml，回流提取1小时，滤过，滤液用乙酸乙酯萃取2次，每次40ml，合并乙酸乙酯萃取液，水浴蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为第一对照药材溶液。
3、第一薄层色谱分析。
照薄层色谱法(《中国药典》四部通则0502)试验，吸取上述供试品溶液15μl、川芎对照药材溶液3μl、当归对照药材溶液10μl、白芍对照药材溶液3μl及地黄对照药材溶液13μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(体积比为15：5：3：1.8)为展开剂，展开，取出，晾干，在紫外光(365nm)下检视。供试品色谱中，在与川芎对照药材、当归对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点。喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃下加热至斑点显色清晰，在日光下检视。供试品色谱中，与白芍对照药材、地黄对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
4、制备第二对照药材溶液。
取红花对照药材1g，加水40ml，回流提取1小时，滤过，滤液用乙酸乙酯萃取2次，每次40ml，合并乙酸乙酯萃取液，水浴蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为第二对照药材溶液。
5、第二薄层色谱分析。
照薄层色谱法(《中国药典》四部通则0502)试验，吸取(1)项下供试品溶液5μl、红花对照药材溶液2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(体积比为15：40：22：10)5510℃放置12小时的下层溶液展开为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视，供试品色谱中，在与红花对照药材色谱三个绿色荧光斑点中上Rf值较大的2个斑点相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
实施例3
一种桃红四物汤颗粒的薄层色谱检测方法。
1、制备薄层色谱供试品溶液。
取实施例1制备得到的桃红四物汤颗粒3g，加水40ml使溶解，用乙酸乙酯萃取2次，每次40ml，合并乙酸乙酯萃取液，水浴蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为薄层供试品溶液。
2、制备对照药材溶液。
另取川芎对照药材、当归对照药材、白芍对照药材、地黄对照药材、红花对照药材各1g，分别加水40ml，回流提取1小时，滤过，滤液用乙酸乙酯萃取2次，每次40ml，合并乙酸乙酯萃取液，水浴蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。
3、制备阴性对照溶液。
按照桃红四物汤颗粒处方比例，分别称取和实施例1相比只缺少酒当归与川芎的处方饮片、和实施例1相比只缺少酒白芍的处方饮片、和实施例1相比只缺少酒地黄的处方饮片、和实施例1相比只缺少酒红花的处方饮片，按照桃红四物汤的煎煮方法，分别制得当归与川芎双阴性对照溶液、白芍阴性对照溶液、地黄阴性对照溶液和红花阴性对照溶液。
4、薄层色谱展开系统筛选。
参考《中国药典》2020年版一部“地黄”、“当归”、“白芍”、“川芎”、“红花”及“安儿宁”鉴别项下方法，采用以下展开条件与自拟展开条件进行筛选对比：(1)展开系统Ⅰ，同“地黄”鉴别(3)项下的展开剂：乙酸乙酯-甲醇-甲酸(16：0.5：2)；(2)展开系统Ⅱ，同“当归”鉴别(3)项下的展开剂：环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(4：1：1：0.1)；(3)展开系统Ⅲ，同“白芍”鉴别(2)项下的展开剂：三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40:5:10:0.2)；(4)展开系统Ⅳ，同“川芎”鉴别(3)项下的展开剂：正己烷-乙酸乙酯(3:1)；(5)展开系统Ⅴ，同“红花”鉴别(2)项下的展开剂：乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7：2：3：0.4)；(6)展开系统Ⅵ，同“安儿宁颗粒”鉴别(1)项下的展开剂：正丁醇-冰醋酸-水(6：2.4：5)。
5、薄层色谱展开系统结果对比和确定。
(1)川芎、当归、白芍、地黄薄层鉴别展开条件对比试验方法与结果。
