CN115508495B - 一种桃红四物汤中燀桃仁的鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种桃红四物汤中燀桃仁的鉴别方法，包括：（1）将桃红四物汤样品与干燥剂混合磨细，磨细物与KIT‑6分子筛再次研磨混匀，并装填到底部装有D101型大孔吸附树脂的固相萃取柱管内，加入乙醚与甲醇的混合溶剂作为洗脱液，收集流出液，离心，得到上清液，将上清液经0.22μm滤膜过滤后得到供试品溶液；（2）制备对照样品溶液；（3）将供试品溶液和对照样品溶液点样于同一硅胶G薄层板上，以乙酸丁酯‑石油醚为展开剂展开，取出晾干，喷以香草醛硫酸乙醇溶液加热显色，检视。本发明将固相萃取方法与薄层色谱检测分析法相结合，实现了桃红四物汤中燀桃仁的准确快速鉴别，且该方法显色斑点清晰度高、阴性无干扰。
Description
技术领域
本发明属于中药分析技术领域，具体涉及一种桃红四物汤中燀桃仁的鉴别方法。
背景技术
桃红四物汤出自清代吴谦所著《医宗金鉴·妇科心法要诀·调经门》，由基本方四物汤(当归、川芎、熟地黄、白芍)加桃仁、红花制成，具体包括熟地黄15克、当归15克、白芍10克、川芎8克、桃仁9克和红花6克，桃红四物汤活血祛瘀、养血调经的功效广为人知，现如今其临床用已极其广泛，除妇科之外，在内、外、儿、眼、耳鼻喉科均有大量应用。近年来研究表明，桃红四物汤具有抗炎、降血脂、改善微循环、促进血管生成、提高机体非特异性免疫功能、促进骨折愈合、治疗股骨头缺血坏死、延缓肝脏纤维化进程等功效。
山桃仁，别名桃核仁，其味苦、甘，性平，归心、肝、大肠经。桃仁含有多种营养成分和生物活性物质，是临床疗效显著的天然药物。其水煎剂及提取物还有一定的抗菌镇痛、抗过敏、抗肿瘤等作用。桃仁通过沸水炮制成为燀桃仁，燀桃仁在燀后易去皮，除去非药用部位，有效物质易于煎出，药效提高。其具有活血祛瘀、润肠通便等功效；现代药理研究表明，具有抗氧化、抗衰老、调节免疫、抗肿瘤、降血糖等作用。
目前关于桃仁的鉴别方法，公开号为CN109406707A的中国专利文献公开了一种炒桃仁及其制剂的薄层色谱鉴别方法，包括如下步骤：取桃仁对照药材粉末和待测供试品粉末，加氢氧化钠溶液提取，再利用氯仿萃取得到萃取液，蒸干，加甲醇溶解分别得到对照药材和供试品溶液；再利用环已烷-乙酸乙酯为展开剂，10％硫酸乙醇溶液作为显色剂进行薄层色谱检测，该方法主要用于单一组分的炒桃仁及其制剂的鉴别。
公开号为CN107478749A的中国专利文献公开了一种桃红四物汤的药物制剂的检测方法，具体桃仁的鉴别方法为：将桃红四物汤经提取、过柱等前处理操作制备得到供试品溶液，以桃仁对照药材和苦杏仁苷为对照品制备对照溶液；再利用体积比为15:40:22:10的三氯甲烷乙酸乙酯-甲醇-水为展开剂，茴香醛试液作为显色剂进行薄层色谱检测；该发明中，供试品溶液制备过程复杂，且展开剂组分较为复杂。
公开号为CN114942297A的中国专利文献公开了用于桃红四物汤薄层鉴别方法的展开剂及薄层鉴别方法，所述展开剂由乙酸乙酯、甲醇和水组成，所述乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为20:(4～6):(2～4)，该发明利用桃红四物汤制备醚层供试品溶液和水层供试品溶液，和对照药材溶液以及对照品溶液点样于同一块硅胶G板上，利用所述展开剂展开，晾干，置紫外灯下检视；该发明虽能分别制备醚层供试品溶液和水层供试品溶液在一块硅胶G板上鉴别六个药味，但过程繁琐，且准确度有待考察。
