CN110412155B - 一种两地汤的hplc特征图谱的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明本发明公开了一种两地汤的HPLC特征图谱的检测方法，其特征在于包括以下步骤：(1)供试品溶液的制备：取待测两地汤制剂，制备供试品溶液；(2)对照品溶液的制备：取芍药苷和哈巴俄苷，配置对照品溶液；(3)对照特征图谱的制定：分别吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，依据N批以上供试品所测得的图谱，生成对照特征图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其他共有峰的相对保留时间。该方法精密度较高，稳定性、重复性良好，可以较为全面、有效的控制两地汤的质量。

Description

一种两地汤的HPLC特征图谱的检测方法
技术领域
本发明属于药物质量控制技术领域，具体地说，本发明涉及两地汤的特征图谱的检测方法及应用。
背景技术
两地汤出自明末清初医家傅山(字青主)所著《傅青主女科》一书，其处方组成为酒地黄、玄参、酒白芍、麦冬、地骨皮、阿胶，临床应用广泛，是妇科调经常用效方。两地汤主要功效为滋阴清热，凉血调经，主治阴虚内热所致的月经先期，量少，经期延长及功能性子宫出血等症。
中药复方因原料组成较多，成份复杂，导致质量控制难度较大。特征图谱能较全面地反映复方成份类型及整体特征，表征中药内在质量，进而反映复方制剂的临床药效物质基础，为中药质量评价和控制提供了一条新思路。高效液相色谱法因具有灵敏度高、分析速度快、应用范围广等优点而成为中药特征图谱研究中应用最广泛的方法。
两地汤由六味中药组成，其中地黄中主要含有多糖类、环烯醚萜类及苯乙醇苷类等成分，玄参中主要含有环烯醚萜和苯丙素苷两类主要活性成分，白芍中主要活性成分为白芍总苷类，麦冬主要含有多糖类、甾体皂苷及高异黄酮类等成分，地骨皮含有生物碱类、有机酸类、肽类、蒽醌类，阿胶主要含有蛋白质和氨基酸类。由此可见，两地汤化学成分复杂，质量控制难度较大。截至目前，还没有关于两地汤质量检测和控制方法的文献报道，因此，建立两地汤质控方法既急迫又关键。
发明内容
本发明的目的在于提供两地汤的特征图谱的检测方法。
本发明的技术方案为：
一种两地汤的HPLC特征图谱的检测方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取待测两地汤制剂，制备供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：取芍药苷和哈巴俄苷，配置对照品溶液；
(3)对照特征图谱的制定：分别吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，依据N批以上供试品所测得的图谱，生成对照特征图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其他共有峰的相对保留时间。
进一步的，所述的步骤(1)中，供试品溶液的制备方法为：精密称取待测两地汤制剂，加水溶解，加入4倍体积量乙腈，超声提取，过滤，滤液蒸干，残渣加低浓度甲醇溶解，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
进一步的，所述的步骤(2)中，对照品溶液的制备方法为：取对照品加甲醇制成每1ml含芍药苷180μg、哈巴俄苷20μg的混合溶液，即得。
进一步的，所述的步骤(3)中，色谱条件为：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填充剂色谱柱；流动相A为甲醇；B为0.02％～0.5％的磷酸溶液；梯度洗脱；流速为0.6～1.4ml/min；检测波长为200～300nm；柱温20～50℃；理论塔板数按芍药苷峰计算应不低于3000。
优选的，所述的步骤(3)中，所述高效液相色谱法的进样量为5-20μl；所述N为10-20；以参照物色谱峰保留时间为基准，计算其他共有色谱峰的相对保留时间，其相对保留时间不得超过规定值的±20％，优选为±5％；待测制剂的特征图谱与对照特征图谱的相似度，为0.9～1.0。
优选的，色谱柱优选为Thermo Hypersil GOLDTM aQ色谱柱，柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm；流动相B优选为0.05％的磷酸溶液；流速优选为1ml/min；检测波长优选为254nm；柱温优选为25℃。
