CN112798724B - 一种适用于人参属中药材及药材提取物的皂苷类成分色谱指纹图谱的建立方法 - Google Patents
一种适用于人参属中药材及药材提取物的皂苷类成分色谱指纹图谱的建立方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于中药材色谱指纹图谱技术领域，涉及到人参属中药材皂苷类成分色谱指纹图谱的建立方法，尤其是含皂苷类成分较多的名贵药材，具体为人参、三七、西洋参。所述方法包括以下步骤：供试品溶液的制备、对照品溶液的制备，HPLC检测以及色谱指纹图谱分析。本发明建立了人参属中药材皂苷类成分的HPLC指纹图谱，可同时适用于人参、三七、西洋参等中药材、破壁饮片和药材提取物中皂苷类成分的色谱指纹图谱的构建，构建的方法可更完善地评价人参属中药材的质量，确保药材质量的一致性。本发明建立的色谱指纹图谱峰信息全面且分离度高，经精密度、重复性及稳定性考察表明方法学良好，能够弥补现有质量技术的不足之处，提升人参属中药材、破壁饮片和提取物的现有质量控制水平。
Description
技术领域
本发明涉及中药指纹图谱分析方法，特别是一种适用于人参属中药材的皂苷类成分的指纹图谱的建立方法。
背景技术
人参属(Panax)源自伞形目五加科，该属植物主要分布于北美、中亚和东亚。人参属植物作为中药使用已有4000年的历史，较为常见且研究较多的为人参(Panax ginsengC.A.Mey.)、三七(Panax Notoginseng(Burk.)F.H.Chen)和西洋参(Panax QuinquefoliumL.)。人参、三七和西洋参均为传统名贵中药材，在世界各国广泛应用。研究表明，达马烷型四环三萜皂苷是人参、三七和西洋参中的主要有效化学成分，也是其质量评价的主要指标。人参、三七和西洋参虽主要成分相近，但功效却不尽相同，人参有大补元气、补脾益肺，安神益智的功效；西洋参有补气养阴，清热生津的功效；而三七有止血散淤，消肿定痛的功效。
由于人参、三七、西洋参具有较高的保健和治疗价值，市场上药材掺假现象时有发生，商品质量真伪难辨。加之药材受产地、年限、生长环境采收时间等因素的影响，药材质量不一，直接造成临床用药疗效的不稳定，给临床用药安全带来危害。为了保证药品质量，急需建立一个全面反映药材真实性，重现性好，特征性强，方法简便的检测方法。
现有文献资料显示，几乎所有的质量标准中含量测定都选择一种或几种人参皂苷进行含量测定，其中高效液相色谱法应用最广泛。而2015版《中国药典》对于人参药材含量测定仅要求含人参皂苷Rg1+Re不得少于0.30％，人参皂苷Rb1不得少于0.20％；对于三七药材含量测定要求含人参皂苷Rg1+Rb1+三七皂苷R1不得少于5.0％；对于西洋参药材含量测定要求含人参皂苷Rg1+Re+Rb1的总量不得少于2.0％。研究发现，人参、西洋参中须根中Re含量较高，三七剪口部位人参皂苷含量也稍高，很容易满足药典上含量的要求，但并非优质的参品来源。
色谱指纹图谱能够标识中药各组分群体特征的共有峰图谱，是一种综合的，并可同时实现定性定量的方法，可用于鉴别中药材的真伪，评价中药材质量的稳定。基于这一特点，中药色谱指纹图谱技术已然成为了国内外鉴别中药品种和评价中药质量的有效手段，且广泛被应用于我国中药材、中药制剂的质量标准中。但当前尚未有通用型人参属药材的皂苷类成分色谱指纹图谱，尤其是同时适用于人参、三七、西洋参的质量评价方法。原因是人参属药材含有的成分复杂，在不清楚特征组分、没有对比分析同属植物的情况下，构建通用型色谱指纹图谱评价人参属药材质量的技术难度较大。开发建立一种简便易行，准确性高，重复性良好且能适用于人参属中药材皂苷类成分的色谱指纹图谱检测方法，对于人参属不同药材及药材提取物的质量控制和评价具有重要的应用价值。
发明内容