基于上述现有技术存在的缺陷，开发一种操作简单、易于显色、准确度高、专属性强的桃红四物汤中燀桃仁的鉴别方法至关重要。
发明内容
本发明提供了一种桃红四物汤中燀桃仁的鉴别方法，采用特定的固相萃取前处理方法来提取目标组分，提取速度快，将固相萃取方法与薄层色谱检测分析法相结合，实现了桃红四物汤中燀桃仁的准确快速鉴别。
具体采用的技术方案如下：
一种桃红四物汤中燀桃仁的鉴别方法，包括以下步骤：
(1)将桃红四物汤样品与干燥剂混合磨细，磨细物与KIT-6分子筛再次研磨混匀，并装填到底部装有D101型大孔吸附树脂的固相萃取柱管内，加入乙醚与甲醇的混合溶剂作为洗脱液，收集流出液，离心，得到上清液，将上清液经滤膜过滤后得到供试品溶液；
(2)制备对照样品溶液，对照样品溶液包含阴性样品溶液和阳性样品溶液，其中，阴性样品溶液为缺燀桃仁样品溶液，阳性样品溶液为桃仁对照药材溶液；
缺燀桃仁样品溶液的制备方法与供试品溶液的制备方法相同，具体步骤为：取缺燀桃仁阴性样品与干燥剂混合磨细，磨细物与KIT-6分子筛再次研磨混匀，并装填到底部装有D101型大孔吸附树脂的固相萃取柱管内，加入乙醚与甲醇的混合溶剂作为洗脱液，收集流出液，离心，得到上清液，将上清液经滤膜过滤后得到缺燀桃仁样品溶液；
桃仁对照药材溶液的制备方法具体包括以下步骤：取桃仁对照药材，加水煎煮，滤过，蒸干，残渣与干燥剂混合磨细，磨细物与KIT-6分子筛再次研磨混匀，并装填到底部装有D101型大孔吸附树脂的固相萃取柱管内固相萃取柱管内，加入乙醚与甲醇的混合溶剂作为洗脱液，收集流出液，离心，得到上清液，将上清液经滤膜过滤后得到桃仁对照药材溶液；
(3)将供试品溶液和对照样品溶液点样于同一硅胶G薄层板上，以乙酸丁酯-石油醚为展开剂展开，展开后取出晾干，喷以香草醛硫酸乙醇溶液加热显色，检视。
供试品溶液和对照样品溶液制备的过程中，利用KIT-6分子筛作为固相萃取的吸附剂与样品中的目标物质吸附结合，使目标物质在样品基质中分离，得到含有目标物质的洗脱液，从而进一步通过薄层色谱分析法结合特定的展开剂以及显色剂来实现目标成分的准确鉴别。
优选的，干燥剂选用无水硫酸钠；桃红四物汤样品(或缺燀桃仁阴性样品、或桃仁对照药材制得的残渣)、干燥剂和KIT-6分子筛的质量比为1：1-3：2-4；若吸附剂用量较少会导致吸附不完全。
为了减小待测样品或对照样品的水分含量和粒度，桃红四物汤样品(或缺燀桃仁阴性样品、或桃仁对照药材制得的残渣)与干燥剂研磨时间优选为4-6min。
磨细物与KIT-6分子筛的研磨时间与KIT-6分子筛的吸附平衡息息相关，优选的，磨细物与KIT-6分子筛的研磨时间为2-3min。
根据样品量来选择不同体积规格的固相萃取柱，本发明中使用的固相萃取柱为自制固相萃取柱，在固相萃取柱底部放置筛板，添加D101型大孔吸附树脂，再添加含有样品的混合磨细物，含有样品的混合磨细物与D101型大孔吸附树脂的质量比为0.3-1.5：1；用另一块筛板压实，利用乙醚与甲醇的混合溶剂洗脱。
优选的，当乙醚与甲醇以体积比3-5：1混合作为洗脱液时，洗脱效率高，可较好的溶解目标分析物，同时把基质杂质留在填料中。
优选的，步骤(1)中，离心条件为10000-15000rpm离心3-5min，滤膜为0.22μm微孔滤膜。
优选的，所述的展开剂选用体积比为1：15～20的乙酸丁酯-石油醚。
