CN113484429A - 桃核承气汤物质基准的建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种桃核承气汤物质基准的建立方法，其包括：采用薄层色谱法对桃仁、大黄、肉桂、甘草进行鉴别，采用理化鉴别法对芒硝进行鉴别；构建特征图谱对桃核承气汤中的成分进行鉴别；采用高效液相色谱法对桃核承气汤中的D‑苦杏仁苷含量、总蒽醌含量、游离蒽醌含量、肉桂酸含量、桂皮醛含量、甘草酸含量进行测定，并计算结合蒽醌含量；其中，结合蒽醌含量＝总蒽醌含量‑游离蒽醌含量。本发明中的方法可为桃核承气汤质量控制提供数据基础，有效保证桃核承气汤产品质量的稳定性和可控性。

Description

桃核承气汤物质基准的建立方法

技术领域

本发明涉及中药质量分析检测技术领域，尤其涉及一种桃核承气汤物质基准的建立方法。

背景技术

桃核承气汤出自汉代张仲景的《伤寒论》：“太阳病不解，热结膀胱，其人如狂，血自下，下者愈。其外不解者，尚未可攻，当先解其外；外解已，但少腹急结者，乃可攻之，宜桃核承气汤。桃仁五十个(去皮尖)，大黄四两，桂枝二两(去皮)，甘草二两(炙)，芒硝二两。上五味，以水七升，煮取二升半，去滓，内芒硝，更上火，微沸下火，先食温服五合，日三服。”桃核承气汤在临床上的应用十分广泛，不仅局限于太阳蓄血证的少腹胀满疼痛，大便色黑，小便自利，谵语发狂等症状，也广泛运用于脑外伤后遗症，妇科的痛经、闭经，以及肾系病证的癃闭，前列腺炎或者前列腺增生导致的癃闭等。桃核承气汤目前在国内尚未开发成为中成药，但在日本已被开发为汉方制剂供临床广泛使用，作为汉方药在药店销售排名前列，该方在我国具有很强的开发价值。

目前，对桃核承气汤的研究主要集中在药理学的研究方面，对其汤剂的物质基础、提取工艺、多指标成分含量测定及指纹图谱研究较少，缺少系统性。且对于如何衡量大生产制剂与传统汤剂质量的一致性也研究较少。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种桃核承气汤物质基准的建立方法，该方法可为桃核承气汤大生产质量控制提供数据基础，保证桃核承气汤产品质量的稳定性和可控性。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种桃核承气汤物质基准的建立方法，所述桃核承气汤由以下组分组成：桃仁、大黄、肉桂、甘草和芒硝；所述建立方法包括：

(1)采用薄层色谱法对桃仁、大黄、肉桂、甘草进行鉴别，采用理化鉴别法对芒硝进行鉴别；

(2)构建特征图谱对桃核承气汤中的成分进行鉴别；

(3)采用高效液相色谱法对桃核承气汤中的D-苦杏仁苷含量、总蒽醌含量、游离蒽醌含量、肉桂酸含量、桂皮醛含量、甘草酸含量进行测定，并计算结合蒽醌含量；其中，结合蒽醌含量＝总蒽醌含量-游离蒽醌含量。

作为上述技术方案的改进，所述桃仁的薄层色谱鉴别方法为：

(1)取桃核承气汤制剂，加乙醚提取后，用三氯甲烷溶解，即得桃仁薄层供试品溶液；

(2)取桃仁对照药材，加乙醚提取后，用三氯甲烷溶解，即得桃仁薄层对照药材溶液；

(3)分别吸取桃仁薄层供试品溶液、桃仁薄层对照药材溶液，点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚和乙酸乙酯的混合溶液为展开剂，展开后喷以硫酸乙醇溶液，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

作为上述技术方案的改进，所述桃仁的薄层色谱鉴别方法为：

(1)取桃核承气汤制剂0.2～1g，加30～50mL乙醚，加热回流提取1～2h，滤过，滤液挥干，残渣加三氯甲烷0.5～2mL溶解，即得桃仁薄层供试品溶液；

(2)取桃仁对照药材1～2g，加水100～200mL，加热煮沸30～60分钟，滤过，滤液浓缩至15～30mL，用乙醚振摇提取1～3次，每次15～30mL，合并乙醚液，挥干，残渣加三氯甲烷0.5～2mL使溶解，即得桃仁薄层对照药材溶液；

(3)分别吸取桃仁薄层供试品溶液、桃仁薄层对照药材溶液各5～10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为8.5：1的石油醚、乙酸乙酯混合溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在100～110℃加热至斑点显色清晰，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

作为上述技术方案的改进，所述大黄的薄层色谱鉴别方法为：

(1)取桃核承气汤制剂0.1～0.5g，加甲醇10～50mL，超声处理30～60分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10～50mL使溶解，再加盐酸1～5mL，加热回流30～60分钟，立即冷却，用乙醚振摇提取1～3次，每次10～50mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲烷1～5mL使溶解，作为大黄薄层供试品溶液；

(2)取大黄对照药材0.1～0.5g，加水100～500mL，加热煮沸30～60分钟，滤过，滤液浓缩至约10～15mL，再加盐酸1～5mL，加热回流30～60分钟，立即冷却，用乙醚振摇提取1～3次，每次10～50mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲烷1～5mL使溶解，即得大黄薄层对照药材溶液；再取大黄素、大黄酚、大黄酸、芦荟大黄素、大黄素甲醚对照品，加甲醇制成每1mL各含0.1mg的混合溶液，作为大黄薄层对照品溶液；

(3)分别吸取上述大黄薄层供试品溶液、大黄薄层对照药材溶液、大黄薄层对照品溶液各5～10μL，分别点于同一硅胶H薄层板上，以体积比为15:5:1的石油醚、甲酸乙酯和甲酸的混合溶液的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；置氨蒸气中熏后，斑点变为红色。

作为上述技术方案的改进，所述肉桂的薄层色谱鉴别方法为：

(1)取桃核承气汤制剂，加甲醇提取后残渣加水溶解，再用乙酸乙酯提取，提取后残渣加甲醇溶解，即得肉桂薄层供试品溶液；

(2)取肉桂对照药材，加乙酸乙酯提取后用甲醇溶解，即得肉桂薄层对照药材溶液；再取肉桂酸对照品，加甲醇溶解，制成肉桂薄层对照品溶液；

(3)分别吸取肉桂薄层供试品溶液、肉桂薄层对照药材溶液和肉桂薄层对照品溶液，点于同一硅胶GF₂₅₄板上，以石油醚、正己烷、甲酸乙酯和甲酸的混合溶液为展开剂，展开；供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

作为上述技术方案的改进，所述肉桂的薄层色谱鉴别方法为：

(1)取桃核承气汤制剂0.5～1g，研细，加甲醇30～60mL，超声处理30～60分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20～50mL使溶解，用乙酸乙酯振摇提取1～3次，每次20～40mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇2～5mL使溶解，即得肉桂薄层供试品溶液；

(2)取肉桂对照药材0.5～2g，加水50～200mL，微沸30～60分钟，滤过，滤液浓缩至约10～25mL，用乙酸乙酯振摇提取1～3次，每次20～40mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1～5mL使溶解，即得肉桂薄层对照药材溶液；再取肉桂酸对照品，加甲醇制成每1mL各含0.3～1mg的溶液，即得肉桂薄层对照品溶液；

(3)分别吸取肉桂薄层供试品溶液、肉桂薄层对照药材溶液、肉桂薄层对照品溶液各1～10μL，分别点于同一硅胶GF₂₅₄板上，以体积比为10:30:15:1的石油醚、正己烷、甲酸乙酯和甲酸的混合溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

作为上述技术方案的改进，所述甘草的薄层色谱鉴别方法为：

(1)取桃核承气汤制剂0.2～0.5g，研细，加甲醇20～50mL，超声处理30～60分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水15～30mL使溶解，用正丁醇振摇提取1～3次，每次20～50mL，合并正丁醇液，用水洗1～3次，每次20～50mL，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1～3mL使溶解，即得甘草薄层供试品溶液；

(2)取甘草对照药材0.3～0.5g，加水50～100mL，加热煮沸30～60分钟，滤过，滤液用正丁醇振摇提取1～3次，每次20～50mL，合并正丁醇液，用水洗1～3次，每次20～50mL，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1～3mL使溶解，即得甘草薄层对照药材溶液；再取甘草苷、芹糖甘草苷对照品，加甲醇制成每1mL各含0.2～1mg的混合溶液，即得甘草薄层对照品溶液；

(3)分别吸取甘草薄层供试品溶液、甘草薄层对照药材溶液、甘草薄层对照品溶液各1～5μL，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以体积比为15:1:1:2的乙酸乙酯、甲酸、冰乙酸和水的混合溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在100～110℃加热至斑点显色清晰，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

作为上述技术方案的改进，所述芒硝的理化鉴别法为：

取桃核承气汤制剂0.1～0.5g，研细，置坩埚中，缓缓炽热至完全炭化后，置500～600℃炽灼2～2.5小时，放冷，残渣加水5mL，搅拌，滤过，取滤液2mL，加稀醋酸至溶液呈中性后，加95％乙醇4滴，加醋酸氧铀锌试液1mL，搅拌1～3分钟，静置，产生黄色沉淀；另取滤液2mL，加氯化钡试液1滴，即生成白色沉淀，沉淀在盐酸和硝酸中均不溶解。

作为上述技术方案的改进，所述桃核承气汤特征图谱的构建方法为：

(1)分别取没食子酸对照品、儿茶素对照品、苦杏仁苷对照品、表儿茶素没食子酸酯对照品、甘草苷对照品、芹糖甘草苷对照品、桂皮醛对照品、肉桂酸对照品、大黄酚-1-O-葡萄糖苷对照品、大黄酚-8-O-葡萄糖苷对照品、大黄素-8-O-葡萄糖苷对照品、大黄酸对照品、甘草酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品适量，加入溶剂溶解或提取，制得特征图谱对照品溶液；

(2)取桃核承气汤制剂，加提取溶剂提取，制得特征图谱供试品溶液；

(3)取预设量的特征图谱对照品溶液和特征图谱供试品溶液，注入液相色谱仪，所述液相色谱仪以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，构建桃核承气汤的特征图谱。

作为上述技术方案的改进，所述梯度洗脱按下述程序进行：

0～5min，流动相A从1％→8％，流动相B从99％→92％；

5～21min，流动相A从8％→23％，流动相B从92％→77％；

21～35min，流动相A从23％→31％，流动相B从77％→69％；

35～45min，流动相A从31％→55％，流动相B从69％→45％；

45～51min，流动相A从55％→65％，流动相B从45％→35％；

51～56min，流动相A从65％→83％，流动相B从35％→17％；

56～65min，流动相A从83％→100％，流动相B从17％→0％。

作为上述技术方案的改进，步骤(3)中，分别吸取特征图谱对照品溶液和特征图谱供试品溶液各1～3μL，注入液相色谱仪进行检测，其中，所述液相色谱仪以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm，柱温为30～38℃；所述液相色谱仪以甲醇为流动相A，以0.15％～0.25％的磷酸水溶液为流动相B，流速为0.25～0.36mL/min，检测波长为220～290nm。

作为上述技术方案的改进，步骤(3)中，分别吸取特征图谱对照品溶液和特征图谱供试品溶液各1μL，注入液相色谱仪进行检测，其中，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm，柱温为38℃；所述液相色谱仪以甲醇为流动相A，以0.2％的磷酸水溶液为流动相B，流速为0.3mL/min。

作为上述技术方案的改进，步骤(3)中，检测时间为0～30分钟时，检测波长为220nm；检测时间为30～45分钟时，检测波长为290nm，检测时间为45～65分钟时，检测波长为260nm。

作为上述技术方案的改进，步骤(1)中，分别取没食子酸对照品、儿茶素对照品、苦杏仁苷对照品、表儿茶素没食子酸酯对照品、甘草苷对照品、芹糖甘草苷对照品、桂皮醛对照品、肉桂酸对照品、大黄酚-1-O-葡萄糖苷对照品、大黄酚-8-O-葡萄糖苷对照品、大黄素-8-O-葡萄糖苷对照品、大黄酸对照品、甘草酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品适量，分别加甲醇制成每1mL含没食子酸15μg、儿茶素100μg、苦杏仁苷30μg、表儿茶素没食子酸酯50μg、甘草苷30μg、芹糖甘草苷70μg、桂皮醛10μg、肉桂酸10μg、大黄酚-1-O-葡萄糖苷30μg、大黄酚-8-O-葡萄糖苷40μg、大黄素-8-O-葡萄糖苷50μg、大黄酸20μg、甘草酸100μg、大黄素10μg、大黄酚10μg的溶液，即得特征图谱对照品溶液。

作为上述技术方案的改进，步骤(2)中，所述提取溶剂为20～100％甲醇，提取时间为10～30min，提取方式为超声提取。

作为上述技术方案的改进，步骤(2)包括：

取桃核承气汤冻干粉0.15～0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇10mL，称定重量，分别取出，采用功率为200～300W，频率为40～50kHz的超声波处理20min，取出，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得特征图谱供试品溶液。

作为上述技术方案的改进，所述桃核承气汤的特征图谱包括15个特征峰；其中，峰1为没食子酸峰，峰2为儿茶素峰，峰3为苦杏仁苷峰，峰4为表儿茶素没食子酸酯峰，峰5为甘草苷峰，峰6为芹糖甘草苷峰，峰7为桂皮醛峰，峰8为肉桂酸峰，峰9为大黄酚-1-O-葡萄糖苷峰，峰10为大黄酚-8-O-葡萄糖苷峰，峰11为大黄素-8-O-葡萄糖苷峰，峰12为大黄酸峰，峰13为甘草酸峰，峰14为大黄素峰，峰15为大黄酚峰。

作为上述技术方案的改进，所述D-苦杏仁苷含量的测定方法为：

(1)取D-苦杏仁苷对照品，加甲醇制成每1mL含D-苦杏仁苷0.1～1mg的溶液，即得苦杏仁苷对照品溶液；

(2)取桃核承气汤制剂，加入提取溶剂提取，制得苦杏仁苷供试品溶液；

(3)吸取苦杏仁苷对照品溶液、苦杏仁苷供试品溶液，注入液相色谱仪，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，所述液相色谱仪以乙腈为流动相A，磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，测定得到桃核承气汤中D-苦杏仁苷的含量。

作为上述技术方案的改进，所述D-苦杏仁苷含量的测定方法按照以下洗脱程序进行：

0～10min，流动相A为3％，流动相B为97％；

10～12min，流动相A从3％→4％，流动相B从97％→96％；

12～40min，流动相A为4％，流动相B为96％；

40～45min，流动相A从4％→100％，流动相B从96％→0％。

作为上述技术方案的改进，所述D-苦杏仁苷含量的测定方法中，所述提取溶剂为50～70％甲醇，提取时间为30～45min，提取方式为超声提取。

作为上述技术方案的改进，所述D-苦杏仁苷含量的测定方法中，所述苦杏仁苷供试品溶液的制备方法为：

取桃核承气汤制剂0.4～1g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入70％甲醇25～50mL，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。