基于上述技术问题和应用前景，本发明旨在提供一种适用于人参属中药材及药材提取物皂苷类成分的色谱指纹图谱方法，该法可同时适用于人参、三七、西洋参中药材和破壁饮片及药材提取物等色谱指纹图谱的构建。本发明提供的方法操作简便，稳定、重现性好和精密度高，呈现出的皂苷类成分色谱指纹图谱峰信息全面，能够弥补现有人参、三七、西洋参的质量控制技术的不足，使药材质量控制技术更加科学和完善。
为实现上述目的，本发明提供一种适用于人参属中药材及药材提取物的皂苷类成分的色谱指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：对于药材，取药材粉末经甲醇加热回流提取，滤过，得到滤液蒸干，残渣用适量甲醇溶解；对于药材提取物，取提取物用适量甲醇溶解；
(2)对照品溶液的制备：取三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Ro、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rd对照品，分别加入甲醇制成对照品溶液；
(3)建立人参属中药材的HPLC指纹图谱，并对皂苷成分特征峰进行化学归属。
其中，HPLC检测步骤：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪测定，记录色谱图；
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A为乙腈，流动相B为甲醇，流动相C为含10mmol/L三乙胺水溶液(用磷酸调至pH 2.6～2.8)，梯度洗脱，梯度洗脱过程中，流动相A、流动相B和流动相C的变化为：
0-33min，流动相A 0％-37％，流动相B 40％-40％，流动相C 60％-23％；
33-65min，流动相A 37％-90％，流动相B 40％-10％，流动相C 23％-0％。
其中，本申请所述的人参属中药材及其提取物为人参、三七、西洋参原药材，或其饮片、破壁饮片形式，或为人参、三七、西洋参的中药提取物形式。
其中，所述的中药提取物形式包括但不限于人参醇提取物、人参总皂苷提取物、三七醇提取物、三七总皂苷提取物、西洋参醇提取物、西洋参总皂苷提取物。
其中，所述的中药提取物形式，可采用现有技术的任意方法进行提取制备。
优选的，所述的中药材提取物制备方法如下：
a：将人参、三七和西洋参药材粉碎成粗粉,分别用95％乙醇加热回流提取3次，每次1h，合并提取液，浓缩至浸膏，干燥后分别得到人参醇提取物、三七醇提取物和西洋参醇提取物。
b：取人参切成厚片，加水煎煮两次，第一次2h，第二次1.5h，煎液滤过，合并滤液，通过D101型大孔树脂柱，水洗脱至无色，再用60％乙醇洗脱，收集60％乙醇洗脱液，滤液浓缩至浸膏，干燥即得人参总皂苷提取物。
c：取三七粉碎成粗粉，用70％的乙醇回流提取，滤过，滤液减压浓缩，滤过，过D101型大孔树脂柱，用水洗涤，弃去水洗液，以80％乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，脱色精制，减压浓缩至浸膏，干燥即得三七总皂苷提取物。
d：取西洋参粉碎成粗粉，经70％的乙醇加热回流提取3次，第一次1.5h，第二次1h，第三次1h，合并提取液，旋转蒸发至干。加入适量纯水溶解，通过D101型大孔树脂柱，先后用水、15％乙醇洗脱，弃去洗脱液，再用80％乙醇洗脱，收集80％乙醇洗脱液，滤液浓缩至浸膏，得西洋参总皂苷提取物。
其中，人参药材的供试品溶液的制备方法，进一步包括如下步骤：甲醇回流提取后，残渣采用适量甲醇溶解，再通过预先活化的中性氧化铝柱中，先后用无水乙醇，50％乙醇洗脱，合并收集洗脱液，蒸干，所述残渣用甲醇溶解得到供试品溶液。
其中，供试品溶液的制备中，加热回流条件为保持微沸状态。
所述加热回流提取时间为1h。
所述甲醇与药材的用量比为30-100mL:1-5g，甲醇与药材提取物的用量比为5-20mL：50-200mg。