优选的，所述的香草醛硫酸乙醇溶液的质量体积比为4-7％，加热显色的条件为温度105～110℃，时间3～5min。
本发明前处理方法制得的供试品溶液和对照样品溶液在上述体积比为1：15～20的乙酸丁酯-石油醚的特定展开剂作用下，并在香草醛硫酸乙醇溶液的作用下显色，能够实现桃红四物汤中燀桃仁的准确鉴别。
优选的，供试品溶液和对照样品溶液的点样量为2～6μL。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明前处理步骤集吸附与洗脱净化分离于一体，利用KIT-6分子筛作为固相萃取的吸附剂与样品中的目标物质吸附结合，并采用体积比为3-5：1的乙醚与甲醇的混合溶剂作为洗脱液，提取速度快，在15min以内，干扰物质少，提取效果好；
(2)本发明将固相萃取前处理方法和薄层色谱检测法相结合，利用特定前处理方法制得的供试品溶液和对照样品溶液，在乙酸丁酯-石油醚展开剂以及香草醛硫酸乙醇溶液显色剂的作用下，实现了桃红四物汤中燀桃仁的准确鉴别，且该方法检测速度快、显色斑点清晰度高、准确度高、专属性强、阴性无干扰。
附图说明
图1为实施例1的薄层色谱鉴别效果图。
图2为对比例1的薄层色谱鉴别效果图。
图3为对比例3的薄层色谱鉴别效果图。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
实施例以及对比例中应用到的桃红四物汤样品、缺燀桃仁阴性样品以及桃仁(山桃)对照药材均来自于海南葫芦娃药业集团股份有限公司；固相萃取柱为自制固相萃取柱，在固相萃取柱底部放置筛板，添加D101型大孔吸附树脂，再添加含有样品的混合磨细物(保持含有样品的混合磨细物与填料的质量比为0.3-1.5：1)，最后用另一块筛板压实，利用乙醚与甲醇的混合溶剂洗脱。
实施例1
(1)将20mg桃红四物汤样品与20mg干燥剂无水硫酸钠混合研磨5min磨细，磨细物与40mg KIT-6分子筛再次研磨2min混匀，并装填到底部装有D101型大孔吸附树脂的固相萃取柱管内，加入乙醚与甲醇的混合溶剂(乙醚与甲醇的体积比为3：1)作为洗脱液，收集流出液，12000rpm下离心3min，得到上清液，将上清液经0.22μm滤膜过滤后得到供试品溶液；
(2)缺燀桃仁样品溶液的制备方法与供试品溶液的制备方法相同，具体步骤为：取20mg缺燀桃仁阴性样品与20mg干燥剂无水硫酸钠混合研磨5min磨细，磨细物与40mg KIT-6分子筛再次研磨2min混匀，并装填到底部装有D101型大孔吸附树脂的固相萃取柱管内固相萃取柱管内，加入乙醚与甲醇的混合溶剂(乙醚与甲醇的体积比为3：1)作为洗脱液，收集流出液，12000rpm下离心3min，得到上清液，将上清液经0.22μm滤膜过滤后得到缺燀桃仁样品溶液；
(3)桃仁对照药材溶液的制备方法具体包括以下步骤：取1g桃仁对照药材，加水50mL煎煮，滤过，蒸干，取残渣10mg与10mg干燥剂混合研磨5min磨细，磨细物与20mg KIT-6分子筛再次研磨2min混匀，并装填到底部装有D101型大孔吸附树脂的固相萃取柱管内，加入乙醚与甲醇的混合溶剂(乙醚与甲醇的体积比为3：1)作为洗脱液，收集流出液，12000rpm下离心3min，得到上清液，将上清液经0.22μm滤膜过滤后得到桃仁对照药材溶液；
(4)分别取2μL上述步骤制得的供试品溶液、缺燀桃仁样品溶液和桃仁对照药材溶液，分别点样于同一硅胶G薄层板上，以体积比为1：15的乙酸丁酯-石油醚为展开剂，展开后取出晾干，喷以4％香草醛硫酸乙醇溶液，在105℃加热5min显色，检视。