作为上述技术方案的改进，所述D-苦杏仁苷含量的测定方法中，分别吸取苦杏仁苷对照品溶液、苦杏仁苷供试品溶液各1～3μL，注入液相色谱仪进行检测，其中，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其柱长100mm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm，柱温为18～22℃；所述液相色谱仪以乙腈为流动相A，以0.2％的磷酸水溶液为流动相B，流速为0.38～0.42mL/min，检测波长为200～220nm。

作为上述技术方案的改进，所述总蒽醌含量的测定方法为：

(1)取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚适量，加甲醇制成混合溶液，制得蒽醌对照品溶液；

(2)取桃核承气汤制剂，利用甲醇提取，制得总蒽醌供试品溶液；

(3)吸取蒽醌对照品溶液和总蒽醌供试品溶液，注入液相色谱仪，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，测定得到桃核承气汤中总蒽醌含量。

作为上述技术方案的改进，所述游离蒽醌含量的测定方法为：

(1)取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚适量，加甲醇制成混合溶液，制得蒽醌对照品溶液；

(2)取桃核承气汤制剂，利用甲醇提取，制得游离蒽醌供试品溶液；

(3)吸取蒽醌对照品溶液和游离蒽醌供试品溶液，注入液相色谱仪，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，测定得到桃核承气汤中游离蒽醌含量。

作为上述技术方案的改进，所述总蒽醌含量的测定方法和游离蒽醌含量的测定方法均采用以下洗脱程序进行：

0～10min，流动相A从35％→40％，流动相B从65％→60％；

10～38min，流动相A从40％→60％，流动相B从60％→40％。

作为上述技术方案的改进，所述总蒽醌含量的测定方法中，提取方式为回流提取，提取溶剂用量为25～50mL，提取时间为30～90min。

作为上述技术方案的改进，所述总蒽醌供试品溶液的制备方法为：

取桃核承气汤制剂0.2～1g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25～50mL，称定重量，加热回流提取30～90分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液10～20mL，减压回收溶剂至干，加5％～10％盐酸溶液10～20mL，超声处理1～5分钟，再加三氯甲烷5～25mL，加热回流1～1.5小时，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3～5次，每次10～30mL，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

作为上述技术方案的改进，所述游离蒽醌供试品溶液的制备方法为：

取桃核承气汤的药物制剂0.2～1g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25～50mL，称定重量，加热回流30～90分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

作为上述技术方案的改进，所述总蒽醌含量的测定方法中，分别吸取蒽醌对照品溶液、总蒽醌供试品溶液各5～15μL，注入液相色谱仪进行检测；其中，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其柱长150mm，内径为3mm，粒径为5μm，柱温为28～32℃；所述液相色谱仪以乙腈为流动相A，以0.05～0.15％的磷酸水溶液为流动相B，流速为0.6～1mL/min，检测波长为250～260nm。

作为上述技术方案的改进，所述游离蒽醌含量的测定方法中，分别吸取蒽醌对照品溶液、游离蒽醌供试品溶液各5～15μL，注入液相色谱仪进行检测；其中，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其柱长150mm，内径为3mm，粒径为5μm，柱温为28～32℃；所述液相色谱仪以乙腈为流动相A，以0.05～0.15％的磷酸水溶液为流动相B，流速为0.6～1mL/min，检测波长为250～260nm。

作为上述技术方案的改进，所述肉桂酸、桂皮醛含量的测定方法为：

(1)取肉桂酸、桂皮醛对照品，加甲醇制成混合溶液，即得肉桂对照品溶液；

(2)取桃核承气汤制剂，加入提取溶剂提取，制得肉桂供试品溶液；

(3)吸取肉桂对照品溶液、肉桂供试品溶液，注入液相色谱仪，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，所述液相色谱仪以乙腈为流动相A，甲酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，测定得到桃核承气汤中肉桂酸和肉皮醛的含量。

作为上述技术方案的改进，所述肉桂酸、桂皮醛含量的测定方法中，所述梯度洗脱按下述程序进行：

0～15min，流动相A从32％→45％，流动相B从68％→55％；

15～25min，流动相A从45％→50％，流动相B从55％→50％；

25～30min，流动相A为50％，流动相B为50％。

作为上述技术方案的改进，所述肉桂酸、桂皮醛含量的测定方法中，所述提取溶剂为50～70％甲醇，提取时间为15～45min，提取方式为超声提取或回流提取，提取溶剂的用量为10～25mL。

作为上述技术方案的改进，所述肉桂酸、桂皮醛含量的测定方法中，分别吸取肉桂对照品溶液和肉桂供试品溶液各5～10μL，注入液相色谱仪进行检测，其中，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为2.5mm，粒径为5μm，柱温为28～32℃；所述液相色谱仪以乙腈为流动相A，以0.05％～0.15％的甲酸溶液为流动相B；流速为0.6～1.0mL/min；检测波长为280～290nm。

作为上述技术方案的改进，所述甘草酸含量的测定方法为：

(1)取甘草酸铵对照品，加70％乙醇制成每1mL含甘草酸0.1～1mg的溶液，即得甘草酸对照品溶液；

(2)取桃核承气汤制剂，加入提取溶剂提取，制得甘草酸供试品溶液；

(3)吸取甘草酸对照品溶液、甘草酸供试品溶液，注入液相色谱仪，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，所述液相色谱仪以乙腈为流动相A，磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，测定得到桃核承气汤中甘草酸的含量。

作为上述技术方案的改进，所述甘草酸含量的测定方法中，所述梯度洗脱按下述程序进行：

0～8min，流动相A为19％，流动相B为81％；

8～35min，流动相A从19％→50％，流动相B从81％→50％；

35～36min，流动相A从50％→100％，流动相B从50％→0％；

36～40min，流动相A从100％→19％，流动相B从0％→81％。

作为上述技术方案的改进，所述甘草酸含量的测定方法中，所述提取溶剂为50～70％乙醇，提取时间为15～45min，提取方式为超声提取或回流提取，提取溶剂的用量为10～50mL。

作为上述技术方案的改进，所述甘草酸含量的测定方法中，所述甘草酸供试品溶液的制备方法为：

取桃核承气汤制剂0.2g～0.3g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％～70％乙醇5mL～15mL，采用功率为200～300kW，频率为35～45kHz超声处理15～45分钟，取出，放冷，再称定重量，用70％～80％乙醇补足减失的重量，摇匀，取续滤液，即得。

作为上述技术方案的改进，所述甘草酸含量的测定方法中，分别吸取甘草酸对照品溶液和甘草酸供试品溶液各5～10μL，注入液相色谱仪测试；所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为2.5mm，粒径为5μm，柱温为22～28℃；所述液相色谱仪以乙腈为流动相A，以0.05％～0.10％的磷酸溶液为流动相B；流速为0.6～1.0mL/min；检测波长为240～260nm。

作为上述技术方案的改进，还包括：

(4)将桃核承气汤蒸干，测定其出膏率；

(5)测定桃核承气汤的溶出物。

作为上述技术方案的改进，所述桃核承气汤由以下重量份的组分组成：桃仁15份、大黄55.2份、肉桂27.6份、甘草27.6g、芒硝27.6g。

作为上述技术方案的改进，所述桃核承气汤的制备方法为：取桃仁、大黄、肉桂和甘草加水1200～1500mL浸泡，武火煮沸，文火沸腾至药液为400～600mL，滤过后滤液加入芒硝，加热煮沸即得。

作为上述技术方案的改进，所述桃核承气汤的制备方法为：取桃仁、大黄、肉桂和甘草加水1400mL浸泡，武火煮沸，文火沸腾至药液为500mL，滤过后滤液加入芒硝，加热煮沸即得。

实施本发明，具有如下有益效果：

(1)本发明所述建立的桃核承气汤的药物制剂质量控制方法，采用高效液相色谱法测定桃核承气汤各药味指标成分的含量，同时采用薄层色谱技术对各药味进行鉴别，结合桃核承气汤的药物制剂定量和定性分析，更加有利于其全面质量检测和整体质量控制，从而有助于提高该药物制剂使用的安全性和稳定性。

(2)本发明所述建立的理化沉淀反应对芒硝进行鉴别，该方法简单易操作，无阴性干扰，具有一定的专属性和良好重现性，可补充桃核承气汤现有研究资料存在芒硝定性研究缺陷。

(3)本发明对桃核承气汤建立了UPLC-UV特征图谱。采用UPLC-MS-MS进行相关物质基础研究的确认，标定了共22个特征峰，可充分展示桃核承气汤的化学成分的特征，特征峰信息量丰富，该方法稳定，准确可靠，实现对多个药味的特征成分的质量监控。

(4)本发明所述建立的桃核承气汤含量测定方法，包括除芒硝外的其余四味药，桃仁、大黄、肉桂、甘草中含有的苦杏仁苷、总蒽醌、游离蒽醌、结合蒽醌、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸检验方法，提取前处理方法简单，指标成分可被充分提取，分析准确、快速、灵敏度高、成本低，各项方法学指标均可满足实际检测的需求；所建立的鉴别方法，分离度较好，阴性无干扰，斑点检视清晰，具有较强的专属性和可行性，能更好地控制大生产过程中制剂的质量。