其中，所述HPLC检测分析采用的色谱柱为Waters SymmertryC18，色谱柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm。
HPLC检测分析时紫外检测波长为203nm，DAD检测器
HPLC检测分析时进样体积为5μL。
HPLC检测分析时流速为0.8mL/min。
HPLC检测分析时柱温50℃。
其中，所述的色谱指纹图谱中人参皂苷Rg1理论塔板数不低于6000。
另一方面，本发明还提供了一种人参属中药材及药材提取物的皂苷类成分色谱指纹图谱的检测方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)待测样品色谱图的制备：
对于药材，取药材粉末经甲醇加热回流提取，滤过，得到滤液蒸干，残渣用适量甲醇溶解；对于药材提取物，取提取物用适量甲醇溶解；取待测样品溶液，注入超高效液相色谱仪，得到色谱图；
(2)待测样品色谱图和标准对照色谱指纹图谱相似度计算：
将待测样品的色谱图通过共有模式的构建、相似度计算和主成分分析方法可对离群和合格样本进行有效筛选，比较待测样品的色谱图和标准对照色谱指纹图谱相似度；
其中，色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A为乙腈；流动相B为甲醇；流动相C为含10mmol/L三乙胺水溶液，用磷酸调至pH 2.6～2.8；梯度洗脱；
梯度洗脱过程中，流动相A、流动相B和流动相C的变化为：
0-33min，流动相A 0％-37％，流动相B 40％-40％，流动相C 60％-23％；
33-65min，流动相A 37％-90％，流动相B 40％-10％，流动相C 23％-0％；
波长为203nm；进样体积为5μL；流速为0.8mL/min；进样温度为50℃。
其中，所述人参属中药材为人参、三七、西洋参原药材，或其饮片、破壁饮片形式；所述药材提取物为人参、三七、西洋参的中药提取物形式。
其中人参的待测样品溶液的制备方法，进一步包括如下步骤：甲醇回流提取后，残渣采用适量甲醇溶解，再通过预先活化的中性氧化铝柱中，先后用无水乙醇，50％乙醇洗脱，合并收集洗脱液，蒸干，所述残渣用甲醇溶解得到供试品溶液。
其中，甲醇与药材的用量比为30-100mL:1-5g，甲醇与药材提取物的用量比为5-20mL:50-200mg。
本发明分别对供试品提取工艺和HPLC检测流动相进行相应的优化。
对于三七和西洋参的样品提取方法的选择，实验比较了甲醇超声提取法和回流提取法，液相分析结果显示超声提取法所得供试品溶液色谱峰面积小且杂峰较多，而回流提取法所得溶液的分析结果表明药材成分提取完全，色谱峰响应高，各药材色谱图的专属性强、稳定性和重现性良好；对于人参样品提取方法的选择，实验比较了甲醇超声提取法和回流提取法，液相分析结果表明人参样本前处理对人参色谱指纹图谱的测定影响比较大，超声提取法特征峰提取率低，用甲醇加热回流处理，可将人参皂苷从药材中有效转移出来，特征峰突出。回流提取法所得浸膏经预先活化好的中性氧化铝柱层析，先后用无水乙醇，50％乙醇洗脱。无水乙醇能洗脱极性较小的皂苷类成分，主要的极性皂苷仍被保留在层析柱上，对这部分成分的富集与洗脱，实验比较了50％乙醇与30％乙醇的洗脱行为，结果表明50％乙醇能迅速有效地收集皂苷成分并且洗脱下来的水溶性杂质较少，30％乙醇洗脱呈现的谱图上Rb1峰大，但是水溶性杂质成分也多。综合比较下选择合并收集无水乙醇，50％乙醇洗脱液，该方法的皂苷提取率高，杂质少，色谱主要特征峰突出，色谱专属性强且稳定性和重现性良好。