吸取上述供试品溶液、各对照药材溶液及各阴性对照溶液，分别点于硅胶G薄层板上，分别以自拟展开剂条件甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(15：5：3：1.8)、展开系统Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视；喷以5％香草醛硫酸试液，在105℃加热至斑点显色清晰，在日光下检视。结果如图1-5所示，T：19℃，RH：77％，A：未显色(365nm)，B：5％香草醛硫酸溶液显色(日光)，S1、S2、S3-供试品溶液(THSWT-W-20210528-01、THSWT-W-20210528-03、THSWT-W-20210528-05)；1-川芎当归双阴性对照、2-川芎对照药材、3-当归对照药材、4-白芍对照药材、5-地黄对照药材、6-白芍阴性对照、7-地黄阴性对照。
图1为自拟展开系统：甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(15：5：3：1.8)的薄层图谱，A1为紫光灯下检视结果，B1为日光下检视结果；图2为展开系统Ⅰ：乙酸乙酯-甲醇-甲酸(16：0.5：2)的薄层图谱，A2为紫光灯下检视结果，B2为日光下检视结果；图3为展开系统Ⅱ：环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(4：1：1：0.1)的薄层图谱，A3为紫光灯下检视结果，B3为日光下检视结果；图4为展开系统Ⅲ：三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40:5:10:0.2)的薄层图谱，A4为紫光灯下检视结果，B4为日光下检视结果；图5为展开系统Ⅳ：正己烷-乙酸乙酯(3:1)的薄层图谱，A5为紫光灯下检视结果，B5为日光下检视结果。
结果显示：①展开系统Ⅰ条件下，图2的A2中川芎当归鉴别斑点RF值太大，斑点拖尾，无法分离；图2的B2中白芍斑点RF值适宜，阴性无干扰，可以鉴别，但斑点较图1的B1扩散，地黄斑点RF值太大，背景干扰大，无法分离。②展开系统Ⅱ条件下，图3的A3中川芎当归鉴别斑点分离好，阴性无干扰，可以鉴别；图3的B3中白芍斑点无法鉴别，地黄斑点清晰集中，阴性无干扰，可以鉴别，但RF值较小。该条件无法同时鉴别川芎、当归、白芍、地黄。③展开系统Ⅲ条件下，图4的A4中川芎当归鉴别斑点RF值太大，阴性有干扰；图4的B4中白芍斑点清晰集中，RF值适宜，阴性无干扰，可以鉴别，地黄斑点分离不好，无法鉴别，阴性有干扰。④展开系统Ⅳ条件下，图5的A5中川芎当归鉴别斑点分离较好，阴性无干扰，可以鉴别；图5的B5中白芍、地黄斑点均无法鉴别。综上所述，自拟展开系统对比展开系统Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，其对川芎、当归、白芍和地黄鉴别斑点分离好，清晰集中，RF值适宜，阴性无干扰。该薄层色谱系统一次展开，即可同时鉴别川芎、当归、白芍和地黄4味处方药味，能有效减少有机溶剂的使用量，提高检测效率，降低检验成本，绿色环保。
(2)红花薄层鉴别展开条件对比试验方法与结果
吸取上述供试品溶液、红花对照药材溶液及红花阴性对照溶液，分别点于硅胶G薄层板上，分别以自拟展开剂条件三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15：45：22：10)5～10℃放置12小时的下层溶液、展开系统Ⅴ、Ⅵ为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。结果如图6-8所示，T：19℃，RH：77％，S1、S2、S3-供试品溶液(THSWT-W-20210528-01、THSWT-W-20210528-03、THSWT-W-20210528-05)；1-红花阴性对照、2-红花对照药材。图6为自拟展开系统：三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15：45：22：10)5510℃放置12小时的下层溶液薄层图谱；图7为展开系统Ⅴ：乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7：2：3：0.4)薄层图谱；图8为展开系统Ⅵ：正丁醇-冰醋酸-水(6：2.4：5)薄层图谱。
结果显示：①展开系统Ⅴ条件下，图7中红花鉴别斑点RF值太大，分离不好。②展开系统Ⅵ条件下，图8中红花鉴别斑点RF值太大，斑点拖尾，无法分离，阴性有干扰。③综上所述，自拟展开系统对比展开系统Ⅴ、Ⅵ，供试品对应红花对照药材色谱三个绿色荧光斑点中上Rf值较大的2个斑点分离好，清晰集中，RF值适宜，阴性无干扰。该鉴别方法能快速科学，稳定灵敏的对桃红四物汤方剂中的红花药味进行鉴别。
实施例4
一种桃红四物汤颗粒的指纹图谱控制方法。
采用高效液相色谱法(《中国药典》四部通则0512)测定。
1、制备液相供试品溶液：取实施例1制备得到的桃红四物汤颗粒约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水10ml，振摇溶解，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2、制备对照品溶液：取没食子酸对照品、绿原酸对照品、羟基红花黄色素对照品、芍药苷对照品和阿魏酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含30μg、20μg、50μg、100μg和20μg的混合溶液，即得。