附图说明

图1是本发明中桃仁的专属性薄层色谱图，其中，1～3为桃仁薄层供试品，4为桃仁对照药材，5为缺桃仁阴性样品；

图2是4℃下桃仁的薄层色谱图，其中，1～3为桃仁薄层供试品，4为桃仁对照药材，5为缺桃仁阴性样品；

图3是25℃下桃仁的薄层色谱图，其中，1～3为桃仁薄层供试品，4为桃仁对照药材，5为缺桃仁阴性样品；

图4是相对湿度为25％时桃仁的薄层色谱图，其中，1～3为桃仁薄层供试品，4为桃仁对照药材，5为缺桃仁阴性样品；

图5是相对湿度为75％时桃仁的薄层色谱图，其中，1～3为桃仁薄层供试品，4为桃仁对照药材，5为缺桃仁阴性样品；

图6是采用烟台银龙硅胶G板时桃仁的薄层色谱图，其中，1～3为桃仁薄层供试品，4为桃仁对照药材，5为缺桃仁阴性样品；

图7是采用青岛邦凯硅胶G板时桃仁的薄层色谱图，其中，1～3为桃仁薄层供试品，4为桃仁对照药材，5为缺桃仁阴性样品；

图8是多批次桃核承气汤样品中桃仁的薄层色谱图，其中，1～10分别为S1～S10批次桃仁薄层供试品，11为桃仁对照药材；

图9是多批次桃核承气汤样品中桃仁的薄层色谱图，其中，11～20分别为S11～S20批次桃仁薄层供试品，11为桃仁对照药材；

图10是本发明中大黄的专属性薄层色谱图(365nm)，其中，1～3为大黄薄层供试品，4为大黄对照药材，5为大黄薄层对照品，6为缺大黄阴性样品；

图11是本发明中大黄的专属性薄层色谱图(日光)，其中，1～3为大黄薄层供试品，4为大黄对照药材，5为大黄薄层对照品，6为缺大黄阴性样品；

图12是4℃下大黄的薄层色谱图(365nm)，其中，1～3为大黄薄层供试品，4为大黄对照药材，5为大黄薄层对照品，6为缺大黄阴性样品；

图13是4℃下大黄的薄层色谱图(日光)，其中，1～3为大黄薄层供试品，4为大黄对照药材，5为大黄薄层对照品，6为缺大黄阴性样品；

图14是25℃下大黄的薄层色谱图(365nm)，其中，1～3为大黄薄层供试品，4为大黄对照药材，5为大黄薄层对照品，6为缺大黄阴性样品；

图15是25℃下大黄的薄层色谱图(日光)，其中，1～3为大黄薄层供试品，4为大黄对照药材，5为大黄薄层对照品，6为缺大黄阴性样品；

图16是相对湿度为25％时大黄的薄层色谱图(365nm)，其中，1～3为大黄薄层供试品，4为大黄对照药材，5为大黄薄层对照品，6为缺大黄阴性样品；

图17是相对湿度为25％时大黄的薄层色谱图(日光)，其中，1～3为大黄薄层供试品，4为大黄对照药材，5为大黄薄层对照品，6为缺大黄阴性样品；

图18是相对湿度为75％时大黄的薄层色谱图(365nm)，其中，1～3为大黄薄层供试品，4为大黄对照药材，5为大黄薄层对照品，6为缺大黄阴性样品；

图19是相对湿度为75％时大黄的薄层色谱图(日光)，其中，1～3为大黄薄层供试品，4为大黄对照药材，5为大黄薄层对照品，6为缺大黄阴性样品；

图20是采用烟台银龙硅胶H板时大黄的薄层色谱图(365nm)，其中，1～3为大黄薄层供试品，4为大黄对照药材，5为大黄薄层对照品，6为缺大黄阴性样品；

图21是采用烟台银龙硅胶H板时大黄的薄层色谱图(日光)，其中，1～3为大黄薄层供试品，4为大黄对照药材，5为大黄薄层对照品，6为缺大黄阴性样品；

图22是采用青岛海洋硅胶H板时大黄的薄层色谱图(365nm)，其中，1～3为大黄薄层供试品，4为大黄对照药材，5为大黄薄层对照品，6为缺大黄阴性样品；

图23是采用青岛海洋硅胶H板时大黄的薄层色谱图(日光)，其中，1～3为大黄薄层供试品，4为大黄对照药材，5为大黄薄层对照品，6为缺大黄阴性样品；

图24是多批次桃核承气汤样品中大黄的薄层色谱图(365nm)，其中，1～10分别为S1～S10批次大黄薄层供试品，11为大黄对照药材，12为大黄薄层对照品；

图25是多批次桃核承气汤样品中大黄的薄层色谱图(日光)，其中，1～10分别为S1～S10批次大黄薄层供试品，11为大黄对照药材，12为大黄薄层对照品；

图26是多批次桃核承气汤样品中大黄的薄层色谱图(365nm)，其中，1～10分别为S11～S20批次大黄薄层供试品，11为大黄对照药材，12为大黄薄层对照品；

图27是多批次桃核承气汤样品中大黄的薄层色谱图(日光)，其中，1～10分别为S11～S20批次大黄薄层供试品，11为大黄对照药材，12为大黄薄层对照品；

图28是发明中肉桂的专属性薄层色谱图，其中，1～3为肉桂薄层供试品，4为肉桂对照药材，5为肉桂薄层对照品，6为缺肉桂阴性样品；

图29是4℃下肉桂的薄层色谱图，其中，1～3为肉桂薄层供试品，4为肉桂对照药材，5为肉桂薄层对照品，6为缺肉桂阴性样品；

图30是25℃下肉桂的薄层色谱图，其中，1～3为肉桂薄层供试品，4为肉桂对照药材，5为肉桂薄层对照品，6为缺肉桂阴性样品；

图31是相对湿度为25％时肉桂的薄层色谱图，其中，1～3为肉桂薄层供试品，4为肉桂对照药材，5为肉桂薄层对照品，6为缺肉桂阴性样品；

图32是相对湿度为75％时肉桂的薄层色谱图，其中，1～3为肉桂薄层供试品，4为肉桂对照药材，5为肉桂薄层对照品，6为缺肉桂阴性样品；

图33是采用青岛海洋硅胶GF₂₅₄板时肉桂的薄层色谱图，其中，1～3为肉桂薄层供试品，4为肉桂对照药材，5为肉桂薄层对照品，6为缺肉桂阴性样品；

图34是采用默克硅胶GF₂₅₄板时肉桂的薄层色谱图，其中，1～3为肉桂薄层供试品，4为肉桂对照药材，5为肉桂薄层对照品，6为缺肉桂阴性样品；

图35是多批次桃核承气汤样品中肉桂的薄层色谱图，其中，1～10分别为S1～S10批次大黄薄层供试品，11为肉桂对照药材，12为肉桂薄层对照品；

图36是多批次桃核承气汤样品中肉桂的薄层色谱图，其中，1～10分别为S11～S20批次大黄薄层供试品，11为肉桂对照药材，12为肉桂薄层对照品；

图37是发明中甘草的专属性薄层色谱图，其中，1～3为甘草薄层供试品，4为甘草对照药材，5为甘草薄层对照品，6为缺甘草阴性样品；

图38是4℃下甘草的专属性薄层色谱图，其中，1～3为甘草薄层供试品，4为甘草对照药材，5为甘草薄层对照品，6为缺甘草阴性样品；

图39是25℃下甘草的专属性薄层色谱图，其中，1～3为甘草薄层供试品，4为甘草对照药材，5为甘草薄层对照品，6为缺甘草阴性样品；

图40是相对湿度为25％时甘草的专属性薄层色谱图，其中，1～3为甘草薄层供试品，4为甘草对照药材，5为甘草薄层对照品，6为缺甘草阴性样品；

图41是相对湿度为75％时甘草的专属性薄层色谱图，其中，1～3为甘草薄层供试品，4为甘草对照药材，5为甘草薄层对照品，6为缺甘草阴性样品；

图42是采用烟台银龙1％氢氧化钠碱板时甘草的专属性薄层色谱图，其中，1～3为甘草薄层供试品，4为甘草对照药材，5为甘草薄层对照品，6为缺甘草阴性样品；

图43是采用青岛永海1％氢氧化钠碱板时甘草的专属性薄层色谱图，其中，1～3为甘草薄层供试品，4为甘草对照药材，5为甘草薄层对照品，6为缺甘草阴性样品；

图44是多批次桃核承气汤样品中甘草的薄层色谱图，其中，1～10分别为S1～S10批次甘草薄层供试品，11为甘草对照药材，12为甘草薄层对照品；

图45是多批次桃核承气汤样品中甘草的薄层色谱图，其中，1～10分别为S11～S20批次甘草薄层供试品，11为甘草对照药材，12为甘草薄层对照品；

图46是本发明中桃核承气汤采用220nm波长测定时的特征图谱；

图47是本发明中桃核承气汤采用260nm波长测定时的特征图谱；

图48是本发明中桃核承气汤采用290nm波长测定时的特征图谱；

图49是本发明桃核承气汤采用乙腈-磷酸作为流动相测定时的特征图谱；

图50是本发明桃核承气汤采用甲醇-水作为流动相测定时的特征图谱；

图51是本发明桃核承气汤采用甲醇-磷酸作为流动相测定时的特征图谱；

图52是本发明桃核承气汤采用不同色谱柱测定时的特征图谱；

图53是本发明桃核承气汤采用不同柱温测定时的特征图谱；

图54是本发明桃核承气汤采用不同流速测定时的特征图谱；

图55是本发明桃核承气汤特征图谱专属性考察中桃核承气汤、桃仁对照药材、缺桃仁阴性样品的特征图谱；其中，峰1为没食子酸峰，峰2为儿茶素峰，峰3为苦杏仁苷峰，峰4为表儿茶素没食子酸酯峰，峰5为甘草苷峰，峰6为芹糖甘草苷峰，峰7为桂皮醛峰，峰8为肉桂酸峰，峰9为大黄酚-1-O-葡萄糖苷峰，峰10为大黄酚-8-O-葡萄糖苷峰，峰11为大黄素-8-O-葡萄糖苷峰，峰12为大黄酸峰，峰13为甘草酸峰，峰14为大黄素峰，峰15为大黄酚峰；

图56是本发明桃核承气汤特征图谱专属性考察中桃核承气汤、大黄对照药材、缺大黄阴性样品的特征图谱；其中，峰1为没食子酸峰，峰2为儿茶素峰，峰3为苦杏仁苷峰，峰4为表儿茶素没食子酸酯峰，峰5为甘草苷峰，峰6为芹糖甘草苷峰，峰7为桂皮醛峰，峰8为肉桂酸峰，峰9为大黄酚-1-O-葡萄糖苷峰，峰10为大黄酚-8-O-葡萄糖苷峰，峰11为大黄素-8-O-葡萄糖苷峰，峰12为大黄酸峰，峰13为甘草酸峰，峰14为大黄素峰，峰15为大黄酚峰；

图57是本发明桃核承气汤特征图谱专属性考察中桃核承气汤、肉桂对照药材、缺肉桂阴性样品的特征图谱；其中，峰1为没食子酸峰，峰2为儿茶素峰，峰3为苦杏仁苷峰，峰4为表儿茶素没食子酸酯峰，峰5为甘草苷峰，峰6为芹糖甘草苷峰，峰7为桂皮醛峰，峰8为肉桂酸峰，峰9为大黄酚-1-O-葡萄糖苷峰，峰10为大黄酚-8-O-葡萄糖苷峰，峰11为大黄素-8-O-葡萄糖苷峰，峰12为大黄酸峰，峰13为甘草酸峰，峰14为大黄素峰，峰15为大黄酚峰；

图58是本发明桃核承气汤特征图谱专属性考察中桃核承气汤、甘草对照药材、缺甘草阴性样品的特征图谱；其中，峰1为没食子酸峰，峰2为儿茶素峰，峰3为苦杏仁苷峰，峰4为表儿茶素没食子酸酯峰，峰5为甘草苷峰，峰6为芹糖甘草苷峰，峰7为桂皮醛峰，峰8为肉桂酸峰，峰9为大黄酚-1-O-葡萄糖苷峰，峰10为大黄酚-8-O-葡萄糖苷峰，峰11为大黄素-8-O-葡萄糖苷峰，峰12为大黄酸峰，峰13为甘草酸峰，峰14为大黄素峰，峰15为大黄酚峰；

图59是20批次桃核承气汤样品的特征图谱叠加图；其中，峰1为没食子酸峰，峰2为儿茶素峰，峰3为苦杏仁苷峰，峰4为表儿茶素没食子酸酯峰，峰5为甘草苷峰，峰6为芹糖甘草苷峰，峰7为桂皮醛峰，峰8为肉桂酸峰，峰9为大黄酚-1-O-葡萄糖苷峰，峰10为大黄酚-8-O-葡萄糖苷峰，峰11为大黄素-8-O-葡萄糖苷峰，峰12为大黄酸峰，峰13为甘草酸峰，峰14为大黄素峰，峰15为大黄酚峰；

图60是桃核承气汤指纹图谱对照品指认色谱峰叠加图，其中，峰1为没食子酸峰，峰2为儿茶素峰，峰3为苦杏仁苷峰，峰4为表儿茶素没食子酸酯峰，峰5为甘草苷峰，峰6为芹糖甘草苷峰，峰7为桂皮醛峰，峰8为肉桂酸峰，峰9为大黄酚-1-O-葡萄糖苷峰，峰10为大黄酚-8-O-葡萄糖苷峰，峰11为大黄素-8-O-葡萄糖苷峰，峰12为大黄酸峰，峰13为甘草酸峰，峰14为大黄素峰，峰15为大黄酚峰；

图61是桃核承气汤供试品溶液总离子流质谱与紫外液相色谱图；

图62是桃核承气汤苦杏仁苷专属性考察色谱图；其中，峰1为D-苦杏仁苷峰；

图63是桃核承气汤总蒽醌专属性考察色谱图；其中，峰1为芦荟大黄素峰，峰2为大黄酸峰，峰3为大黄素峰，峰4为大黄酚峰，峰5为大黄素甲醚峰；

图64是桃核承气汤游离蒽醌专属性考察色谱图；其中，峰1为芦荟大黄素峰，峰2为大黄酸峰，峰3为大黄素峰，峰4为大黄酚峰，峰5为大黄素甲醚峰；

图65是桃核承气汤肉桂酸、桂皮醛专属性考察色谱图；其中，峰1为肉桂酸峰，峰2为桂皮醛峰；

图66是桃核承气汤甘草酸专属性考察色谱图；其中，峰1为甘草酸峰。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施方式对本发明作进一步地详细描述。

本发明的桃核承气汤出自伤寒论，现有记载中一般认为其由桃仁、大黄、桂枝、炙甘草、芒硝组成。基于古籍文献进行多方面循古考证，所确定的桃核承气汤方剂如下：燀桃仁(山桃)15.0g、大黄(掌叶大黄)55.2g、肉桂27.6g、炒甘草27.6g、芒硝27.6g。其中，各药材经鉴定符合2020年版《中国药典》一部相关项下规定。需要说明的是，张仲景对《伤寒论》中药物下方标注的炙，与现代药典中的清炒法最为接近，古代不加辅料炒制分为炒黄和炒炭两种方法，结合2020年版《中国药典》并参照了其他地方的炮制规范，确定了桃仁为燀桃仁或山桃仁，大黄为掌叶大黄，桂枝为肉桂，炙甘草为炒甘草。

进一步的，基于古籍文献考证确定桃核承气汤传统汤剂的制法为：取除芒硝外的上述四味，加水1400mL，浸泡，武火煮沸，文火保持沸腾至药液约500mL，筛网滤过，滤液加入芒硝，加热至微沸，得桃核承气汤汤剂。

本发明中所采用的桃核承气汤样品均为桃核承气汤冻干粉，具体的，将桃核承气汤汤剂搅匀分装棕色西林瓶中，转移至真空循环泵真空冷冻干燥机中冷冻干燥，取出，得冻干粉，即得桃核承气汤冻干粉。此外，为了全面地反映桃核承气汤的质量信息，发明人针对各药材收集了不少于3个产地15个批次，并制备样品进行研究。

进一步的，在制备过程中，对出膏率进行了研究，其具体包括：取桃核承气汤标准汤剂25mL，精密称定，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3小时，置干燥器中冷却30分钟，迅速精密称定重量，根据所用药材的重量计算出膏率。结果表明：出膏率平均值为22.6％，范围应在16.0％～29.0％。

此外，还对桃核承气汤的浸出物进行了研究。具体的，取桃核承气汤2g，精密称定，精密加入95％乙醇100mL，密塞，称定重量，静置1小时后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1小时。放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取滤液25mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3小时，置干燥器中冷却30分钟，迅速精密称定重量。除另有规定外，以干燥品计算供试品中水溶性浸出物的含量(％)。结果表明：浸出物平均值为42.4％，范围应在30.0％～55.0％。

为了全面地反映桃核承气汤的质量信息，实现全面、有效地控制桃核承气汤产品质量，本发明提供了一种桃核承气汤物质基准的建立方法，以下对其进行详细说明：

一、仪器与试药

本发明所用到的仪器、试剂与试药信息如表1～表4所示：

表1仪器信息汇总表

表2试剂信息汇总表

表3对照品信息

表4 20批对应实物饮片组方信息表

二、桃核承气汤中桃仁的薄层色谱鉴别方法

2.1鉴别方法

(1)供试品溶液制备：取桃核承气汤冻干粉0.5g，研细，加乙醚40mL，加热回流1h，滤过，滤液挥干，残渣加三氯甲烷1mL使溶解，作为桃仁薄层供试品溶液。

(2)参照物溶液制备：取桃仁(山桃)对照药材1g，加水100mL，加热煮沸30分钟，滤过，滤液浓缩至约20mL，用乙醚振摇提取2次，每次20mL，合并乙醚液，挥干，残渣加三氯甲烷1mL使溶解，作成桃仁对照药材溶液。

(3)分别吸取上述桃仁薄层供试品溶液、桃仁对照药材溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯(8.5：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。桃仁薄层供试品色谱中，在与桃仁对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

2.2方法学验证

2.2.1专属性

取桃仁阴性样品按照上述供试品溶液制备方法制备缺桃仁阴性样品溶液；将5μL桃仁薄层供试品溶液、5μL缺桃仁阴性样品溶液、5μL桃仁对照药材溶液点样于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯(8.5：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。结果表明，本发明的桃仁薄层色谱鉴别方法阴性无干扰，方法专属性良好。实验结果见图1。

2.2.2耐用性

(1)不同温度、湿度的比较

分别吸取5μL桃仁薄层供试品溶液、5μL桃仁对照药材溶液点样于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯(8.5：1)为展开剂，分别在常温25℃和低温4℃、高湿75％和低湿25％条件下展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。实验结果见图2～5。

由图可见，在不同温度、湿度条件下，分离效果均较好，且供试品色谱在与对照药材色谱相应的位置处，均显示相同颜色的斑点。实验结果表明，温湿度对桃核承气汤桃仁的薄层鉴别影响较小，说明该薄层鉴别方法对不同温度、湿度的耐用性较好。

(2)不同厂家薄层板的比较

分别吸取5μL桃仁供试品溶液、5μL桃仁对照药材溶液点样于不同厂家硅胶G薄层板(烟台银龙硅胶G薄层板、青岛邦凯硅胶G预制板)，以石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯(8.5：1)为展开剂，分别在常温25℃和低温4℃、高湿75％和低湿25％条件下展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。实验结果见图6～7。

结果表明：不同厂家硅胶G薄层板(烟台银龙硅胶G薄层板、青岛邦凯硅胶G预制板)对桃核承气汤中桃仁的薄层鉴别无显著影响，说明该薄层鉴别方法对不同厂家硅胶G薄层板的耐用性良好。

2.3不同批次样品的鉴别

取20批次桃核承气汤对应实物，按上述的鉴别方法进行鉴别，结果如图8、图9所示。从图中可以看出，20批次桃核承气汤样品与对照药材色谱相应的位置上，均显相同颜色的荧光斑点。

三、桃核承气汤中大黄的薄层色谱鉴别方法

3.1鉴别方法

(1)供试品溶液制备：取桃核承气汤冻干粉0.1g，加甲醇20mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10mL使溶解，再加盐酸1mL，加热回流30分钟，立即冷却，用乙醚振摇提取2次，每次20mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲烷1mL使溶解，作为大黄薄层供试品溶液。

(2)参照物溶液制备：取大黄(掌叶大黄)对照药材0.1g，加水100mL，加热煮沸45分钟，滤过，滤液浓缩至约10mL，再加盐酸1mL，加热回流30分钟，立即冷却，用乙醚振摇提取2次，每次20mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲烷1mL使溶解，作为大黄对照药材溶液。再取大黄素、大黄酚、大黄酸、芦荟大黄素、大黄素甲醚对照品，加甲醇制成每1mL各含0.1mg的混合溶液，作为大黄薄层对照品溶液。

(3)分别吸取上述大黄薄层供试品溶液10μL、大黄对照药材溶液5μL、大黄薄层对照品溶液5μL，分别点于同一硅胶H薄层板上，以石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15：5：1)上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与大黄对照药材色谱及大黄薄层对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；置氨蒸气中熏后，斑点变为红色。

3.2方法学验证

3.2.1专属性

取大黄阴性样品按照上述供试品溶液制备方法制备缺大黄阴性样品溶液；将10μL大黄薄层供试品溶液、10μL缺大黄阴性样品溶液、5μL大黄对照药材溶液以及5μL大黄薄层对照品溶液点样于同一硅胶H薄层板上，以石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15：5：1)上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视，置氨蒸气中显色，日光下检视。实验结果表明，本发明的大黄薄层色谱鉴别方法阴性无干扰，方法专属性良好。实验结果见图10～11。