优选的，所述的步骤(3)中，采用梯度洗脱方法，为：0→10min：5→23.5％A；10→20min：23.5％A；20→58min：23.5→63％A；58→60min：63→90％A。
优选的，所述的步骤(3)中，高效液相色谱法的进样量为10μl。
所述两地汤的原料组成为：酒地黄，玄参，酒白芍，麦冬，地骨皮，阿胶。
进一步的，所述两地汤的原料组成和重量份为：酒地黄373份，玄参373份，酒白芍186份，麦冬186份，地骨皮112份，阿胶112份。
进一步的，所述两地汤制剂为：粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂等固体制剂，或口服液、合剂、糖浆剂等液体制剂。
所述两地汤特征图谱中共有峰13个，其中可标定7个成分，分别来自酒地黄、玄参和酒白芍。
该检测方法精密度较高，稳定性、重复性良好，可以较为全面、有效的控制制剂的质量一致性、稳定性和可控性。
附图说明
图1：两地汤不同浓度乙腈提取HPLC图；1∶60％乙腈；2∶70％乙腈；3∶80％乙腈；4∶90％乙腈；
图2：两地汤不同波长HPLC图；
图3：两地汤不同色谱柱考察HPLC图；1：Thermo Supersil GOLDTM-aQ柱；2：Agilent ZORBAX SB-Aq柱；3：Phenomenex Geminin 5μm C18 110A柱；4：Agela VenusilXBP-C18柱；
图4：两地汤柱温考察HPLC图；
图5：两地汤特征图谱；其中峰3：梓醇；峰7：没食子酸；峰8：芍药苷；峰10：毛蕊花糖苷；峰11：安格洛苷C；峰12：肉桂酸；峰13：哈巴俄苷；
图6：18批两地汤共有模式叠加色谱图；
图7：两地汤与对照品HPLC对比图；
图8：两地汤与缺各药味两地汤样品HPLC对比图；1：两地汤；2：缺酒地黄两地汤；3：缺玄参两地汤；4：缺酒白芍两地汤；5：缺麦冬两地汤；6：缺地骨皮两地汤。
具体实施方式
实施例1：两地汤制备
酒地黄37.3g，玄参37.3g，酒白芍18.6g，麦冬18.6g，地骨皮11.2g，阿胶11.2g
以上六味，取除阿胶外的酒地黄、玄参等其余五味加水浸泡40分钟，加盖煎煮2次，第一次加水7倍量，煎煮30分钟；第二次加水5倍量，煎煮20分钟；煎液过滤，滤液合并并浓缩至500ml左右，加入阿胶烊化，得标准汤剂；标准汤剂低温减压浓缩至250ml左右，冷冻干燥成冻干粉，即得。
实施例2：两地汤特征图谱方法建立
1、仪器与试药
仪器：岛津LC-20AT型高效液相色谱仪(DGU-20A5在线脱气系统，LC-20AT串联双柱塞泵，SIL-20A自动进样器，CTO-20AC柱温箱，SPD-M20A二极管阵列检测器)；高效液相色谱仪(美国，Agilent 1290 series，Agilent公司)-四级杆飞行时间质谱(美国，Agilent 6540series，Agilent公司)；Sartorious M-power万分之一型电子天平和Sartorious TE212-L百分之一型电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)，XS105DU型1/10万电子天平(瑞士，梅特勒-托利多)；KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；DK-98-IIA型电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)。
对照品及试剂：芍药苷标准品(批号：110736-201741，纯度95.7％)、哈巴俄苷标准品(批号：111730-201709，纯度95.9％)均购自中国食品药品检定研究院；色谱级甲醇、乙腈(美国，Fisher公司)，色谱级磷酸(美国，MREDA公司)。
供试品：使用实施例1制备得到的药物。
2、供试品溶液制备方法研究
(1)提取溶剂选择
研究选择了甲醇、乙醇、乙腈三种溶剂，每种溶剂分别考察了四个不同的浓度(25％，50％，75％，100％)，实验结果见下表1。
表1不同提取溶剂芍药苷、哈巴俄苷峰面积统计表
Figure BDA0002117474940000051
由实验结果可知，甲醇、乙醇提取效果相对较差；乙腈提取效果最好，高浓度乙腈既可除去大部分杂质，又能最大程度的提取出主要有效成分，且基线平稳，所以选择乙腈为提取溶剂。
(2)提取浓度考察
实验考察了不同浓度的乙腈(60％、70％、80％、90％)的提取效果，实验结果见下下表2及图1。
表2不同浓度乙腈提取芍药苷、哈巴俄苷峰面积统计表
Figure BDA0002117474940000052
通过实验结果分析，90％乙腈提取率较低，60％、70％、80％乙腈对芍药苷和哈巴俄苷的提取效果差别不大，但60％、70％乙腈提取的杂质较多，80％乙腈提取的杂质少，基线平稳，所以提取浓度选择80％乙腈。