3、测定方法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定。其中绿原酸、羟基红花黄色素、阿魏酸的检测波长为320nm，芍药苷的检测波长为230nm。
(1)采用甲醇为流动相A，采用体积百分比浓度为0.05％的磷酸水溶液为流动相B，采用色谱柱：Agilent Venusil MP C18，柱温：30℃，液相色谱：Agilent 1200，检测波长：210、230、250、280、320nm。进行梯度洗脱，洗脱梯度如下表所示。
表1梯度洗脱表
结果显示：如图9中的a所示，0-15min峰较多，15-45min峰分离较好。
(2)采用甲醇为流动相A，采用体积百分比浓度为0.05％的磷酸水溶液为流动相B，采用色谱柱：Agilent Venusil MP C18，柱温：30℃，液相色谱：Agilent 1200，检测波长：210、230、250、280、320nm。进行梯度洗脱，洗脱梯度如下表所示。
表2梯度洗脱表
| 甲醇 | 0.05％磷酸 | |
| 0min | 5％ | 95％ |
| 60min | 30％ | 70％ |
| 90min | 90％ | 10％ |
| 92min | 5％ | 95％ |
| 100min | 5％ | 95％ |
结果显示：如图9中的b所示，0-15min的色谱峰分离度有改善，但峰信息量比较小。
(3)采用乙腈为流动相A，采用体积百分比浓度为0.05％的磷酸水溶液为流动相B，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(250mm×4.6mm，5μm)，柱温：30℃，液相色谱：Agilent1200，检测波长：230nm。进行梯度洗脱，洗脱梯度如下表所示。理论板数按芍药苷峰计算应不低于30000。
表3梯度洗脱表
| 乙腈 | 0.05％磷酸 | |
| 0min | 5％ | 95％ |
| 90min | 95％ | 5％ |
| 92min | 5％ | 95％ |
| 100min | 5％ | 95％ |
结果显示：如图10中的a所示，峰主要集中在0-30min。
(4)采用乙腈为流动相A，采用体积百分比浓度为0.05％的磷酸水溶液为流动相B，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(250mm×4.6mm，5μm)，柱温：30℃，液相色谱：Agilent1200，检测波长：230nm。进行梯度洗脱，洗脱梯度如下表所示。理论板数按芍药苷峰计算应不低于30000。
表4梯度洗脱表
| 乙腈 | 0.05％磷酸 | |
| 0min | 5％ | 95％ |
| 60min | 15％ | 85％ |
| 90min | 70％ | 30％ |
| 92min | 5％ | 95％ |
| 100min | 5％ | 95％ |
结果显示：如图10中的b所示，前10min峰集中，10-60min峰的峰高太低，65-75min峰又太集中。
(5)采用乙腈为流动相A，采用体积百分比浓度为0.05％的磷酸水溶液为流动相B，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(250mm×4.6mm，5μm)，柱温：30℃，液相色谱：Agilent1200，检测波长：230nm。进行梯度洗脱，洗脱梯度如下表所示。理论板数按芍药苷峰计算应不低于30000。
表5梯度洗脱表
| 乙腈 | 0.05％磷酸 | |
| 0min | 5％ | 95％ |
| 20min | 5％ | 95％ |
| 70min | 30％ | 70％ |
| 90min | 70％ | 30％ |
| 92min | 5％ | 95％ |
| 100min | 5％ | 95％ |
结果显示：如图11中的a所示，前十分钟峰分离度基本不变，峰集中于40-65min，峰高有改善。
(6)采用乙腈为流动相A，采用体积百分比浓度为0.05％的磷酸水溶液为流动相B，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(250mm×4.6mm，5μm)，柱温：30℃，液相色谱：Agilent1200，检测波长：230nm。进行梯度洗脱，洗脱梯度如下表所示。理论板数按芍药苷峰计算应不低于30000。
表6梯度洗脱表
结果显示：如图11中的b所示，色谱峰较平均。
(7)采用乙腈为流动相A，采用体积百分比浓度为0.05％的磷酸水溶液为流动相B，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(250mm×4.6mm，5μm)，柱温：30℃，液相色谱：Agilent1200，检测波长：230nm。进行梯度洗脱，洗脱梯度如下表所示。理论板数按芍药苷峰计算应不低于30000。
表7梯度洗脱表