3.2.2耐用性

(1)不同温度、湿度的比较

分别吸取10μL大黄薄层供试品溶液、5μL大黄对照药材溶液、5μL大黄保持呢个对照品溶液点样于同一硅胶H薄层板上，以石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15：5：1)上层溶液为展开剂，分别在常温25℃和低温4℃、高湿75％和低湿25％条件下展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；置氨蒸气中熏后，斑点变为红色。实验结果见图12～19。

由图可见，在不同温度、湿度条件下，分离效果均较好，且供试品色谱在与对照药材色谱、对照品色谱相应的位置处，均显示相同颜色的斑点。实验结果表明，温湿度对桃核承气汤大黄的薄层鉴别影响较小，说明该薄层鉴别方法对不同温度、湿度的耐用性较好。

(2)不同厂家薄层板的比较

分别吸取10μL大黄薄层供试品溶液、5μL大黄对照药材溶液、5μL大黄薄层对照品溶液点样于不同厂家硅胶H薄层板(烟台银龙硅胶H薄层板、青岛海洋硅胶H预制板)，以石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15：5：1)上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；置氨蒸气中熏后，斑点变为红色。实验结果见图20～23。

结果表明：不同厂家硅胶H薄层板(烟台银龙硅胶H薄层板、青岛海洋硅胶H预制板)对桃核承气汤中大黄的薄层鉴别无显著影响，说明该薄层鉴别方法对不同厂家硅胶G薄层板的耐用性良好。

3.3不同批次样品的鉴别

取20批次桃核承气汤对应实物，按上述的鉴别方法进行鉴别，结果如图24～27所示。从图中可以看出，20批次桃核承气汤样品色谱与对照药材色谱、对照品色谱相应的位置上，均显相同颜色的荧光斑点；且置氨蒸气中熏后，斑点变为红色。

四、桃核承气汤中肉桂的薄层色谱鉴别方法

4.1鉴别方法

(1)供试品溶液制备：取桃核承气汤冻干粉0.5g，研细，加甲醇30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20mL使溶解，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解，作为肉桂薄层供试品溶液。

(2)参照物溶液制备：取肉桂对照药材1g，加水100mL，微沸30分钟，滤过，滤液浓缩至约20mL，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解，作为肉桂对照药材溶液。再取肉桂酸对照品，加甲醇制成每1mL各含0.5mg的溶液，作为肉桂薄层对照品溶液。

(3)分别吸取上述肉桂薄层供试品溶液5μL、肉桂对照药材溶液5μL、肉桂薄层对照品溶液2μL，分别点于同一硅胶GF₂₅₄板上，以石油醚(30～60℃)-正己烷-甲酸乙酯-甲酸(10：30：15：1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

4.2方法学验证

4.2.1专属性

取肉桂阴性样品按照上述供试品溶液制备方法制备缺肉桂阴性样品溶液；将5μL肉桂薄层供试品溶液、5μL缺肉桂阴性样品溶液、5μL肉桂对照药材溶液、2μL肉桂薄层对照品溶液点样于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，以石油醚(30～60℃)-正己烷-甲酸乙酯-甲酸(10：30：15：1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。实验结果表明，本发明的肉桂薄层色谱鉴别方法阴性无干扰，方法专属性良好。实验结果见图28。

4.2.2耐用性

(1)不同温度、湿度的比较

分别吸取5μL肉桂薄层供试品溶液、5μL肉桂对照药材溶液、2μL肉桂薄层对照品溶液点样于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，以石油醚(30～60℃)-正己烷-甲酸乙酯-甲酸(10：30：15：1)为展开剂，分别在常温25℃和低温4℃、高湿75％和低湿25％条件下展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。实验结果见图29～32。

由图可见，在不同温度、湿度条件下，分离效果均较好，且供试品色谱在与对照药材色谱、对照品色谱相应的位置处，均显示相同颜色的斑点。实验结果表明，温湿度对桃核承气汤肉桂的薄层鉴别影响较小，说明该薄层鉴别方法对不同温度、湿度的耐用性较好。

(2)不同厂家薄层板的比较

分别吸取5μL肉桂薄层供试品溶液、5μL肉桂对照药材溶液、2μL肉桂薄层对照品溶液点样于不同厂家硅胶GF₂₅₄薄层板(青岛海洋硅胶GF₂₅₄薄层板、默克GF₂₅₄预制板)，以石油醚(30～60℃)-正己烷-甲酸乙酯-甲酸(10：30：15：1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。实验结果见图33～34。

结果表明：不同厂家硅胶GF₂₅₄薄层板(青岛海洋硅胶GF₂₅₄薄层板、默克GF₂₅₄预制板)对桃核承气汤中肉桂的薄层鉴别无显著影响，说明该薄层鉴别方法对不同厂家硅胶G薄层板的耐用性良好。

4.3不同批次样品的鉴别

取20批次桃核承气汤对应实物，按上述的鉴别方法进行鉴别，结果如图35、图36所示。从图中可以看出，20批次桃核承气汤样品色谱与对照药材色谱、对照品色谱相应的位置上，均显相同颜色的荧光斑点。

五、桃核承气汤中甘草的薄层色谱鉴别方法

5.1鉴别方法

(1)供试品溶液制备：取桃核承气汤制剂0.2g，研细，加甲醇20mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水15mL使溶解，用正丁醇振摇提取2次，每次20mL，合并正丁醇液，用水洗2次，每次30mL，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为甘草薄层供试品溶液。

(2)参照物溶液制备：取甘草对照药材0.3g，加水50mL，加热煮沸30分钟，滤过，滤液用正丁醇振摇提取2次，每次20mL，合并正丁醇液，用水洗2次，每次30mL，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，制成甘草对照药材溶液。再取甘草苷、芹糖甘草苷对照品，加甲醇制成每1mL各含0.5mg的混合溶液，作为甘草薄层对照品溶液。

(3)分别吸取上述甘草薄层供试品溶液2μL、甘草对照药材溶液1μL、甘草薄层对照品溶液2μL，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰乙酸-水(15：1：1：2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

5.2方法学验证

5.2.1专属性

取甘草阴性样品按照上述供试品溶液制备方法制备缺甘草阴性样品溶液；将2μL甘草薄层供试品溶液、2μL缺甘草阴性样品溶液、1μL甘草对照药材溶液、2μL甘草薄层对照品溶液点样于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰乙酸-水(15：1：1：2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。实验结果表明，本发明的甘草薄层色谱鉴别方法阴性无干扰，方法专属性良好。实验结果见图37。

5.2.2耐用性

(1)不同温度、湿度的比较

分别吸取2μL甘草薄层供试品溶液、2μL缺甘草阴性样品溶液、1μL甘草对照药材溶液、2μL甘草薄层对照品溶液点样于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰乙酸-水(15：1：1：2)为展开剂，分别在常温25℃和低温4℃、高湿75％和低湿25％条件下展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。实验结果见图38～41。

由图可见，在不同温度、湿度条件下，分离效果均较好，且供试品色谱在与对照药材色谱、对照品色谱相应的位置处，均显示相同颜色的荧光斑点。实验结果表明，温湿度对桃核承气汤甘草的薄层鉴别影响较小，说明该薄层鉴别方法对不同温度、湿度的耐用性较好。

(2)不同厂家薄层板的比较

分别吸取2μL甘草薄层供试品溶液、1μL甘草对照药材溶液、2μL甘草薄层对照品溶液点样于不同厂家1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板(烟台银龙硅胶1％氢氧化钠预制板和青岛海洋1％氢氧化钠预制板)，以乙酸乙酯-甲酸-冰乙酸-水(15：1：1：2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。实验结果见图42～43。

结果表明：不同厂家1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板(烟台银龙硅胶1％氢氧化钠预制板和青岛海洋1％氢氧化钠预制板)对桃核承气汤中甘草的薄层鉴别无显著影响，说明该薄层鉴别方法对不同厂家硅胶G薄层板的耐用性良好。

5.3不同批次样品的鉴别

取20批次桃核承气汤对应实物，按上述的鉴别方法进行鉴别，结果如图44、图45所示。从图中可以看出，20批次桃核承气汤样品色谱与对照药材色谱、对照品色谱相应的位置上，均显相同颜色的荧光斑点。

六、桃核承气汤中芒硝的理化鉴别方法

取桃核承气汤冻干粉0.2g，置坩埚中，缓缓炽热至完全炭化后，置550℃炽灼2小时，放冷，残渣加水5mL，搅拌，滤过，取滤液2mL，加稀醋酸至溶液呈中性后，加95％乙醇4滴，加醋酸氧铀锌试液1mL，搅拌1分钟，静置，产生黄色沉淀(醋酸氧铀锌钠)。另取滤液2mL，加氯化钡试液1滴，即生成白色沉淀，沉淀在盐酸和硝酸中均不溶解。

七、桃核承气汤的指纹图谱构建方法

7.1色谱条件与参照物溶液、供试品溶液的制备

7.1.1色谱条件

色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长150mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm，色谱柱：Waters CORTECS T3柱)；以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸水溶液为流动相B，按表中的规定进行梯度洗脱；柱温为38℃；流速为每分钟0.3mL；进样量1μl，检测波长0-30分钟为220nm，30-45分钟为290nm，45-65分钟为260nm。理论板数按儿茶素峰计算应不低于10000。

表5桃核承气汤指纹图谱用梯度洗脱表

7.1.2对照品溶液的制备

对照品溶液的制备：分别精密称取没食子酸对照品、儿茶素对照品、苦杏仁苷对照品、表儿茶素没食子酸酯对照品、甘草苷对照品、芹糖甘草苷对照品、桂皮醛对照品、肉桂酸对照品、大黄酚-1-O-葡萄糖苷对照品、大黄酚-8-O-葡萄糖苷对照品、大黄素-8-O-葡萄糖苷对照品、大黄酸对照品、甘草酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1mL含没食子酸15μg、儿茶素100μg、苦杏仁苷30μg、表儿茶素没食子酸酯50μg、甘草苷30μg、芹糖甘草苷70μg、桂皮醛10μg、肉桂酸10μg、大黄酚-1-O-葡萄糖苷30μg、大黄酚-8-O-葡萄糖苷40μg、大黄素-8-O-葡萄糖苷50μg、大黄酸20μg、甘草酸100μg、大黄素10μg、大黄酚10μg的溶液，即得特征图谱对照品溶液。

7.1.3供试品溶液的制备

取桃核承气汤冻干粉约0.25g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇10mL，超声处理(功率250W，频率45kHz)20分钟，取出，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得特征图谱供试品溶液。

7.1.4测定法

分别精密吸取特征图谱对照品溶液与特征图谱供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，即得。供试品特征图谱中应分别呈现与对照品色谱峰保留时间相对应的色谱峰。按中药色谱特征图谱相似度评价系统计算，供试品特征图谱与对照特征图谱的相似度不得低于0.90。供试品特征图谱中应呈现15个特征峰；其中，峰1为没食子酸峰，峰2为儿茶素峰，峰3为苦杏仁苷峰，峰4为表儿茶素没食子酸酯峰，峰5为甘草苷峰，峰6为芹糖甘草苷峰，峰7为桂皮醛峰，峰8为肉桂酸峰，峰9为大黄酚-1-O-葡萄糖苷峰，峰10为大黄酚-8-O-葡萄糖苷峰，峰11为大黄素-8-O-葡萄糖苷峰，峰12为大黄酸峰，峰13为甘草酸峰，峰14为大黄素峰，峰15为大黄酚峰。

7.2色谱条件的确定

7.2.1最佳吸收波长的确定

对不同吸收波长进行考察；吸收波长分别为220nm、260nm、290nm。采用WatersCORTECS T3(2.1×150mm，1.6μm)色谱柱；以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸为流动相B，按表5中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3mL；进样量为1μL；结果见图46～图48。

实验结果表明，通过全波长扫描，发现在220～290nm之间，供试品色谱中较多色谱峰响应值较高，但桂皮醛、肉桂酸色谱峰在290nm有最大吸收，综合考虑所得色谱图在不同波长下各色谱峰的数目、丰度、分离程度，以及基线的漂移情况等因素，最终选择测试时间为0～30分钟时检测波长为220nm；测试时间为30～45分钟时，检测波长为290nm；测试时间为45～65分钟时，检测波长为260nm。

7.2.2不同流动相的考察

对流动相类型进行考察，分别选用乙腈-磷酸、甲醇-水、甲醇-0.1vol％磷酸水溶液、甲醇-0.2vol％磷酸水溶液作为流动相，并采用如表5的梯度洗脱程序进行考察。采用Waters CORTECS T3(2.1×150mm，1.6μm)色谱柱；流速为每分钟0.3mL；进样量为1μL；测试时间为0～30分钟时检测波长为220nm；测试时间为30～45分钟时，检测波长为290nm；测试时间为45～65分钟时，检测波长为260nm。结果见图49～图51。

由图可知，采用乙腈-磷酸为流动相，供试品色谱较多成分出峰较早，色谱峰分离差；以甲醇-水为流动相，色谱峰较少，且分离度较差；以甲醇-磷酸作为流动相，色谱图信息较为丰富，色谱峰分离度较好，基线较平稳，出峰时间适宜。最终确定以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸水溶液为流动相B，按表5程序进行梯度洗脱。

7.2.3不同色谱柱的考察

分别比较了Waters CORTECS T3柱(1.6μm，150mm×2.1mm)、Phenomenex Omega1.6μm PS C18 100A柱(1.6μm，150mm×2.1mm)、Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱(1.8μm，150mm×2.1mm)三根色谱柱对桃核承气汤特征图谱色谱行为的影响。除色谱柱外，其他测试条件如7.1.1小节。结果见图52。

实验结果表明，不同色谱柱对桃核承气汤特征图谱色谱峰峰数、峰形、峰分离度存在较大影响，以Waters CORTECS T3柱(1.6μm，150mm×2.1mm)为色谱柱，色谱峰峰数稍多，且峰形较好，基线较平稳，故选择Waters CORTECS T3柱(1.6μm，150mm×2.1mm)为桃核承气汤特征图谱研究色谱柱。

7.2.4不同柱温的考察

分别考察了柱温为30℃、35℃、38℃、40℃对桃核承气汤特征图谱的影响。除柱温外，其他测试条件如7.1.1小节。结果如图53所示。

实验结果表明，不同色谱柱温度对桃核承气汤特征图谱的色谱行为存在一定影响，综合考虑色谱峰峰形、峰分离度、基线等情况，本实验确定桃核承气汤特征图谱研究的色谱柱温为38℃。

7.2.5流速的考察

分别考察了流速为每分钟0.25mL、每分钟0.3mL、每分钟0.35mL对桃核承气汤特征图谱色谱行为的影响。除流速外，其他测试条件如7.1.1小节。结果如图54所示。

结果显示，不同流速对桃核承气汤特征图谱色谱行为存在一定的影响，综合考虑色谱峰分离度、柱压等情况，研究确定桃核承气汤特征图谱流动相流速为每分钟0.3mL。

7.2.6色谱条件的确定

根据以上实验，确定色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(WatersCORTECS T3柱，柱长150mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm)；以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸水溶液为流动相B，按表5的规定进行梯度洗脱；检测波长0-30分钟为220nm，30-45分钟为290nm，45-65分钟为260nm，柱温为38℃；流速为每分钟0.3mL。