本实施例的薄层色谱检测结果如图1所示，图1中的色谱条带从左至右分别为缺燀桃仁样品溶液、供试品溶液和桃仁对照药材溶液，由图中结果可知，缺燀桃仁样品溶液在阳性样品对应位置处无斑点，而待测桃红四物汤样品在阳性样品的对应位置处出现斑点，且色谱图中，无明显拖尾，阴性无干扰。
实施例2
本实施例中，供试品溶液、缺燀桃仁样品溶液和桃仁对照药材溶液的配制方法与实施例1中的配制方法区别仅在于，调整桃红四物汤样品(或缺燀桃仁阴性样品或桃仁对照药材制得的残渣)、干燥剂和KIT-6分子筛的质量比为1：2：4；桃红四物汤样品(或缺燀桃仁阴性样品、或桃仁对照药材制得的残渣)与干燥剂研磨时间为4min；磨细物与KIT-6分子筛的研磨时间为3min；洗脱液中乙醚与甲醇的体积比为5：1；离心条件为10000rpm下离心4min。
分别取4μL上述步骤制得的供试品溶液、缺燀桃仁样品溶液和桃仁对照药材溶液，分别点样于同一硅胶G薄层板上，以体积比为1：18的乙酸丁酯-石油醚为展开剂，展开后取出晾干，喷以5％香草醛硫酸乙醇溶液，在110℃加热3min显色，检视。
实施例3
本实施例中，供试品溶液、缺燀桃仁样品溶液和桃仁对照药材溶液的配制方法与实施例1中的配制方法区别仅在于，调整桃红四物汤样品(或缺燀桃仁阴性样品或桃仁对照药材制得的残渣)、干燥剂和KIT-6分子筛的质量比为1：3：2；桃红四物汤样品(或缺燀桃仁阴性样品、或桃仁对照药材制得的残渣)与干燥剂研磨时间为6min；磨细物与KIT-6分子筛的研磨时间为2.5min；洗脱液中乙醚与甲醇的体积比为4：1；离心条件为15000rpm下离心3min。
分别取6μL上述步骤制得的供试品溶液、缺燀桃仁样品溶液和桃仁对照药材溶液，分别点样于同一硅胶G薄层板上，以体积比为1：20的乙酸丁酯-石油醚为展开剂，展开后取出晾干，喷以7％香草醛硫酸乙醇溶液，在105℃加热5min显色，检视。
对比例1
对比例1中，供试品溶液、缺燀桃仁样品溶液和桃仁对照药材溶液的配制方法与实施例1中的配制方法区别仅在于，展开剂选用体积比为1：13的乙酸丁酯-石油醚，显色剂选用质量体积比为2％的香草醛硫酸乙醇溶液。
本对比例的薄层色谱检测结果如图2所示，图2中的色谱条带从左至右分别为桃仁对照药材溶液、供试品溶液(分别重复测试两次)和缺燀桃仁样品溶液，由图中结果可知，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，斑点不清晰，条带偏重(可能是拖尾导致)，同时阴性无干扰，上述方法不能实现桃红四物汤中燀桃仁的鉴别。
对比例2
对比例2中，薄层色谱分析方法与实施例1相同，区别仅在于前处理制备供试品溶液、缺燀桃仁样品溶液和桃仁对照药材溶液的方法不同：
(1)取3g桃红四物汤样品，加乙酸乙酯50mL，密塞，超声处理30min，取出，滤过滤液蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解得到供试品溶液；
(2)取3g缺燀桃仁阴性样品，加乙酸乙酯50mL，密塞，超声处理30min，取出，滤过滤液蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解得到缺燀桃仁样品溶液；