| 乙腈 | 0.05％磷酸 | |
| 0min | 5％ | 95％ |
| 75min | 35％ | 65％ |
| 90min | 65％ | 35％ |
| 92min | 5％ | 95％ |
| 100min | 5％ | 95％ |
结果显示：如图12中a所示，50min后峰很少。
(8)采用乙腈为流动相A，采用体积百分比浓度为0.05％的磷酸水溶液为流动相B，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(250mm×4.6mm，5μm)，柱温：30℃，液相色谱：Agilent1200，检测波长：230nm。进行梯度洗脱，洗脱梯度如下表所示。理论板数按芍药苷峰计算应不低于30000。
表8梯度洗脱表
| 乙腈 | 0.05％磷酸 | |
| 0min | 5％ | 95％ |
| 50min | 25％ | 75％ |
| 70min | 65％ | 35％ |
| 72min | 5％ | 95％ |
| 80min | 5％ | 95％ |
结果显示：如图12中b所示，70min不能将色谱峰完全洗脱，尝试提高乙腈比例。
(9)采用乙腈为流动相A，采用体积百分比浓度为0.05％的磷酸水溶液为流动相B，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(250mm×4.6mm，5μm)，柱温：30℃，液相色谱：Agilent1200，检测波长：230nm。进行梯度洗脱，洗脱梯度如下表所示。理论板数按芍药苷峰计算应不低于30000。
表9梯度洗脱表
| 乙腈 | 0.05％磷酸 | |
| 0min | 5％ | 95％ |
| 50min | 25％ | 75％ |
| 70min | 75％ | 25％ |
| 72min | 5％ | 95％ |
| 80min | 5％ | 95％ |
结果显示：如图13中的a所示，70min洗脱完全。
(10)采用乙腈为流动相A，采用体积百分比浓度为0.05％的磷酸水溶液为流动相B，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(250mm×4.6mm，5μm)，柱温：30℃，液相色谱：Agilent 1200，检测波长：230nm。进行梯度洗脱，洗脱梯度如下表所示。理论板数按芍药苷峰计算应不低于30000。
表10梯度洗脱表
| 乙腈 | 0.05％磷酸 | |
| 0min | 5％ | 95％ |
| 60min | 30％ | 70％ |
| 80min | 70％ | 30％ |
| 82min | 5％ | 95％ |
| 90min | 5％ | 95％ |
结果显示：如图13中的b所示，峰分离度较之前(6)好，但峰数量略少。
(11)采用乙腈为流动相A，采用体积百分比浓度为0.05％的磷酸水溶液为流动相B，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(250mm×4.6mm，5μm)，柱温：30℃，液相色谱：Agilent 1200，检测波长：230nm。进行梯度洗脱，洗脱梯度如下表所示。理论板数按芍药苷峰计算应不低于30000。
表11梯度洗脱表
结果显示：如图14中的a所示，峰整体出峰时间提前，峰分离度变化不大。
(12)采用乙腈为流动相A，采用体积百分比浓度为0.05％的磷酸水溶液为流动相B，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(250mm×4.6mm，5μm)，柱温：30℃，液相色谱：Agilent 1200，检测波长：230nm。进行梯度洗脱，洗脱梯度如下表所示。理论板数按芍药苷峰计算应不低于30000。
表12梯度洗脱表
| 乙腈 | 0.05％磷酸 | |
| 0min | 5％ | 95％ |
| 75min | 30％ | 70％ |
| 100min | 80％ | 20％ |
| 105min | 5％ | 95％ |
| 110min | 5％ | 95％ |
结果显示：如图14中的b所示，前60min峰分布较好，后面时间可缩短。
(13)采用乙腈为流动相A，采用体积百分比浓度为0.05％的磷酸水溶液为流动相B，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(250mm×4.6mm，5μm)，柱温：30℃，液相色谱：Agilent 1200，检测波长：230nm。进行梯度洗脱，洗脱梯度如下表所示。理论板数按芍药苷峰计算应不低于30000。
表13梯度洗脱表
| 乙腈 | 0.05％磷酸 | |
| 0min | 5％ | 95％ |
| 60min | 25％ | 75％ |
| 90min | 85％ | 15％ |
| 92min | 5％ | 95％ |
| 100min | 5％ | 95％ |
结果显示：如图15所示，峰分布较好，暂定此方法为指纹图谱的方法。
计算公式：