7.3供试品溶液制备方法考察

7.3.1提取溶剂考察

分别考察了不同提取溶剂对桃核承气汤特征图谱的影响，选取20％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、100％甲醇作为提取溶剂，并比较不同提取溶剂特征图谱结果。

其中，供试品溶液制备方法为：取桃核承气汤冻干粉制剂(批号：S9)约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入20％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、100％甲醇10mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率45kHz)20分钟，取出，放冷，再称定重量，用相应的提取溶剂补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。

色谱条件为：以Waters CORTECS T3柱(1.6μm，150mm×2.1mm)为色谱柱，以甲醇为流动相A，0.2％磷酸为流动相B，按表5的规定进行梯度洗脱；柱温为38℃；流速为每分钟0.3mL；测试时间为0～30分钟时检测波长为220nm；测试时间为30～45分钟时，检测波长为290nm；测试时间为45～65分钟时，检测波长为260nm。

桃核承气汤特征图谱不同提取溶剂考察结果见表6。

表6桃核承气汤特征图谱提取溶剂考察结果表

实验结果：通过对比4种提取溶剂的特征图谱可发现，当提取溶剂为甲醇时，桂皮醛色谱不明显，当20％甲醇、50％甲醇、70％甲醇为提取溶剂时，桃核承气汤的特征图谱峰数一样，其中以70％甲醇为提取溶剂时，总峰面积/称样量较大，可充分表现桃核承气汤特征图谱，因此采用70％甲醇作为桃核承气汤特征图谱的提取溶剂。

7.3.2提取时间考察

考察不同提取时间对桃核承气汤特征图谱的影响，选取考察10分钟、20分钟、30分钟三个不同提取时间。

取桃核承气汤冻干粉制剂(批号：S9)约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入70％甲醇10mL，称定重量，分别取出，超声处理(功率250W，频率45kHz)10分钟、20分钟、30分钟，取出，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。

色谱条件：以Waters CORTECS T3柱(1.6μm，150mm×2.1mm)为色谱柱，以甲醇为流动相A，0.2％磷酸为流动相B，按表3的规定进行梯度洗脱；柱温为38℃；流速为每分钟0.3mL，检测波长0-30分钟为220nm，30-45分钟为290nm，45-65分钟为260nm。

桃核承气汤特征图谱不同提取溶剂考察结果见表7。

表7桃核承气汤特征图谱提取时间考察结果表

结果显示：通过对比不同提取时间对桃核承气汤特征图谱影响发现，超声提取10分钟、30分钟总峰面积/称样量比超声提取20分钟小，为保证桃核承气汤提取完全且成分不损失，选择超声提取20分钟。

7.3.3供试品溶液制备方法的确定

根据上述实验结果，桃核承气汤特征图谱样品前处理方法确定为：

取桃核承气汤冻干粉约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇10mL，超声处理(功率250W，频率45kHz)20分钟，取出，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得特征图谱供试品溶液。

7.4方法学验证

7.4.1专属性考察

分别取缺每味药物的桃核承气汤，按照供试品溶液的制备方法制备，得到缺每味药材的阴性样品溶液。

分别取桃仁、大黄、肉桂、甘草对照药材，按照对照药材参照物溶液的制备方法制备每味药材的对照药材参照物溶液。

取没食子酸对照品、儿茶素对照品、苦杏仁苷对照品、表儿茶素没食子酸酯对照品、甘草苷对照品、芹糖甘草苷对照品、甘草酸对照品、桂皮醛对照品、肉桂酸对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1mL含没食子酸15μg、儿茶素100μg、苦杏仁苷30μg、表儿茶素没食子酸酯50μg、甘草苷30μg、芹糖甘草苷70μg、甘草酸100μg、桂皮醛10μg、肉桂酸10μg、大黄酸20μg、大黄素10μg、大黄酚10μg的溶液，即得到到每种对照品的特征图谱对照品溶液。

将特征图谱供试品溶液、缺每味药材的阴性样品溶液、每味药材的对照药材参照物溶液、每种对照品的特征图谱对照品溶液各1μL注入液相色谱仪，按7.1.1小节的色谱条件进样分析，结果如图55～图58所示。

由图55～图58可知：检测出桃核承气汤制剂特征图谱15个共有色谱峰，其中1个峰(3号峰)来源于桃仁：10个峰(1、2、4、8、9、10、11、12、14和15号峰)来源于大黄，3个峰(2、7、8号峰)来源于肉桂，3个峰(5、6、13号峰)来源于甘草，0个峰来源于芒硝；1个峰(2号峰，儿茶素)为大黄和肉桂所共有，1个峰(8号峰，肉桂酸)为大黄、肉桂所共有；建立的特征图谱能反应来源于处方中除矿物药芒硝外的所有药味成分。

此外，从图55～58可以看出，供试品色谱在与对照品色谱相应保留时间处有相同的色谱峰，阴性无干扰，综上所述，说明该方法专属性良好。

7.4.2整体性考察

精密吸取桃核承气汤冻干粉制剂(批号：S9)的特征图谱供试品溶液1μL，注入超高液相色谱仪，按确定的色谱条件(7.1.1小节)测定，保持同一梯度，在梯度终点的流动相比例下延长洗脱一倍时间，分析特征图谱，未见滞后峰的出现，表明本发明方法整体性良好。

7.4.3精密度考察

取桃核承气汤冻干粉制剂(批号：S9)的特征图谱供试品溶液，按确定的色谱条件(7.1.1小节)重复进样6次，进样体积1μL，以表儿茶素没食子酸酯峰为参照峰，计算各共有特征峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算RSD值，同时采用中药色谱特征图谱相似度(2012年版)评价软件计算各个特征图谱的相似度，结果各共有特征峰相对保留时间的RSD为0.04％～0.39％，相对峰面积的RSD为0.12％～1.36％，相似度均为1.000，表明仪器精密度良好，实验结果见表8～表10。

表8桃核承气汤特征图谱精密度考察结果表(相对保留时间)

表9桃核承气汤特征图谱精密度考察结果表(相对峰面积)

表10桃核承气汤特征图谱精密度试验相似度分析结果

7.4.4稳定性考察

取桃核承气汤冻干粉制剂(批号：S9)的特征图谱供试品溶液，按确定的色谱条件(7.1.1小节)分别在0、3、6、9、12、15、18、21、24小时进样，进样体积1μL，以表儿茶素没食子酸酯峰为参照峰，计算各共有特征峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算RSD值，同时采用中药色谱特征图谱相似度(2012年版)评价软件计算各个特征图谱的相似度，结果各共有特征峰相对保留时间的RSD为.05％～0.43％，相对峰面积的RSD为0.80％～2.96％，相似度均为1.000，表明供试品溶液在24小时内稳定性良好，实验结果见表11～表13。

表11桃核承气汤特征图谱稳定性考察结果表(相对保留时间)

表12桃核承气汤特征图谱稳定性考察结果表(相对峰面积)

表13桃核承气汤特征图谱稳定性试验相似度分析结果

7.4.5重复性考察

取同一批桃核承气汤冻干粉制剂(批号：S9)约0.25g，精密称定，平行6份，按确定的方法制备特征图谱供试品溶液(7.1.3小节)，按确定的色谱条件(7.1.1小节)，分别进样1μL。以表儿茶素没食子酸酯峰为参照峰，计算各共有特征峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算RSD值，同时采用中药色谱特征图谱相似度(2012年版)评价软件计算各个特征图谱的相似度，结果各共有特征峰相对保留时间的RSD为0.00％～0.34％，相对峰面积的RSD为1.06％～3.95％，相似度均为1.000，表明该方法重复性良好。实验结果见表14～表16。

表14桃核承气汤特征图谱重复性考察结果表(相对保留时间)

表15桃核承气汤特征图谱重复性考察结果表(相对峰面积)

表16桃核承气汤特征图谱重复性试验相似度分析结果

7.5不同批次样品的测定及共有峰的确定

取20批次桃核承气汤对应实物，按确定的供试品溶液制备方法(7.1.3小节)，制得特征图谱供试品溶液，再按确定的色谱条件(7.1.1小节)，分别进样1μL，测定。以表儿茶素没食子酸酯峰为参照峰，计算各共有特征峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算RSD值，同时采用中药色谱特征图谱相似度(2012年版)评价软件计算各个特征图谱的相似度。结果见表17～19，色谱图见图59。

结果表明共有特征峰相对保留时间的RSD为0.00％～0.19％，因各批次样品共有特征峰对应成分含量存在一定的差异，各共有特征峰相对峰面积的RSD为0.00％～51.70％，偏差较大，20批次核承气汤制剂均特征图谱相似度范围为0.937～0.998，均大于0.9。对20批桃核承气汤制剂特征图谱进行分析，可确定15个共有特征峰。

表17 20批次桃核承气汤冻干粉制剂特征图谱相似度表

表18 20批桃核承气汤冻干粉制剂特征图谱相对保留时间结果

表19 20批桃核承气汤冻干粉制剂特征图谱相对峰面积结果

7.6特征图谱的化学成分试验研究

根据桃核承气汤方中各药味所含化学成分，采用高分辨质谱，对桃核承气汤所含化学成分进行指认。

质谱条件：Waters ACQUITY UPLCTM I-Class型超高效液相色谱仪；沃特世超高效液相飞行时间高分辨质谱联用系统(Xevo G2-XS QTOF MS)，数据处理系统为UNIFI 1.8工作站(Waters,Manchester,U.K.)；Waters Xselected HSS T3(柱长150mm，内径2.1mm，粒径2.5μm)色谱柱。氮气作为质谱离子源的雾化、锥孔气；电喷雾电离正离子模式；毛细管电压：2.0kV；锥孔电压：40V；离子源温度：120℃；脱溶剂气温度：450℃；脱溶剂气流速：800L/h；扫描时间：0.5s；扫描时间间隔：0.02s；质荷比范围：50～1200；数据采集模式：ESI(+)下采集MSE；以甲酸钠溶液校正质量轴，以亮氨酸脑啡肽(Leucine-enkephalin)为内标校正质量精度，锥孔气体流量：50L/h。

色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters Xselected HSS T3柱，柱长150mm，内径为2.1mm，粒径为2.5μm)；以甲醇流动相A，以水溶液水(含2mmol/L乙酸铵和0.05％甲酸)为流动相B，按表20中的规定进行梯度洗脱；柱温为40℃；流速为每分钟0.35mL；进样量1μl，波长260nm。

对照品溶液的制备：同7.1.2项；

供试品溶液的制备：同7.1.3项。

表20色谱指认研究梯度洗脱程序表

鉴定结果详见表21，色谱图见图60、图61。

表21桃核承气汤特征图谱成分指认结果

八、桃核承气汤中苦杏仁苷含量的测定方法

8.1测定方法

8.1.1色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长100mm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm)；以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸水溶液为流动相B，按表22的规定进行梯度洗脱；柱温为20℃；流速为每分钟0.4mL；检测波长为210nm。理论板数按苦杏仁苷峰计算应不低于10000。

表22桃核承气汤中苦杏仁苷含量测定用梯度洗脱表

8.1.2对照品溶液的制备

精密称取D-苦杏仁苷对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每1mL含苦杏仁苷0.1mg的溶液，即得苦杏仁苷对照品溶液。

8.1.3供试品溶液的制备

取桃核承气汤冻干粉制剂约0.5g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入70％甲醇25mL，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用相应的溶剂补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得苦杏仁苷供试品溶液。

8.1.4测定法

分别精密吸取苦杏仁苷对照品溶液与苦杏仁苷供试品溶液各2μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

8.2提取方法的选择

为了最大程度的提取D-苦杏仁苷指标成分，试验中比较了提取溶剂、提取方式、提取时间对提取率的影响。首先比较了不同提取溶剂50％甲醇、70％甲醇对提取率的影响，结果显示70％甲醇提取效率高，基线平，重现好，故选择70％甲醇作为提取溶剂；随后比较了不同提取方法：超声30min、回流30min对提取率的影响，结果显示加热回流结果较好，因此随后的试验均采用超声30min。最后比较了不同提取时间15min、30min、45min对提取率的影响，结果显示提取效率无显著性差异，为了提取完全选择提取30min。结果见表23。

表23桃核承气汤中苦杏仁苷含量测定提取方法考察表

8.3方法学验证

8.3.1专属性考察

取桃仁阴性样品按8.1.3小节的供试品制备方法制备苦杏仁苷阴性样品溶液，精密吸取苦杏仁苷阴性样品溶液、苦杏仁苷供试品溶液、苦杏仁苷对照品溶液各2μL注入液相色谱仪，按8.1.1小节的色谱条件测定，记录色谱图。结果见图62，阴性供试品溶液在与D-苦杏仁苷相应保留时间无色谱峰，说明组方中其他组份对D-苦杏仁苷的测定无干扰，该方法专属性良好。

8.3.2线性关系考察

精密称定D-苦杏仁苷对照品5.98mg，置10mL量瓶中，加70％甲醇制成每1mL含0.5131mg的苦杏仁苷对照品母液溶液。精密量取上述苦杏仁苷对照品母液0.25mL、0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、3mL分别置5mL量瓶中，加70％甲醇定容至刻度。精密吸取上述不同浓度苦杏仁苷对照品溶液2μL，按8.1.1小节的色谱条件测定，记录色谱图。以峰面积为纵坐标(y)，对照品的量为横坐标(x)，并绘制标准曲线，得到的线性回归方程为：y＝2437.35988x-0.5755418，相关系数r＝0.99982，表明在浓度为25.655μg/mL～307.86μg/mL的范围内D-苦杏仁苷浓度与峰面积线性关系良好。

8.3.3精密度考察

取同一桃核承气汤制剂的苦杏仁苷供试品溶液，重复进样6次，按8.1.1小节的色谱条件测定，记录峰面积，计算D-苦杏仁苷峰面积的RSD值。结果显示，D-苦杏仁苷峰面积的RSD值为0.23％，表明仪器精密度良好。

8.3.4重复性考察

取同一桃核承气汤冻干粉制剂平行样品6份，按照8.1.3小节的供试品制备方法制备苦杏仁苷供试品溶液，按8.1.3小节的色谱条件测定，计算D-苦杏仁苷含量RSD值。实验结果显示，D-苦杏仁苷含量RSD值为0.26％，表明本方法重复性良好。

8.3.5稳定性考察

取同一桃核承气汤冻干粉制剂按照8.1.3小节的供试品制备方法制备苦杏仁苷供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24小时进样，按8.1.3小节的色谱条件测定，计算D-苦杏仁苷含量RSD值。结果显示，D-苦杏仁苷峰面积的RSD值为0.40％，表明供试品在24h内具有良好的稳定性。

8.3.6准确度考察

精密称取已知含量的桃核承气汤冻干粉制剂共9份，按照苦杏仁苷供试品与苦杏仁苷对照品D-苦杏仁苷的含量比为1:0.5、1:1和1:1.5的比例加入苦杏仁苷对照品溶液，每种比例平行3份，制备9份待测苦杏仁苷供试品溶液，按8.1.3小节的色谱条件测定，计算D-苦杏仁苷的回收率范围及RSD值，结果见表24。结果D-杏仁苷的平均回收率为102.31％，RSD值为1.22％，符合药典规定，表明该方法准确度良好。