(3)溶剂用量考察
实验考察比较了不同体积(25ml、30ml、40ml、50ml)的80％乙腈溶液对提取效果的影响，结果见下表3。
表3不同体积的80％乙腈的提取结果表
Figure BDA0002117474940000053
Figure BDA0002117474940000061
由上表可知，提取溶剂体积加大，定量峰面积没有明显差异，且溶剂用量越大，提取的杂质越多，还易造成溶剂浪费。综合考虑，选择提取体积为25ml。
(4)提取方法考察
实验考察了超声提取、加热提取、振摇提取三种方式，实验结果见下表4。
表4不同提取方法指标成分峰面积统计表
Figure BDA0002117474940000062
实验结果显示，三种提取方法结果差别不大，因超声提取操作简单方便，所以样品提取方法选择超声提取。
3.色谱分析条件考察研究
(1)流动相系统的选择
实验考察比较了水相中加酸与否以及使用不同的有机相分析时的色谱图差异，结果显示，加酸可以改善色谱图峰型及分离度，甲醇为流动相时色谱图峰型及分离度均优于乙腈，所以流动相系统选择甲醇-酸水。在对酸种类的考察中，实验选择了甲酸、乙酸、磷酸三种酸，考察结果显示甲酸、乙酸在低波长下基线掉落严重，磷酸在各个波长下基线均较平稳，所以选择磷酸水系统。随后考察了4个不同的磷酸浓度(0.01％、0.05％、0.1％、0.5％)，结果发现，0.01％磷酸浓度偏小，色谱图峰型不好；0.05％和0.1％磷酸浓度，峰型差别不大；0.5％磷酸浓度，色谱峰基线掉落，同时酸浓度越高对色谱柱损伤越大，容易缩短色谱柱寿命，综合考虑，选择0.05％磷酸水系统。
除考察酸之外，也曾考察醋酸钠缓冲盐及四氢呋喃等改性剂对峰型的影响，结果均不理想，色谱图峰型会变差。
根据实验结果，流动相系统选择甲醇-0.05％磷酸水。
(2)波长的选择
实验考察了210nm、250nm、254nm、280nm、300nm五个不同波长下的色谱图，结果发现，低波长(210nm)下色谱图基线漂移严重，且甲醇溶剂峰干扰较大；高波长(280nm、300nm)下大极性段部分的峰紫外吸收较弱；254nm波长下峰分布均匀，能较好的反映两地汤整体成分信息。所以选定分析波长为254nm。具体情况见图2。
(3)色谱柱考察
考察了四根不同厂家不同型号的色谱柱，色谱柱特点见下表5。
表5不同厂家及型号的色谱柱特点表
Figure BDA0002117474940000071
不同色谱柱分析图谱见下图3，指标成分芍药苷、哈巴俄苷分离度及理论塔板数计算结果见表6。
表6不同色谱柱考察结果表
Figure BDA0002117474940000072
由以上结果可知，Thermo Supersil GOLDTM-aQ柱峰型、分离度以及理论塔板数相对较好；Agilent及Agela色谱柱定量峰分离度不达标，且峰型较差；Phenomenex C18柱虽分离度优于赛默飞aQ柱，但峰较宽。综合考虑，选择Thermo Supersil GOLDTM-aQ柱进行样品分析。
(4)柱温考察
实验考察了不同柱温对峰型及峰分离度的影响，结果发现，温度对芍药苷峰型影响较大，温度低时(小于28℃)，芍药苷峰峰型好，基本呈正态分布，且与杂质分离度好；温度越高，芍药苷峰拖尾越严重，且不易与杂质相分离。综合考虑，色谱柱温度选择25℃。考察结果见图4。
(5)洗脱梯度优化
经不断考察优化流动相洗脱条件，最终确定两地汤洗脱梯度为：甲醇(A)-0.05％磷酸溶液(B)(0→10min：5→23.5％A；10→20min：23.5％A；20→58min：23.5→63％A；58→60min：63→90％A)，色谱图如图5所示。
实施例3：两地汤特征图谱
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(ThermoHypersil GOLDTM aQ色谱柱，柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以甲醇为流动相A，以0.05％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为lml/min；检测波长为254nm，210nm；柱温为25℃。理论塔板数按芍药苷峰计算不低于3000。
Figure BDA0002117474940000081
参照物溶液的制备 取芍药苷对照品、哈巴俄苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含芍药苷180μg、哈巴俄苷20μg的混合溶液，即得。