其中，A样为样品峰面积；C对为对照浓度(μg/ml)；A对为对照峰面积。
本品按干燥品计算，每1g含绿原酸(C16H18O9)应为0.1750.70mg，含羟基红花黄色素(C27H32O16)应为0.2951.16mg，含芍药苷(C23H28O11)应为1.6256.50mg，含阿魏酸(C10H10O4)应为0.2150.87mg。
实施例5
采用不同提取条件制备桃红四物汤颗粒。
1、处方饮片加水煎煮二次，第一次提取，加12倍水，煎煮60分钟，第二次提取，加10倍水，煎煮40分钟，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.05～1.20(70℃)的清膏，加入适量麦芽糊精，搅匀，干燥，制成1000g颗粒，即得桃红四物汤颗粒。
采用实施例3中(13)的指纹图谱控制方法进行测定，结果如图16中的a THSWT-T-20210608-01所示。
2、处方饮片加水煎煮二次，第一次提取，加12倍水，60分钟，第二次提取，加10倍水，30分钟，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.05～1.20(70℃)的清膏，加入适量麦芽糊精，搅匀，干燥，制成1000g颗粒，即得桃红四物汤颗粒。
采用实施例3中(13)的指纹图谱控制方法进行测定，结果如图16中的b THSWT-T-20210608-02所示。
3、处方饮片加水煎煮二次，第一次提取，加12倍水，40分钟，第二次提取，加10倍水，30分钟，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.05～1.20(70℃)的清膏，加入适量麦芽糊精，搅匀，干燥，制成1000g颗粒，即得桃红四物汤颗粒。
采用实施例3中(13)的指纹图谱控制方法进行测定，结果如图17中的a THSWT-T-20210609-01所示。
4、处方饮片加水煎煮二次，第一次提取，加10倍水，40分钟，第二次提取，加8倍水，30分钟，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.05～1.20(70℃)的清膏，加入适量麦芽糊精，搅匀，干燥，制成1000g颗粒，即得桃红四物汤颗粒。
采用实施例3中(13)的指纹图谱控制方法进行测定，结果如图17中的b THSWT-T-20210609-02所示。
5、处方饮片加水煎煮二次，第一次提取，加8倍水，40分钟，第二次提取，加6倍水，30分钟，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.05～1.20(70℃)的清膏，加入适量麦芽糊精，搅匀，干燥，制成1000g颗粒，即得桃红四物汤颗粒。
采用实施例3中(13)的指纹图谱控制方法进行测定，结果如图18中的a THSWT-T-20210609-03所示。
6、处方饮片加水煎煮一次，加10倍水，60分钟，取煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.05～1.20(70℃)的清膏，加入适量麦芽糊精，搅匀，干燥，制成1000g颗粒，即得桃红四物汤颗粒。
采用实施例3中(13)的指纹图谱控制方法进行测定，结果如图18中的b THSWT-T-20210610-01所示。
7、处方饮片加水煎煮二次，第一次提取，加8倍水，30分钟，第二次提取，加6倍水，20分钟，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.05～1.20(70℃)的清膏，加入适量麦芽糊精，搅匀，干燥，制成1000g颗粒，即得桃红四物汤颗粒。
采用实施例3中(13)的指纹图谱控制方法进行测定，结果如图19中的a THSWT-T-20210610-02所示。
8、处方饮片加水煎煮一次，加10倍水，60分钟，取煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.05～1.20(70℃)的清膏，加入适量麦芽糊精，搅匀，干燥，制成1000g颗粒，即得桃红四物汤颗粒。
采用实施例3中(13)的指纹图谱控制方法进行测定，结果如图19中的b THSWT-T-20210611-01所示。
9、处方饮片加水煎煮一次，加12倍水，60分钟，取煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.05～1.20(70℃)的清膏，加入适量麦芽糊精，搅匀，干燥，制成1000g颗粒，即得桃红四物汤颗粒。
采用实施例3中(13)的指纹图谱控制方法进行测定，结果如图20中的a THSWT-T-20210611-02所示。
10、处方饮片加水煎煮一次，加10倍水，90分钟，取煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.05～1.20(70℃)的清膏，加入适量麦芽糊精，搅匀，干燥，制成1000g颗粒，即得桃红四物汤颗粒。
采用实施例3中(13)的指纹图谱控制方法进行测定，结果如图20中的b THSWT-T-20210615-01所示。