表24桃核承气汤中苦杏仁苷含量测定加样回收率结果(n＝9)

8.4样品测定

取不同批次(S1～S20)桃核承气汤冻干粉样品适量，分别按照8.1.3小节的方法制备苦杏仁苷供试品溶液。按8.1.1小节的色谱条件进行测定，分别进样，测定不同批次桃核承气汤下供试品溶液中D-苦杏仁苷的含量。结果如表25所示。

表25不同批次桃核承气汤D-苦杏仁苷含量测定结果

由上表看出，20批桃核承气汤中D-苦杏仁苷含量波动范围在0.324％～0.792％，均值为0.53％，SD为0.10％。按照苦杏仁苷含量均值的70％～130％计算的范围为0.37％～0.69％，故在大生产过程中，应控制桃核承气汤制剂中D-苦杏仁苷的含量为0.37～0.69％。

九、桃核承气汤中结合蒽醌含量的测定方法

9.1测定方法

具体的，先对桃核承气汤中总蒽醌含量进行测定，然后对游离蒽醌含量进行测定，则结合蒽醌含量＝总蒽醌含量-游离蒽醌含量。且总蒽醌含量测定方法与游离蒽醌含量测定方法均采用以下色谱条件：

9.1.1色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长150mm，内径为3mm，粒径为5μm)，以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按表26的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为每分钟0.8mL；检测波长为254nm。理论板数按大黄素峰计算应不低于3000。

表26桃核承气汤中总蒽醌/游离蒽醌含量测定用梯度洗脱表

9.1.2对照品溶液的制备

取芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含芦荟大黄素5μg、大黄酸25μg、大黄素8μg、大黄酚10μg、大黄素甲醚5μg的混合对照品溶液，即得蒽醌对照品溶液。

需要说明的是，总蒽醌含量测定方法与游离蒽醌含量测定方法均采用上述蒽醌对照品溶液。

9.1.3供试品溶液的制备

总蒽醌供试品溶液：取桃核承气汤冻干粉制剂约0.5g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，加热回流提取30分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液10mL，减压回收溶剂至干，加8％盐酸溶液10mL，超声处理2分钟，再加三氯甲烷10mL，加热回流1小时，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取4次，每次10mL，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得总蒽醌供试品溶液。

游离蒽醌供试品溶液：取桃核承气汤冻干粉制剂约0.5g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，加热回流30分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得游离蒽醌供试品溶液。

9.1.4测定法

分别精密吸取蒽醌对照品溶液与总蒽醌/游离蒽醌供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

9.2提取方法的选择

本发明中比较了提取方法、提取溶剂用量、提取时间以及总蒽醌酸化时间、提取次数对提取率的影响。首先比较了不同提取方式超声、回流对提取率的影响，结果显示对游离蒽醌提取效果影响不大，加热回流提取效果稍好，总蒽醌含量以加热回流提取效果较好，故选择加热回流作为提取方式；随后比较了提取溶剂用量：25mL、50mL对提取率的影响，结果显示提取效果差别不大，故选择用量为25mL。比较了不同提取时间30min、60min、90min对提取率的影响，结果显示加热回流提取30min、60min、90min的含量测定结果相差不大，在确保充分提取基础上，选取加热回流时间为30min。最后比较了总蒽醌酸化时间对提取率的影响，结果表明酸化时间60min，总蒽醌提取效果较好，故确定酸化时间为60min。结果见表27、表28。

表27桃核承气汤中游离蒽醌含量测定提取方法考察表

表28桃核承气汤中总蒽醌含量测定提取方法考察表

9.3方法学验证

9.3.1专属性考察

取大黄阴性样品按总蒽醌供试品溶液制备方法制备总蒽醌阴性样品溶液，取大黄阴性样品按游离蒽醌供试品溶液制备方法制备游离蒽醌阴性样品溶液。将游离蒽醌供试品溶液、总蒽醌供试品溶液、游离蒽醌阴性样品溶液、总蒽醌阴性样品溶液和蒽醌对照品溶液各10μL分别注入液相色谱仪，按9.1.1小节的色谱条件测定，记录色谱图。结果见图63、图64，阴性样品溶液在与蒽醌对照品相应保留时间无色谱峰，说明组方中其他组份对总蒽醌和游离蒽醌均无干扰，该方法专属性良好。

9.3.2线性关系考察

精密称定芦荟大黄素对照品1.067mg，置10mL量瓶中，加甲醇制成每1mL含芦荟大黄素0.1067mg的对照品母液溶液，精密量取上述对照品母液0.2mL、0.4mL、0.8mL、1.2mL、1.6mL、2mL分别置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成浓度分别为2.134μg/mL、4.268μg/mL、8.536μg/mL、12.804μg/mL、17.072μg/mL、21.34μg/mL的对照品溶液；

精密测定大黄酸对照品2.680mg，置50mL量瓶中，加甲醇制成每1mL含大黄酸53.22μg的对照品母液溶液，精密量取上述对照品母液0.5mL、1mL、3mL、5mL、7mL、10mL分别置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成浓度分别为2.661μg/mL、5.322μg/mL、15.966μg/mL、26.61μg/mL、37.254μg/mL、53.22μg/mL的对照品溶液；

精密称定大黄素对照品1.646mg，置10mL量瓶中，加甲醇制成每1mL含大黄素0.1625mg的对照品母液溶液，精密量取上述对照品母液0.1mL、0.3mL、0.5mL、1mL、1.2mL分别置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成浓度分别为1.625μg/mL、4.875μg/mL、8.125μg/mL、16.250μg/mL、19.500μg/mL的对照品溶液；

精密称定大黄酚对照品2.161mg，置20mL量瓶中，加甲醇制成每1mL含大黄酚0.1067mg的对照品母液溶液，精密量取上述对照品母液0.1mL、0.5mL、1.5mL、2.5mL、3.5mL、5mL置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成浓度分别为1.067μg/mL、5.335μg/mL、16.14μg/mL、26.90μg/mL、37.66μg/mL、53.80μg/mL的对照品溶液；

精密称定大黄素甲醚对照品1.245mg，置50mL量瓶中，加甲醇制成每1mL含大黄素甲醚24.50μg的对照品母液溶液，精密量取上述对照品母液0.5mL、1mL、2mL、3mL、4mL置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成浓度分别为1.225μg/mL、2.45μg/mL、4.90μg/mL、7.35μg/mL、9.80μg/mL的对照品溶液；

精密吸取上述不同浓度对照品溶液10μL，按上述色谱条件测定，记录色谱图。以峰面积为纵坐标(y)，对照品的量为横坐标(x)，计算得到线性回归方程。

其中，芦荟大黄素的回归方程为：y＝6528.35161x+17.90069，相关系数r＝0.99982，表明在浓度为2.134μg/mL～21.34μg/mL的范围内芦荟大黄素浓度与峰面积线性关系良好。

大黄酸的回归方程为：y＝5171.40861x-9.1942674，相关系数r＝0.99978，表明在浓度为2.661μg/mL～53.22μg/mL的范围内大黄酸浓度与峰面积线性关系良好。

大黄素的回归方程为：y＝4589.01902x-11.475433，相关系数r＝0.99981，表明在浓度为1.625μg/mL～19.5μg/mL的范围内大黄素浓度与峰面积线性关系良好。

大黄酚的回归方程为：y＝6491.94367x+17.096169，相关系数r＝0.99993，表明在浓度为1.067μg/mL～53.8μg/mL的范围内大黄酚浓度与峰面积线性关系良好。

大黄素甲醚的回归方程为：y＝4396.43555x+1.7626255，相关系数r＝0.99993，表明在浓度为1.225μg/mL～9.800μg/mL的范围内大黄素甲醚浓度与峰面积线性关系良好。

9.3.3精密度考察

取同一批次桃核承气汤冻干粉制剂的总蒽醌供试品溶液、游离蒽醌供试品溶液，重复进样6次，按9.1.1小节的色谱条件测定，记录峰面积，计算各蒽醌峰面积RSD值。结果显示，各指标成分峰面积RSD值均小于3.0％，表明仪器精密度良好。结果见表31和表32。

9.3.4重复性考察

取同一桃核承气汤制剂平行样品6份，按照9.1.3小节的供试品制备方法制得总蒽醌供试品溶液、游离蒽醌供试品溶液，按9.1.1小节的色谱条件测定，计算各蒽醌峰面积RSD值，各指标成分峰面积RSD值均小于3.0％，表明本方法重复性良好。结果见表31和表32。

9.3.5中间精密度考察

选择不同的测定时间、不同的高效液相色谱仪、不同实验人员(人员2)，取同一批次桃核承气汤冻干粉，平行6份，制备总蒽醌/游离蒽醌供试品溶液。按9.1.1小节色谱条件进行测定，分别进样，测定供试品溶液中总蒽醌和游离蒽醌含量。结果见表29和表30。实验结果表明，不同分析人员在不同日期和不同色谱仪下操作，总蒽醌和游离蒽醌含量RSD分别为2.48％和2.09％，该分析方法中间精密度较好。

表29桃核承气汤总蒽醌含量测定中间精密度考察结果

表30桃核承气汤游离蒽醌含量测定中间精密度考察结果

9.3.6稳定性考察

取同一桃核承气汤冻干粉制剂的总蒽醌供试品溶液、游离蒽醌供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24h后进样，按9.1.1小节的色谱条件测定，记录峰面积，计算各蒽醌峰面积RSD值。结果表明：各指标成分峰面积RSD值均小于3.0％，表明供试品在24h内具有良好的稳定性。

9.3.7准确度试验

精密称取已知含量的桃核承气汤冻干粉制剂共9份，按照总蒽醌供试品溶液、游离蒽醌供试品溶液与蒽醌对照品的含量比为1:0.5、1:1和1:1.5的比例加入蒽醌对照品溶液，每种比例平行3份，制备9份待测总蒽醌供试品溶液、游离蒽醌供试品溶液，按9.1.1节的色谱条件测定，计算各指标成分的平均加样回收率及RSD值。结果各指标成分的平均回收率、RSD值均符合药典规定范围，表明该方法准确度良好。结果见表31和表32。

表31桃核承气汤总蒽醌含量测定方法学验证结果汇总表

表32桃核承气汤游离蒽醌含量测定方法学验证结果汇总表

9.4样品测定

取不同批次(S1～S20)桃核承气汤适量，分别制备游离蒽醌/总蒽醌供试品溶液；按9.1.1小节的色谱条件进行测定，分别进样，测定不同批次桃核承气汤下供试品溶液中总蒽醌、游离蒽醌和结合蒽醌的含量。结果如表33所示。

表33不同批次桃核承气汤总蒽醌、游离蒽醌、结合蒽醌含量测定结果

由表中可以看出，20批桃核承气汤结合蒽醌含量波动范围在0.189％～0.607％，均值为0.377％，SD为0.13％；按照结合蒽醌含量均值的70％～130％计算的范围为0.26％～0.49％；按照结合蒽醌含量均值±3倍SD计算的范围为0％～0.77％。多批次样品结合蒽醌数据中，20批均落在均值±3倍SD范围内，13批次数据落在均值的70％～130％范围内。按均值的70％～130％计算的范围较窄，拟适当将上限值定为均值+3SD；拟定桃核承气汤结合蒽醌含量范围为按照均值的70％～+3SD计算的0.26％～0.77％；故在大生产过程中，应控制桃核承气汤中结合蒽醌的含量范围为0.26％～0.77％。

十、桃核承气汤中肉桂酸、桂皮醛含量的测定方法

10.1测定方法

10.1.1色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸溶液为流动相B，按表34的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为每分钟0.8mL；检测波长为285nm。理论板数按桂皮醛峰计算应不低于3000。

表34桃核承气汤中肉桂酸、硅皮醛含量测定用梯度洗脱表

10.1.2对照品溶液的制备

取肉桂酸、桂皮醛对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1mL含肉桂酸对照品20μg、含桂皮醛对照品15μg的混合溶液，即得肉桂对照品溶液。

10.1.3供试品溶液的制备

取桃核承气汤冻干粉制剂约0.5g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入70％甲醇10mL，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用相应的溶剂补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得肉桂供试品溶液。

10.1.4测定法

分别精密吸取肉桂对照品溶液和肉桂供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

10.2提取方法的选择

为了最大程度的提取肉桂酸、桂皮醛指标成分，试验中比较了提取溶剂、提取方式、提取时间以及提取溶剂用量对提取率的影响。首先比较了不同提取溶剂25％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、100％甲醇对提取率的影响，结果显示70％甲醇提取效率高，故选择70％甲醇作为提取溶剂；随后比较了不同提取方式：超声30min、回流30min对提取率的影响，结果显示对提取效果结果无明显影响，故采用超声30min。比较了不同提取时间15min、30min、45min对提取率的影响，结果显示提取效率无显著性差异，为了提取完全故选择提取30min。最后比较了不同提取溶剂用量10mL、25mL对提取率的影响，结果显示提取效率相差不大，故选择提取溶剂用量10mL。结果见表35。

表35桃核承气汤中肉桂酸/桂皮醛含量测定提取方法考察表

10.3方法学验证

10.3.1专属性考察

取肉桂阴性样品按上述供试品制备方法制备肉桂阴性样品溶液，精密吸取肉桂阴性样品溶液、肉桂供试品溶液、肉桂对照品溶液各10μL，按10.1.1小节的色谱条件测定，记录色谱图(图65)。结果显示，阴性供试品溶液在肉桂酸对照品、桂皮醛对照品的相应保留时间无色谱峰，说明组方中其他组份对肉桂酸和桂皮醛均无干扰，该方法专属性良好。

10.3.2线性关系考察

精密称定肉桂酸对照品10.680mg，置50mL量瓶中，加甲醇制成每1mL含0.2136mg的对照品母液溶液。精密量取上述肉桂酸对照品母液0.1mL、0.3mL、0.5mL、0.7mL、1mL、1.2mL分别置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制成浓度分别为2.136μg/mL、6.408μg/mL、10.68μg/mL、14.952μg/mL、21.36μg/mL、25.632μg/mL的对照品溶液。精密称定桂皮醛对照品13.360mg，置50mL量瓶中，加甲醇制成每1mL含0.2637mg的对照品母液溶液。精密量取上述桂皮醛对照品母液0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL分别置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制成浓度分别为2.637μg/mL、5.274μg/mL、7.911μg/mL、10.548μg/mL、13.185μg/mL、15.822μg/mL的对照品溶液。精密吸取上述不同浓度对照品溶液10μL，按10.1.1小节的色谱条件测定。以峰面积为纵坐标(y)，对照品的量为横坐标(x)，计算得到线性回归方程。

其中，肉桂酸的线性回归方程为：y＝9337.65226x+17.5192，相关系数r＝0.99992，表明在浓度为2.136μg/mL～25.632μg/mL的范围内肉桂酸浓度与峰面积线性关系良好。

桂皮醛的线性回归方程为：y＝13700.2531x-4.2173822，相关系数r＝0.99991，表明在浓度为2.637μg/mL～15.822μg/mL的范围内桂皮醛浓度与峰面积线性关系良好。