流动相的优化使得皂苷类成分峰信息更加全面，保证各特征峰具有良好的分离度。反相色谱化学键和硅胶的粒度很小，影响出峰时间不完全受样品极性影响，还包括在洗脱过程中作用力的综合影响。人参皂苷的极性相差也不是很大，在反相色谱中很可能由于相互作用力和极性的综合作用导致分离效果差。不同的流动相能改变化学成分的出峰顺序和保留时间。为此，本发明选择三相流动相梯度洗脱，对于较复杂的组分的分离效果较好，使Re和Rg1峰分离度提高。与2015版《中国药典》人参含量测定项中经乙腈和水流动相系统洗脱，Re和Rg1峰出峰先后顺序相反。试验中发现皂苷类成分的峰形拖尾严重，因此分别考察了流动相C为水、5mmol/L磷酸氢二钠-水、0.1％三氟乙酸-水、0.1％磷酸-水以及10mmol/L三乙胺水溶液的情况(见图5)，然而发现流动相C为水、5mmol/L磷酸氢二钠-水、0.1％三氟乙酸-水、0.1％磷酸-水的情况下，对于拖尾峰的改善效果均较差。
在流动相里添加适当三乙胺，再用磷酸把流动相调回酸性，可以起到立竿见影的效果。经过摸索10mmol/L三乙胺水溶液用磷酸调至pH为2.6～2.8，能确保Rg1和Rc的分离度，且避免相邻的成分被拖尾峰包裹。流动相的PH不仅对峰形且对保留因子和选择性都有很大影响，酸性条件下，三乙胺阳离子和键合相中游离的硅羟基结合，占据键合相中所有与碱性化合物作用的活性中心，能较好改善峰形。试验中发现10mmol/L三乙胺水溶液用磷酸调至PH<2.6或PH>2.8都影响着Rg1和Rc的分离度，使其受相邻成分的峰包裹，为此，本实验优选流动相水相为10mmol/L三乙胺水溶液用磷酸调至pH为2.6～2.8(见图3)。
在乙腈(A)、甲醇(B)、10mmol/L三乙胺-水(磷酸调至Ph2.6～2.8)(C)流动相确定之后，本发明又分别考察了如下梯度洗脱程序：
(1)：0-25min，5％-30％A，35％-35％B，60％-35％C；
25-50min，30％-90％A，35％-5％B，35％-5％C；
50-60min，90％-95％A，5％-5％B，5％-0％C。
(2)：0-25min，0％-30％A，40％-40％B，60％-30％C；
25-50min，30％-88％A，40％-7％B，30％-5％C；
50-60min，88％-93％A，7％-7％B，5％-0％C。
(3)：0-20min，0％-32％A，40％-40％B，60％-28％C；
20-45min，32％-85％A，40％-10％B，28％-5％C；
45-50min，85％-90％A，10％-10％B，5％-0％C。
(4)：0-27min，0％-35％A，40％-40％B，60％-25％C；
27-56min，35％-90％A，40％-10％B，25％-0％C。
(5)：0-33min，0％-37％A，40％-40％B，60％-23％C；
33-65min，37％-90％A，40％-10％B，23％-0％C。
结果显示，梯度洗脱程序(1)呈现的谱图中Re与Rg1的分离效果较差，且一些较小的指纹峰的分离度不理想，需要优化色谱条件。在梯度洗脱程序(1)的基础上改进为梯度洗脱程序(2)，在此条件下，Re与Rg1的分离度得以改善，但由于Ro色谱峰前移且与Rg1后的小峰重叠而湮没了应有的色谱指纹信息，故继续调整洗脱梯度为程序(3)，程序(3)很好地解决了色谱峰前移和重叠的问题，但在此条件下，Ro与另一成分无法分离，改进后的梯度洗脱程序(4)很好地解决Ro与其他成分同时出峰的问题，但Rd色谱峰仍然受邻峰的干扰，难以获得好的峰型和分离度，梯度调整至洗脱程序(5)后，上述问题都能妥善得到解决，基本上已最大化地展示了色谱指纹信息，因此选择梯度(5)作为最终的梯度洗脱程序(见图6)。
比较了200nm、203nm、210nm三个波长下的色谱图，综合分析后发现三个品种药材供试品及化学对照品在203nm处的峰信号强度大且出峰多，主要特征峰干扰较小，分离度好。最终检测波长确定为203nm。