11、处方饮片加水煎煮一次，加20倍水，90分钟，取煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.05～1.20(70℃)的清膏，加入适量麦芽糊精，搅匀，干燥，制成1000g颗粒，即得桃红四物汤颗粒。
采用实施例3中(13)的指纹图谱控制方法进行测定，结果如图21THSWT-T-20210902-01所示。
结果分析：对实施例4中的指纹图谱进行分析比较，图16的a、b对比结果如图22所示，图16的b在74min处少1个峰；图17的a、b和图18的a对比结果如图23所示，三者峰一致；图18的b和图19的a对比结果如图24所示，两者峰一致；图19的b和图20的a对比结果如图25所示，两者峰一致；图20的b和图21对比结果如图26所示，两者峰一致；图16的a、图17的a和图18的b对比结果如图27所示，三者峰一致；图16的a、图19的b、图20的b对比结果如图28所示，图19的b、图20的b的25-30min处峰较多，分离效果不好。因此，不同小试工艺色谱峰基本一致，图16的b的74min较其他条件少一个峰；图19的b、图20的a、图20的b、图21的25-30min之间峰较多。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (7)
1.一种桃红四物汤方剂的检测方法，其特征在于，该检测方法包括：薄层色谱鉴别方法和指纹图谱检测方法，所述鉴别方法包括以下步骤：
制备薄层供试品溶液：称取待测桃红四物汤方剂，加水溶解，有机溶剂萃取，得到有机溶剂萃取液，蒸干，得到残渣，加有机溶剂溶解，得到薄层供试品溶液；
制备第一对照药材溶液：称取第一对照药材，加水，回流提取，滤过，得到滤液，有机溶剂萃取，得到有机溶液萃取液，蒸干，得到残渣，加有机溶剂溶解，得到第一对照药材溶液；所述第一对照药材包括以下对照药材：川芎、当归、白芍和地黄；
第一薄层色谱分析：吸取所述薄层供试品溶液、所述第一对照药材溶液，分别点于同一薄层板，以第一展开剂展开，取出，晾干，进行第一检视；所述第一展开剂中，甲苯、乙酸乙酯、甲醇和甲酸的体积比为13-17：4-6：2-4：1-2；
制备第二对照药材溶液：称取第二对照药材，加水，回流提取，滤过，得到滤液，有机溶剂萃取，得到有机溶剂萃取液，蒸干，得到残渣，加有机溶剂溶解，得到第二对照药材溶液；所述第二对照药材包括红花；
第二薄层色谱分析：吸取所述薄层供试品溶液、所述第二对照药材溶液，分别点于同一薄层板，以第二展开剂展开，取出，晾干，进行第二检视；所述第二展开剂中，三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为13-17：35-45：20-24：8-12；
所述指纹图谱检测方法包括以下步骤：
制备液相供试品溶液：精密称取待测桃红四物汤方剂，加水溶解，混合均匀，滤过，取滤液，得到液相供试品溶液；
制备对照品溶液：精密称取对照品，加甲醇溶解，得到所述对照品溶液；
高效液相色谱检测：分别精密吸取所述对照品溶液与所述液相供试品溶液，注入高效液相色谱仪以预定液相条件测定；所述预定液相条件包括：固定相：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相：以乙腈为流动相A，体积百分比浓度为0.05％的磷酸水溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述第一薄层色谱分析步骤中，所述第一检视包括以下步骤：采用紫外光对薄层板进行检视，对川芎和当归进行检测；喷涂香草醛硫酸溶液，加热，在日光下检视薄层板，对白芍和地黄进行检测。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述第二薄层色谱分析步骤中，所述第二检视包括以下步骤：对薄层板喷涂硫酸乙醇溶液，加热，采用紫外光进行检视，对红花进行检测。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述对照品包括以下原料中的至少1种：没食子酸、绿原酸、羟基红花黄色素、芍药苷或阿魏酸。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的条件为：
0min-60min，流动相A的体积百分数由5％变化至25％；
60min-90min，流动相A的体积百分数由25％变化至85％。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述预定液相条件还包括：
所述色谱柱为Agilent Venusil MP C18色谱柱；
柱温：25-35℃。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述桃红四物汤方剂的剂型为颗粒剂，所述颗粒剂的辅料包括：麦芽糊精。
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