10.3.3精密度考察

取同一桃核承气汤冻干粉制剂的肉桂供试品溶液，重复进样6次，按10.1.1小节的色谱条件测定，记录峰面积。计算肉桂酸峰面积RSD值为0.11％，桂皮醛峰面积RSD值为0.34％，表明仪器精密度良好。

10.3.4稳定性考察

取同一桃核承气汤冻干粉制剂的肉桂供试品溶液，分别在0、3、6、9、12、15、18、21、24h后进样，按10.1.1小节的色谱条件测定，记录峰面积。计算肉桂酸峰面积RSD值为0.36％，桂皮醛峰面积RSD值为0.75％，表明供试品在24h内具有良好的稳定性。

10.3.5重复性考察

取同一桃核承气汤冻干粉制剂平行样品6份，按照10.1.3小节的供试品制备方法制备肉桂供试品溶液，按10.1.1小节的色谱条件测定，计算肉桂酸含量RSD值为0.59％，桂皮醛含量RSD值为1.20％，表明本方法重复性良好。

10.3.6中间精密度考察

选择不同的测定时间、不同的高效液相色谱仪、不同实验人员(人员2)，取同一批次桃核承气汤冻干粉制剂，平行6份，制备肉桂供试品溶液。按10.1.1小节的色谱条件进行测定，分别进样，测定肉桂供试品溶液中肉桂酸和桂皮醛含量，与重复性项下结果比较。

实验结果表明，不同分析人员在不同日期和不同色谱仪下操作，肉桂酸和桂皮醛含量RSD分别为0.59％和1.14％，该分析方法中间精密度较好。结果见表36和表37。

表36桃核承气汤肉桂酸含量测定中间精密度考察结果

表37桃核承气汤桂皮醛含量测定中间精密度考察结果

10.3.7准确度试验

精密称取已知含量的桃核承气汤冻干粉制剂共9份，按照肉桂供试品溶液与肉桂酸对照品以及桂皮醛对照品的含量比为1:0.5、1:1和1:1.5的比例加入肉桂酸/桂皮醛对照品溶液，每种比例平行3份，制备9份待测供试品溶液，按10.1.1小节的色谱条件测定，计算肉桂酸的平均加样回收率为99.19％，RSD值为0.80％，桂皮醛的平均加样回收率为92.54％，RSD值为1.73％。结果肉桂酸、桂皮醛的平均回收率、RSD值均符合药典规定范围，表明该方法准确度良好。结果见表38、表39。

表38桃核承气汤中肉桂酸含量测定加样回收率结果(n＝9)

表39桃核承气汤中桂皮醛含量测定加样回收率结果(n＝9)

10.4样品测定

取不同批次(S1～S20)桃核承气汤适量，分别制备肉桂供试品溶液；按10.1.1小节的色谱条件进行测定，分别进样，测定不同批次桃核承气汤下供试品溶液中肉桂酸、桂皮醛的含量。结果如表40所示。

表40不同批次桃核承气汤中肉桂酸、桂皮醛含量测定结果

由表中可以看出，20批桃核承气汤中肉桂酸含量波动范围在0.045％～0.103％，均值为0.07％，SD为0.02％；按照肉桂酸含量均值的70％～130％计算的范围为0.05％～0.10％；按照肉桂酸含量均值±3倍SD计算的范围为0.03％～0.12％。多批次样品肉桂酸数据中，20批均落在均值±3倍SD范围内，18批次数据落在均值的70％～130％范围内，2批含量略低于均值±30％下限，无明显异常值。按均值的70％～130％计算的范围较窄，拟适当将上限值定为均值+3SD；拟定桃核承气汤肉桂酸含量范围为按照均值的70％～+3SD计算的0.05％～0.12％。即在大生产过程中，应控制桃核承气汤中肉桂酸的含量范围为0.05％～0.12％

由表中可以看出，20批桃核承气汤中桂皮醛含量波动范围在0.031％～0.115％，均值为0.05％，SD为0.02％；按照桂皮醛含量均值的70％～130％计算的范围为0.04％～0.07％；按照出膏均值±3倍SD计算的范围为0.00％～0.11％。多批次样品桂皮醛数据中，19批次均落在均值±3倍SD范围内，14批次数据落在均值的70％～130％范围内，无明显异常值。有5批(批次序号：5、6、10、12、14)含量略低于均值±30％下限，1批(批次序号：13)含量高于均值±30％和±3倍SD的上限；按均值的70％～130％计算的范围较窄，宜将上限值定为均值+3SD；拟定桃核承气汤桂皮醛含量范围为按照均值的70％～+3SD计算的0.04％～0.11％。即在大生产过程中，应控制桃核承气汤中桂皮醛的含量范围为0.04％～0.11％。

十一、桃核承气汤中甘草酸含量的测定方法

11.1测定方法

11.1.1色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05％磷酸溶液为流动相B，按表41的规定进行梯度洗脱；柱温为25℃；流速为每分钟0.8mL；检测波长为250nm。理论板数按甘草酸峰计算应不低于5000。

表41桃核承气汤中甘草酸含量测定用梯度洗脱表

11.1.2对照品溶液的制备

取甘草酸铵对照品适量，精密称定，加70％乙醇制成每1mL含甘草酸铵0.1mg的溶液，即得甘草酸对照品溶液(甘草酸重量＝甘草酸铵重量/1.0207)。

11.1.3供试品溶液的制备

取桃核承气汤冻干粉制剂约0.25g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入70％乙醇10mL，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用相应的溶剂补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得甘草酸供试品溶液。

11.1.4测定法

分别精密吸取甘草酸对照品溶液与甘草酸供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

11.2提取方法的选择

为了最大程度的提取甘草酸指标成分，试验中比较了提取溶剂、提取方式、提取时间以及提取溶剂用量对提取率的影响。首先比较了不同提取溶剂50％乙醇、70％乙醇、乙醇对提取率的影响，结果显示70％乙醇提取效率较高，故选择70％乙醇作为提取溶剂；随后比较了不同提取方式：超声30min、回流30min对提取率的影响，结果显示对提取效果结果影响不大，故采用超声30min。比较了不同提取时间15min、30min、45min对提取率的影响，结果显示提取效率无显著性差异，为了提取完全故选择提取30min。最后比较了不同提取溶剂用量10mL、25mL、50mL对提取率的影响，结果显示提取效率相差不大，故选择提取溶剂用量10mL。结果见表42。

表42桃核承气汤中甘草酸含量测定提取方法考察表

11.3方法学验证

11.3.1专属性考察

取甘草阴性样品按11.1.3节的供试品制备方法制备甘草酸阴性样品溶液，精密吸取阴性样品溶液、甘草酸供试品溶液、甘草酸对照品溶液各10μL，按11.1.1小节的色谱条件测定，记录色谱图，结果见图66。结果显示，阴性供试品溶液在甘草酸对照品的相应保留时间无色谱峰，说明组方中其他组份对甘草酸无干扰，该方法专属性良好。

11.3.2线性关系考察

精密称定甘草酸铵对照品8.150mg，置25mL量瓶中，加70％乙醇制成每1mL含0.3035mg的对照品母液，作为对照品母液(甘草酸重量＝甘草酸铵重量/1.0207)。精密量取上述甘草酸对照品母液0.4mL、0.8mL、1.6mL、2.5mL、3.5mL、4mL分别置5mL量瓶中，加70％乙醇至刻度，制成浓度分别为23.79μg/mL、47.58μg/mL、95.15μg/mL、148.67μg/mL、208.14μg/mL、237.88μg/mL的对照品溶液。精密吸取上述不同浓度对照品溶液10μL，按11.1.1小节的色谱条件测定，以峰面积为纵坐标(y)，对照品的量为横坐标(x)，并绘制标准曲线。计算得到线性回归方程为：y＝1052.40661x-6.0266357，相关系数r＝0.99997，表明在浓度为23.79μg/mL～237.88μg/mL的范围内甘草酸浓度与峰面积线性关系良好。

11.3.3精密度考察

取同一桃核承气汤冻干粉制剂的甘草酸供试品溶液，重复进样6次，按11.1.1小节的色谱条件测定，记录峰面积。计算甘草酸峰面积RSD值为0.26％，表明仪器精密度良好。

11.3.4稳定性考察

取同一桃核承气汤冻干粉制剂的甘草酸供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24后进样，按11.1.1小节的色谱条件测定，记录峰面积。计算甘草酸峰面积RSD值为0.28％，表明供试品在24h内具有良好的稳定性。

11.3.5重复性考察

取同一桃核承气汤冻干粉制剂平行样品6份，按照11.1.3小节的供试品制备方法制得甘草酸供试品溶液，按11.1.1小节的色谱条件测定，计算甘草酸含量RSD值为0.26％，表明本方法重复性良好。

11.3.6中间精密度考察

选择不同的测定时间、不同的高效液相色谱仪、不同实验人员(人员2)，取同一批次桃核承气汤冻干粉制剂，平行6份，制备甘草酸供试品溶液。按11.1.1小节的色谱条件进行测定，分别进样，测定甘草酸供试品溶液中甘草酸含量，与重复性项下结果比较。

实验结果表明，不同分析人员在不同日期和不同色谱仪下操作，甘草酸含量RSD分别为0.74％，该分析方法中间精密度较好。结果见表43。

表43桃核承气汤甘草酸含量测定中间精密度考察结果

11.3.7准确度试验

精密称取已知含量的桃核承气汤制剂共9份，按照甘草酸供试品溶液与甘草酸对照品的含量比为1:0.5,1:1和1:1.5的比例加入甘草酸对照品溶液，每种比例平行3份，制备9份待测甘草酸供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算甘草酸的平均加样回收率为100.63％，RSD值为1.31％，符合药典规定范围，表明该方法准确度良好。结果见表44。

表44桃核承气汤中甘草酸含量测定加样回收率结果(n＝9)

11.4样品测定

取不同批次(S1～S20)桃核承气汤适量，分别制备甘草酸供试品溶液；按11.1.1小节的色谱条件进行测定，分别进样，测定不同批次桃核承气汤下供试品溶液中甘草酸的含量。结果如表45所示。

表45不同批次桃核承气汤中甘草酸含量测定结果

20批桃核承气汤甘草酸含量波动范围在0.571％～1.126％，均值为0.79％，SD为0.14％；按照甘草酸含量均值的70％～130％计算的范围为0.55％～1.03％；按照甘草酸含量均值±3倍SD计算的范围为0.38％～1.20％。多批次样品甘草酸数据中，有1批值略超出均值±30％范围上限，为保留高含量值，拟适当将上限值定为均值+3SD；拟定桃核承气汤甘草酸含量范围为按照均值的70％～+3SD计算的0.55％～1.20％。即在大生产过程中，应控制桃核承气汤中甘草酸的含量为0.55％～1.20％。

以上所述是发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims (43)

1.一种桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述桃核承气汤由以下组分组成：桃仁、大黄、肉桂、甘草和芒硝；所述建立方法包括：

(1)采用薄层色谱法对桃仁、大黄、肉桂、甘草进行鉴别，采用理化鉴别法对芒硝进行鉴别；

(2)构建特征图谱对桃核承气汤中的成分进行鉴别；

(3)采用高效液相色谱法对桃核承气汤中的D-苦杏仁苷含量、总蒽醌含量、游离蒽醌含量、肉桂酸含量、桂皮醛含量、甘草酸含量进行测定，并计算结合蒽醌含量；其中，结合蒽醌含量＝总蒽醌含量-游离蒽醌含量。

2.如权利要求1所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述桃仁的薄层色谱鉴别方法为：

(1)取桃核承气汤制剂，加乙醚提取后，用三氯甲烷溶解，即得桃仁薄层供试品溶液；

(2)取桃仁对照药材，加乙醚提取后，用三氯甲烷溶解，即得桃仁薄层对照药材溶液；

(3)分别吸取桃仁薄层供试品溶液、桃仁薄层对照药材溶液，点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚和乙酸乙酯的混合溶液为展开剂，展开后喷以硫酸乙醇溶液，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

3.如权利要求2所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述桃仁的薄层色谱鉴别方法为：

(1)取桃核承气汤制剂0.2～1g，加30～50mL乙醚，加热回流提取1～2h，滤过，滤液挥干，残渣加三氯甲烷0.5～2mL溶解，即得桃仁薄层供试品溶液；

(2)取桃仁对照药材1～2g，加水100～200mL，加热煮沸30～60分钟，滤过，滤液浓缩至15～30mL，用乙醚振摇提取1～3次，每次15～30mL，合并乙醚液，挥干，残渣加三氯甲烷0.5～2mL使溶解，即得桃仁薄层对照药材溶液；

(3)分别吸取桃仁薄层供试品溶液、桃仁薄层对照药材溶液各5～10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为8.5：1的石油醚、乙酸乙酯混合溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在100～110℃加热至斑点显色清晰，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

4.如权利要求1所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述大黄的薄层色谱鉴别方法为：

(1)取桃核承气汤制剂0.1～0.5g，加甲醇10～50mL，超声处理30～60分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10～50mL使溶解，再加盐酸1～5mL，加热回流30～60分钟，立即冷却，用乙醚振摇提取1～3次，每次10～50mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲烷1～5mL使溶解，作为大黄薄层供试品溶液；

(2)取大黄对照药材0.1～0.5g，加水100～500mL，加热煮沸30～60分钟，滤过，滤液浓缩至约10～15mL，再加盐酸1～5mL，加热回流30～60分钟，立即冷却，用乙醚振摇提取1～3次，每次10～50mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲烷1～5mL使溶解，即得大黄薄层对照药材溶液；再取大黄素、大黄酚、大黄酸、芦荟大黄素、大黄素甲醚对照品，加甲醇制成每1mL各含0.1mg的混合溶液，作为大黄薄层对照品溶液；

(3)分别吸取上述大黄薄层供试品溶液、大黄薄层对照药材溶液、大黄薄层对照品溶液各5～10μL，分别点于同一硅胶H薄层板上，以体积比为15:5:1的石油醚、甲酸乙酯和甲酸的混合溶液的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；置氨蒸气中熏后，斑点变为红色。

5.如权利要求1所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述肉桂的薄层色谱鉴别方法为：

(1)取桃核承气汤制剂，加甲醇提取后残渣加水溶解，再用乙酸乙酯提取，提取后残渣加甲醇溶解，即得肉桂薄层供试品溶液；

(2)取肉桂对照药材，加乙酸乙酯提取后用甲醇溶解，即得肉桂薄层对照药材溶液；再取肉桂酸对照品，加甲醇溶解，制成肉桂薄层对照品溶液；

(3)分别吸取肉桂薄层供试品溶液、肉桂薄层对照药材溶液和肉桂薄层对照品溶液，点于同一硅胶GF₂₅₄板上，以石油醚、正己烷、甲酸乙酯和甲酸的混合溶液为展开剂，展开；供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

6.如权利要求5所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述肉桂的薄层色谱鉴别方法为：

(1)取桃核承气汤制剂0.5～1g，研细，加甲醇30～60mL，超声处理30～60分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20～50mL使溶解，用乙酸乙酯振摇提取1～3次，每次20～40mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇2～5mL使溶解，即得肉桂薄层供试品溶液；

(2)取肉桂对照药材0.5～2g，加水50～200mL，微沸30～60分钟，滤过，滤液浓缩至约10～25mL，用乙酸乙酯振摇提取1～3次，每次20～40mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1～5mL使溶解，即得肉桂薄层对照药材溶液；再取肉桂酸对照品，加甲醇制成每1mL各含0.3～1mg的溶液，即得肉桂薄层对照品溶液；