供试品溶液的制备 取本品研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入5ml水使溶解，再精密加入20ml乙腈，振摇，密塞，称重。超声处理20分钟，放冷，再次称重，用80％乙腈补足减失的重量。过滤，精密量取续滤液20ml，蒸干，残渣加10％甲醇溶解并定容至10ml。
测定法 精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录60分钟色谱图，即得。
供试品特征图谱中应呈现13个特征峰，其中2个峰应分别与相应的参照物峰保留时间相一致，与芍药苷参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％之内。规定值为：0.189(峰1)、0.216(峰2)、0.229(峰3)、0.260(峰4)、0.292(峰5)、0.323(峰6)、0.338(峰7)、1.000(峰8)、1.431(峰9)、1.494(峰10)、1.754(峰11)、1.849(峰12)、2.126(峰13)。
实施例4：两地汤特征图谱精密度考察
取同一份两地汤样品，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，连续进样6次，以芍药苷为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD(％)值。实验数据见表7、表8。
表7两地汤特征图谱精密度试验结果-相对保留时间
Figure BDA0002117474940000091
表8两地汤特征图谱精密度试验结果-相对峰面积
Figure BDA0002117474940000092
Figure BDA0002117474940000101
结果表明，以芍药苷为参照峰，各共有峰的相对保留时间RSD均小于0.3％，相对峰面积RSD均小于2.0％，说明仪器精密度良好。
实施例5：两地汤特征图谱稳定性考察
取同一份两地汤样品，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，分别于0～24h进样6次，以芍药苷为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD(％)值。实验数据见表9、表10。
表9特征图谱稳定性试验结果-相对保留时间
Figure BDA0002117474940000102
表10两地汤特征图谱稳定性试验结果-相对峰面积
Figure BDA0002117474940000103
Figure BDA0002117474940000111
结果表明，各共有峰的相对保留时间RSD均小于0.5％，相对峰面积RSD均小于3.0％，供试品溶液在24h内稳定。
实施例6：两地汤特征图谱重复性考察
取同一批号两地汤样品，按供试品溶液制备方法平行制备6份供试品溶液，按上述色谱条件分别进样分析，以芍药苷为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD(％)值。实验数据见表11、表12。
表11特征图谱重复性试验结果-相对保留时间
Figure BDA0002117474940000112
表12两地汤特征图谱重复性试验结果-相对峰面积
Figure BDA0002117474940000113
Figure BDA0002117474940000121
结果表明，以芍药苷为参照峰，各共有峰的相对保留时间RSD均小于0.2％，相对峰面积RSD均小于3.0％，说明该方法重复性良好。
实施例7：两地汤特征图谱多批次样品考察
将18批两地汤制剂色谱图数据(AIA数据)导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)软件，以S1为参照图谱，时间窗宽度设为0.1min，经多点校正和全谱峰匹配，采用均值法生成对照图谱，两地汤样品叠加图谱见下图6。选择图谱中含量较大、分离度好且比较特征的13个共有峰作为特征图谱，在特征图谱中芍药苷峰保留时间居中、含量相对较高、分离度好、且为白芍的特征活性成分，故确定以芍药苷(8号峰)为参照峰，18批两地汤样品特征图谱与其生成的对照特征图谱的相似度结果见表13、14。13个共有峰的相对保留时间和相对峰面积结果见下表15、16。结果发现，18批两地汤样品特征图谱相似度在0.95～1.0之间，说明选择的共有峰稳定性好、特征性强。
Figure BDA0002117474940000131
Figure BDA0002117474940000141
Figure BDA0002117474940000151