(3)桃仁对照药材溶液：取1.5g桃仁对照药材，加50mL水煎煮，滤过，蒸干，残渣加乙酸乙酯50mL，密塞，超声处理30min，取出，滤过滤液蒸干，残渣加甲醇2mL溶解后得到桃仁对照药材溶液。
该前处理方法中，有机溶剂使用量较大，且处理时间较长；另外，该前处理方法得到的提取液中含有很多的干扰物质，导致薄层色谱结果较差，不能实现桃红四物汤中燀桃仁的鉴别。
对比例3
对比例3中，供试品溶液、缺燀桃仁样品溶液和桃仁对照药材溶液的配制方法与实施例1中的配制方法区别仅在于，展开剂选用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15：40：22：10)5～10℃放置12小时的下层溶液，显色剂选用磷钼酸硫酸溶液(磷钼酸2g，加水20mL使溶解，再缓缓加人硫酸30mL，混匀)。
本对比例的薄层色谱检测结果如图3所示，图3中的色谱条带从左至右分别为桃仁对照药材溶液、供试品溶液和缺燀桃仁样品溶液，由图中结果可知，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的斑点，但阴性干扰严重，上述方法不能实现桃红四物汤中燀桃仁的鉴别。
样品分析
实施例1-3及对比例1-3的检视结果如表1所示：
表1实施例1-3及对比例1-3的检视结果
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述的仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种桃红四物汤中燀桃仁的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将桃红四物汤样品与干燥剂混合磨细，磨细物与KIT-6分子筛再次研磨混匀，并装填到底部装有D101型大孔吸附树脂的固相萃取柱管内，加入乙醚与甲醇的混合溶剂作为洗脱液，收集流出液，离心，得到上清液，将上清液经滤膜过滤后得到供试品溶液；
（2）制备对照样品溶液，对照样品溶液包含阴性样品溶液和阳性样品溶液，其中，阴性样品溶液为缺燀桃仁样品溶液，阳性样品溶液为桃仁对照药材溶液；
（3）将供试品溶液和对照样品溶液点样于同一硅胶G薄层板上，以乙酸丁酯-石油醚为展开剂展开，展开后取出晾干，喷以香草醛硫酸乙醇溶液加热显色，检视；
洗脱液中，乙醚与甲醇的体积比为3-5：1；
所述的展开剂选用体积比为1：15~20的乙酸丁酯-石油醚。
2.根据权利要求1所述的桃红四物汤中燀桃仁的鉴别方法，其特征在于，桃红四物汤样品、干燥剂和KIT-6分子筛的质量比为1：1-3：2-4。
3. 根据权利要求1所述的桃红四物汤中燀桃仁的鉴别方法，其特征在于，磨细物与KIT-6分子筛的研磨时间为2-3 min。
4. 根据权利要求1所述的桃红四物汤中燀桃仁的鉴别方法，其特征在于，步骤（1）中，离心条件为10000-15000 rpm离心3-5 min，滤膜为0.22μm微孔滤膜。
5.根据权利要求1所述的桃红四物汤中燀桃仁的鉴别方法，其特征在于，所述的香草醛硫酸乙醇溶液的质量体积比为4-7％。
6. 根据权利要求1所述的桃红四物汤中燀桃仁的鉴别方法，其特征在于，步骤（3）中，加热显色的条件为温度105~110 ℃，时间3~5 min。
7. 根据权利要求1所述的桃红四物汤中燀桃仁的鉴别方法，其特征在于，供试品溶液和对照样品溶液的点样量为2~6 μL。
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