(3)分别吸取肉桂薄层供试品溶液、肉桂薄层对照药材溶液、肉桂薄层对照品溶液各1～10μL，分别点于同一硅胶GF₂₅₄板上，以体积比为10:30:15:1的石油醚、正己烷、甲酸乙酯和甲酸的混合溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

7.如权利要求1所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述甘草的薄层色谱鉴别方法为：

(1)取桃核承气汤制剂0.2～0.5g，研细，加甲醇20～50mL，超声处理30～60分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水15～30mL使溶解，用正丁醇振摇提取1～3次，每次20～50mL，合并正丁醇液，用水洗1～3次，每次20～50mL，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1～3mL使溶解，即得甘草薄层供试品溶液；

(2)取甘草对照药材0.3～0.5g，加水50～100mL，加热煮沸30～60分钟，滤过，滤液用正丁醇振摇提取1～3次，每次20～50mL，合并正丁醇液，用水洗1～3次，每次20～50mL，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1～3mL使溶解，即得甘草薄层对照药材溶液；再取甘草苷、芹糖甘草苷对照品，加甲醇制成每1mL各含0.2～1mg的混合溶液，即得甘草薄层对照品溶液；

(3)分别吸取甘草薄层供试品溶液、甘草薄层对照药材溶液、甘草薄层对照品溶液各1～5μL，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以体积比为15:1:1:2的乙酸乙酯、甲酸、冰乙酸和水的混合溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在100～110℃加热至斑点显色清晰，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

8.如权利要求1所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述芒硝的理化鉴别法为：

取桃核承气汤制剂0.1～0.5g，研细，置坩埚中，缓缓炽热至完全炭化后，置500～600℃炽灼2～2.5小时，放冷，残渣加水5mL，搅拌，滤过，取滤液2mL，加稀醋酸至溶液呈中性后，加95％乙醇4滴，加醋酸氧铀锌试液1mL，搅拌1～3分钟，静置，产生黄色沉淀；另取滤液2mL，加氯化钡试液1滴，即生成白色沉淀，沉淀在盐酸和硝酸中均不溶解。

9.如权利要求1所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述桃核承气汤特征图谱的构建方法为：

(1)分别取没食子酸对照品、儿茶素对照品、苦杏仁苷对照品、表儿茶素没食子酸酯对照品、甘草苷对照品、芹糖甘草苷对照品、桂皮醛对照品、肉桂酸对照品、大黄酚-1-O-葡萄糖苷对照品、大黄酚-8-O-葡萄糖苷对照品、大黄素-8-O-葡萄糖苷对照品、大黄酸对照品、甘草酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品适量，加入溶剂溶解或提取，制得特征图谱对照品溶液；

(2)取桃核承气汤制剂，加提取溶剂提取，制得特征图谱供试品溶液；

(3)取预设量的特征图谱对照品溶液和特征图谱供试品溶液，注入液相色谱仪，所述液相色谱仪以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，构建桃核承气汤的特征图谱。

10.如权利要求9所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述梯度洗脱按下述程序进行：

0～5min，流动相A从1％→8％，流动相B从99％→92％；

5～21min，流动相A从8％→23％，流动相B从92％→77％；

21～35min，流动相A从23％→31％，流动相B从77％→69％；

35～45min，流动相A从31％→55％，流动相B从69％→45％；

45～51min，流动相A从55％→65％，流动相B从45％→35％；

51～56min，流动相A从65％→83％，流动相B从35％→17％；

56～65min，流动相A从83％→100％，流动相B从17％→0％。

11.如权利要求10所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，步骤(3)中，分别吸取特征图谱对照品溶液和特征图谱供试品溶液各1～3μL，注入液相色谱仪进行检测，其中，所述液相色谱仪以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm，柱温为30～38℃；所述液相色谱仪以甲醇为流动相A，以0.15％～0.25％的磷酸水溶液为流动相B，流速为0.25～0.36mL/min，检测波长为220～290nm。

12.如权利要求11所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，步骤(3)中，分别吸取特征图谱对照品溶液和特征图谱供试品溶液各1μL，注入液相色谱仪进行检测，其中，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm，柱温为38℃；所述液相色谱仪以甲醇为流动相A，以0.2％的磷酸水溶液为流动相B，流速为0.3mL/min。

13.如权利要求11所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，步骤(3)中，检测时间为0～30分钟时，检测波长为220nm；检测时间为30～45分钟时，检测波长为290nm，检测时间为45～65分钟时，检测波长为260nm。

14.如权利要求9所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，步骤(1)中，分别取没食子酸对照品、儿茶素对照品、苦杏仁苷对照品、表儿茶素没食子酸酯对照品、甘草苷对照品、芹糖甘草苷对照品、桂皮醛对照品、肉桂酸对照品、大黄酚-1-O-葡萄糖苷对照品、大黄酚-8-O-葡萄糖苷对照品、大黄素-8-O-葡萄糖苷对照品、大黄酸对照品、甘草酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品适量，分别加甲醇制成每1mL含没食子酸15μg、儿茶素100μg、苦杏仁苷30μg、表儿茶素没食子酸酯50μg、甘草苷30μg、芹糖甘草苷70μg、桂皮醛10μg、肉桂酸10μg、大黄酚-1-O-葡萄糖苷30μg、大黄酚-8-O-葡萄糖苷40μg、大黄素-8-O-葡萄糖苷50μg、大黄酸20μg、甘草酸100μg、大黄素10μg、大黄酚10μg的溶液，即得特征图谱对照品溶液。

15.如权利要求9所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，步骤(2)中，所述提取溶剂为20～100％甲醇，提取时间为10～30min，提取方式为超声提取。

16.如权利要求15所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，步骤(2)包括：

取桃核承气汤冻干粉0.15～0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇10mL，称定重量，分别取出，采用功率为200～300W，频率为40～50kHz的超声波处理20min，取出，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得特征图谱供试品溶液。

17.如权利要求9所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述桃核承气汤的特征图谱包括15个特征峰；其中，峰1为没食子酸峰，峰2为儿茶素峰，峰3为苦杏仁苷峰，峰4为表儿茶素没食子酸酯峰，峰5为甘草苷峰，峰6为芹糖甘草苷峰，峰7为桂皮醛峰，峰8为肉桂酸峰，峰9为大黄酚-1-O-葡萄糖苷峰，峰10为大黄酚-8-O-葡萄糖苷峰，峰11为大黄素-8-O-葡萄糖苷峰，峰12为大黄酸峰，峰13为甘草酸峰，峰14为大黄素峰，峰15为大黄酚峰。

18.如权利要求1所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述D-苦杏仁苷含量的测定方法为：

(1)取D-苦杏仁苷对照品，加甲醇制成每1mL含D-苦杏仁苷0.1～1mg的溶液，即得苦杏仁苷对照品溶液；

(2)取桃核承气汤制剂，加入提取溶剂提取，制得苦杏仁苷供试品溶液；

(3)吸取苦杏仁苷对照品溶液、苦杏仁苷供试品溶液，注入液相色谱仪，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，所述液相色谱仪以乙腈为流动相A，磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，测定得到桃核承气汤中D-苦杏仁苷的含量。

19.如权利要求18所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述D-苦杏仁苷含量的测定方法按照以下洗脱程序进行：

0～10min，流动相A为3％，流动相B为97％；

10～12min，流动相A从3％→4％，流动相B从97％→96％；

12～40min，流动相A为4％，流动相B为96％；

40～45min，流动相A从4％→100％，流动相B从96％→0％。

20.如权利要求18所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述D-苦杏仁苷含量的测定方法中，所述提取溶剂为50～70％甲醇，提取时间为30～45min，提取方式为超声提取。

21.如权利要求19所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述D-苦杏仁苷含量的测定方法中，所述苦杏仁苷供试品溶液的制备方法为：

取桃核承气汤制剂0.4～1g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入70％甲醇25～50mL，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。

22.如权利要求19所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述D-苦杏仁苷含量的测定方法中，分别吸取苦杏仁苷对照品溶液、苦杏仁苷供试品溶液各1～3μL，注入液相色谱仪进行检测，其中，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其柱长100mm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm，柱温为18～22℃；所述液相色谱仪以乙腈为流动相A，以0.2％的磷酸水溶液为流动相B，流速为0.38～0.42mL/min，检测波长为200～220nm。

23.如权利要求1所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述总蒽醌含量的测定方法为：

(1)取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚适量，加甲醇制成混合溶液，制得蒽醌对照品溶液；

(2)取桃核承气汤制剂，利用甲醇提取，制得总蒽醌供试品溶液；

(3)吸取蒽醌对照品溶液和总蒽醌供试品溶液，注入液相色谱仪，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，测定得到桃核承气汤中总蒽醌含量。

24.如权利要求1所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述游离蒽醌含量的测定方法为：

(1)取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚适量，加甲醇制成混合溶液，制得蒽醌对照品溶液；

(2)取桃核承气汤制剂，利用甲醇提取，制得游离蒽醌供试品溶液；

(3)吸取蒽醌对照品溶液和游离蒽醌供试品溶液，注入液相色谱仪，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，测定得到桃核承气汤中游离蒽醌含量。

25.如权利要求23或24所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述总蒽醌含量的测定方法和游离蒽醌含量的测定方法均采用以下洗脱程序进行：

0～10min，流动相A从35％→40％，流动相B从65％→60％；

10～38min，流动相A从40％→60％，流动相B从60％→40％。

26.如权利要求23所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述总蒽醌含量的测定方法中，提取方式为回流提取，提取溶剂用量为25～50mL，提取时间为30～90min。

27.如权利要求23所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述总蒽醌供试品溶液的制备方法为：

取桃核承气汤制剂0.2～1g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25～50mL，称定重量，加热回流提取30～90分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液10～20mL，减压回收溶剂至干，加5％～10％盐酸溶液10～20mL，超声处理1～5分钟，再加三氯甲烷5～25mL，加热回流1～1.5小时，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3～5次，每次10～30mL，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

28.如权利要求24所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述游离蒽醌供试品溶液的制备方法为：

取桃核承气汤的药物制剂0.2～1g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25～50mL，称定重量，加热回流30～90分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

29.如权利要求23所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述总蒽醌含量的测定方法中，分别吸取蒽醌对照品溶液、总蒽醌供试品溶液各5～15μL，注入液相色谱仪进行检测；其中，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其柱长150mm，内径为3mm，粒径为5μm，柱温为28～32℃；所述液相色谱仪以乙腈为流动相A，以0.05～0.15％的磷酸水溶液为流动相B，流速为0.6～1mL/min，检测波长为250～260nm。

30.如权利要求24所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述游离蒽醌含量的测定方法中，分别吸取蒽醌对照品溶液、游离蒽醌供试品溶液各5～15μL，注入液相色谱仪进行检测；其中，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其柱长150mm，内径为3mm，粒径为5μm，柱温为28～32℃；所述液相色谱仪以乙腈为流动相A，以0.05～0.15％的磷酸水溶液为流动相B，流速为0.6～1mL/min，检测波长为250～260nm。

31.如权利要求1所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述肉桂酸、桂皮醛含量的测定方法为：

(1)取肉桂酸、桂皮醛对照品，加甲醇制成混合溶液，即得肉桂对照品溶液；

(2)取桃核承气汤制剂，加入提取溶剂提取，制得肉桂供试品溶液；

(3)吸取肉桂对照品溶液、肉桂供试品溶液，注入液相色谱仪，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，所述液相色谱仪以乙腈为流动相A，甲酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，测定得到桃核承气汤中肉桂酸和肉皮醛的含量。

32.如权利要求31所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述肉桂酸、桂皮醛含量的测定方法中，所述梯度洗脱按下述程序进行：

0～15min，流动相A从32％→45％，流动相B从68％→55％；

15～25min，流动相A从45％→50％，流动相B从55％→50％；

25～30min，流动相A为50％，流动相B为50％。

33.如权利要求31所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述肉桂酸、桂皮醛含量的测定方法中，所述提取溶剂为50～70％甲醇，提取时间为15～45min，提取方式为超声提取或回流提取，提取溶剂的用量为10～25mL。

34.如权利要求31所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述肉桂酸、桂皮醛含量的测定方法中，分别吸取肉桂对照品溶液和肉桂供试品溶液各5～10μL，注入液相色谱仪进行检测，其中，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为2.5mm，粒径为5μm，柱温为28～32℃；所述液相色谱仪以乙腈为流动相A，以0.05％～0.15％的甲酸溶液为流动相B；流速为0.6～1.0mL/min；检测波长为280～290nm。

35.如权利要求1所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述甘草酸含量的测定方法为：

(1)取甘草酸铵对照品，加70％乙醇制成每1mL含甘草酸0.1～1mg的溶液，即得甘草酸对照品溶液；

(2)取桃核承气汤制剂，加入提取溶剂提取，制得甘草酸供试品溶液；

(3)吸取甘草酸对照品溶液、甘草酸供试品溶液，注入液相色谱仪，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，所述液相色谱仪以乙腈为流动相A，磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，测定得到桃核承气汤中甘草酸的含量。

36.如权利要求35所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述甘草酸含量的测定方法中，所述梯度洗脱按下述程序进行：

0～8min，流动相A为19％，流动相B为81％；

8～35min，流动相A从19％→50％，流动相B从81％→50％；

35～36min，流动相A从50％→100％，流动相B从50％→0％；

36～40min，流动相A从100％→19％，流动相B从0％→81％。

37.如权利要求35所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述甘草酸含量的测定方法中，所述提取溶剂为50～70％乙醇，提取时间为15～45min，提取方式为超声提取或回流提取，提取溶剂的用量为10～50mL。

38.如权利要求35所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述甘草酸含量的测定方法中，所述甘草酸供试品溶液的制备方法为：

取桃核承气汤制剂0.2g～0.3g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％～70％乙醇5mL～15mL，采用功率为200～300kW，频率为35～45kHz超声处理15～45分钟，取出，放冷，再称定重量，用70％～80％乙醇补足减失的重量，摇匀，取续滤液，即得。

39.如权利要求35所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述甘草酸含量的测定方法中，分别吸取甘草酸对照品溶液和甘草酸供试品溶液各5～10μL，注入液相色谱仪测试；所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为2.5mm，粒径为5μm，柱温为22～28℃；所述液相色谱仪以乙腈为流动相A，以0.05％～0.10％的磷酸溶液为流动相B；流速为0.6～1.0mL/min；检测波长为240～260nm。

40.如权利要求1所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，还包括：

(4)将桃核承气汤蒸干，测定其出膏率；

(5)测定桃核承气汤的溶出物。

41.如权利要求1所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述桃核承气汤由以下重量份的组分组成：桃仁15份、大黄55.2份、肉桂27.6份、甘草27.6g、芒硝27.6g。

42.如权利要求1所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述桃核承气汤的制备方法为：取桃仁、大黄、肉桂和甘草加水1200～1500mL浸泡，武火煮沸，文火沸腾至药液为400～600mL，滤过后滤液加入芒硝，加热煮沸即得。

43.如权利要求42所述的桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述桃核承气汤的制备方法为：取桃仁、大黄、肉桂和甘草加水1400mL浸泡，武火煮沸，文火沸腾至药液为500mL，滤过后滤液加入芒硝，加热煮沸即得。

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