Figure BDA0002117474940000161
实施例8：两地汤特征图谱共有峰来源指认
通过文献研究及HPLC-TOF-MS质谱分析(ESI+离子模式)，初步推断出9个化合物，再通过与对照品进行紫外吸收及保留时间比对，最终确定该9个共有峰，从左到右分别为梓醇、没食子酸、哈巴苷、芍药内酯苷、芍药苷、毛蕊花糖苷、安格洛苷C、肉桂酸以及哈巴俄苷，阴性考察结果表明，共有峰峰3主要来自酒地黄；峰7和8都来自于白芍；峰11、12、13都来自于玄参，是其特征性成分。质谱分析结果见表17，两地汤与对照品比对色谱图见图7，两地汤与缺各药味两地汤阴性样品对比色谱图见图8。
表17两地汤质谱分析结果表
Figure BDA0002117474940000171
文中应用了具体个例对本发明的原理及方法进行了阐述，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
至此，本领域技术人员应认识到，虽然本文已详尽示出和描述了本发明的多个示例性实施例，但是，在不脱离本发明精神和范围的情况下，仍可根据本发明公开的内容直接确定或推导出符合本发明原理的许多其他变型或修改。因此，本发明的范围应被理解和认定为覆盖了所有这些其他变型或修改。

Claims (7)

1.一种两地汤的HPLC特征图谱的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）供试品溶液的制备：取待测两地汤制剂，制备供试品溶液；
（2）对照品溶液的制备：取芍药苷和哈巴俄苷，配置对照品溶液；
（3）对照特征图谱的制定：分别吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，依据N批以上供试品所测得的图谱，生成对照特征图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其他共有峰的相对保留时间；
所述的步骤（3）中，色谱条件为：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填充剂色谱柱；流动相A为甲醇；B为0.02%~0.5%的磷酸溶液；梯度洗脱；流速为0.6～1.4ml/min；检测波长为200～300nm；柱温20～50℃；理论塔板数按芍药苷峰计算应不低于3000；
所述的步骤（3）中，采用梯度洗脱方法，为：0→10min：5→23.5%A；10→20min：23.5%A；20→58min：23.5→63%A；58→60min：63→90%A；
所述的步骤（1）中，供试品溶液的制备方法为：精密称取待测两地汤制剂，加水溶解，加入4倍体积量乙腈，超声提取，过滤，滤液蒸干，残渣加低浓度甲醇溶解，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤（2）中，对照品溶液的制备方法为：取对照品加甲醇制成每1ml含芍药苷180μg、哈巴俄苷20μg的混合溶液，即得。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤（3）中，高效液相色谱法的进样量为5-20μl；所述N为10-20；以参照物色谱峰保留时间为基准，计算其他共有色谱峰的相对保留时间，其相对保留时间不得超过规定值的±20%；待测制剂的特征图谱与对照特征图谱的相似度，为0.9～1.0。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，色谱柱优选为Thermo Hypersil GOLDTMaQ色谱柱,柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm；流动相B优选为0.05%的磷酸溶液；流速优选为1ml/min；检测波长优选为254nm；柱温优选为25℃。
5.如权利要求1至4任意一项所述的检测方法，其特征在于，所述两地汤的原料组成为：酒地黄，玄参，酒白芍，麦冬，地骨皮，阿胶。
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述两地汤的原料组成和重量份为：酒地黄373份，玄参373份，酒白芍186份，麦冬186份，地骨皮112份，阿胶112份。
7.如权利要求1至4和6任意一项所述的检测方法，其特征在于：所述两地汤制剂为：粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂的固体制剂，或口服液、合剂、糖浆剂的液体制剂。
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