本发明分别考察和比较了35℃、40℃和50℃柱温的影响。35℃、40℃度均有Rg1与Re分离度差，峰拖尾的现象。选择50℃的柱温能改善各个特征峰拖尾现象，提高柱效，增加分离度，使出峰时间适当提前(见图4)。
本发明根据上述技术方案所述的色谱指纹图谱的建立方法所得到的标准色谱指纹图谱：人参皂苷类成分色谱指纹图谱中有16个主要峰为特征峰，根据化学对照品色谱行为和紫外-可见光吸收光谱，确定峰2为人参皂苷Re、峰3为人参皂苷Rg1、峰5为人参皂苷Ro、峰7为人参皂苷Rb1、峰8为人参皂苷Rc、峰10为人参皂苷Rd；西洋参皂苷类成分特征图谱中有12个主要峰为特征峰，峰1为人参皂苷Re，峰2为人参皂苷Rg1，峰3为人参皂苷Ro，峰5为人参皂苷Rb1，峰6为人参皂苷Rc，峰7为人参皂苷Rd；三七皂苷类成分色谱指纹图谱中应有12个主要峰为特征峰，峰1为三七皂苷R1，峰2为人参皂苷Re，峰3为人参皂苷Rg1，峰4为人参皂苷Rb1，峰5为人参皂苷Rd。
本发明提供了上述技术方案所述一种适用于人参属中药材及药材提取物的皂苷类成分的色谱指纹图谱的构建方法及标准色谱指纹图谱，结合主成分分析以更好地评价药材的质量，确保药材质量的一致性；本发明提供的方法操作简便，稳定、重现性好和精密度高，呈现出的色谱指纹图谱峰信息全面，能够弥补现有人参、三七、西洋参等名贵药材的质量控制技术的不足，使药材质量控制技术更加科学和完善，避免了质量控制的单一性和局限性。
附图说明
图1：人参、三七、西洋参皂苷类成分HPLC指纹图谱(a：化学对照品HPLC色谱图(1:三七皂苷R1；2:人参皂苷Re；3：人参皂苷Rg1；4：人参皂苷Ro；5：人参皂苷Rb1；6：人参皂苷Rc；7：人参皂苷Rd)；b：人参16个主要特征峰；c：三七12个主要特征峰；d：西洋参12个主要特征峰)
图2：超声提取与回流提取方法的考察(以批号20190601，三七药材为例)
图3：不同pH值环境流动相的影响
图4：不同柱温的影响
图5：流动相的考察(改性剂的选择)
图6：乙腈(A)、甲醇(B)、10mmol/L三乙胺-水(磷酸调至Ph2.6～2.8)(C)流动相体系梯度洗脱程序的考察
图7：人参、三七、西洋参药材的皂苷类成分HPLC指纹图谱共有模式图(a：14批人参药材；b：16批三七药材；c：16批西洋参药材)
图8：多批次人参、三七、西洋参药材的皂苷类成分HPLC指纹图谱叠加图(a：14批人参药材；b：16批三七药材；c：16批西洋参药材)
图9：多批次人参、三七、西洋参药材相似度计算散点图(a：14批人参药材；b：16批三七药材；c：16批西洋参药材)
图10：人参、三七、西洋参药材HPLC指纹图谱主成分分析图(左)以及共有峰载荷图(右)(a：14批人参药材；b：16批三七药材；c：16批西洋参药材)
图11：人参、三七、西洋参破壁饮片皂苷类成分色谱指纹图谱
图12：多批次人参、三七、西洋参破壁饮片的皂苷类成分HPLC指纹图谱叠加图(a：人参破壁饮片；b：三七破壁饮片；c：西洋参破壁饮片)
图13：人参、三七、西洋参总皂苷提取物皂苷类成分的HPLC指纹图谱(a:人参总皂苷提取物；b：三七总皂苷提取物；c：西洋参总皂苷提取物)
图14：人参、三七、西洋参醇提取物皂苷类成分的HPLC指纹图谱(a:人参醇提取物；b：三七醇提取物；c：西洋参醇提取物)
具体实施方式
以下所述仅是本发明的优选实施例，仅用以本发明的技术方案进行清晰、完整地描述，而非限制。尽管通过下述优选实施例已对本发明进行了详细的描述，但可在形式上和细节上对其做出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
实施例1：
1.实验材料：
13批人参药材、16批三七药材、16批人参药材采购时间为2018年10月～2020年4月，自不同地区，具体样品信息见表1。
表1样品信息
2.仪器与试剂
Sartorius Secura 224-1CN万分之一电子天平；Thermo Fisher UltiMate 3000高效液相色谱仪(DAD检测器)；ZNH W-DL智能六联电热套(功率216W x 6，电压220V)，一恒电热HWS-26恒温水浴锅；Waters Symmertry C18(5μm,250mm×4.6mm)色谱柱。
人参皂苷Re(上海源叶生物科技有限公司，批号：B10M8S35243，HPLC>98％，供含量测定用)；人参皂苷Rg1(上海源叶生物科技有限公司，批号：Z26S7X21730，HPLC>98％，供含量测定用)；人参皂苷Rb1(上海源叶生物科技有限公司，批号：Z06M8L30693，HPLC>98％，供含量测定用)；人参皂苷Rc(上海源叶生物科技有限公司，批号：M27J8S40364，HPLC>98％，供含量测定用)；人参皂苷Ro(中国食品药品检定研究院，批号：111903-201805，供鉴别使用)；人参皂苷Rd(上海源叶生物科技有限公司，批号：Z13N8X48155，HPLC>98％，供含量测定用)；三七皂苷R1(成都瑞芬思生物科技有限公司，批号：S-002-180807，含量>98％，供含量测定用)。乙腈与甲醇为色谱纯，其它试剂为分析纯。
3.方法与结果
3.1.色谱条件的选择
在进行HPLC条件选择时，尤其对流动相系统进行了选择。最后确定的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters Symmertry C18柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm)；以乙腈为流动相A，甲醇为流动相B，含10mmol/L三乙胺水溶液(用磷酸调至pH 2.6～2.8)为流动相C，按下表中规定进行梯度洗脱；流速0.8mL/min；检测波长为203nm；柱温为50℃；进样量5μL；流动相梯度洗脱程序(见表2)。
表2流动相梯度
3.2.溶液的制备
3.2.1.标准品溶液的制备
对照品溶液的制备：取三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Ro、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rd对照品适量，分别加甲醇制成每1mL各含1mg对照品的溶液，作为对照品溶液。
3.2.2.供试品溶液的制备
取人参药材粉末(过四号筛)约1g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入甲醇40mL，用电热套加热回流提取1h，滤过，滤液蒸干，残渣用少量90％甲醇溶解，通过已准备好的中性氧化铝(5g，预先活化)柱中，先后用无水乙醇，50％乙醇各150mL洗脱，合并收集洗脱液，旋干，残渣用甲醇溶解，转移至5mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为人参供试品溶液；取三七药材粉末(过四号筛)约1g，精密称定，置圆底烧瓶中，加甲醇40mL，置电热套上加热回流提取1h，滤过，滤液蒸干，残渣加适量甲醇溶解，转移至5mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；取西洋参药材粉末(过三号筛)约1g，精密称定，加甲醇40mL，用电热套加热回流提取1h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品。
3.2.3.HPLC指纹图谱的分析
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定即得。
4.色谱指纹图谱方法学考察
4.1.精密度实验
三个品种药材供试品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，检测色谱指纹图谱。结果表明，测定各特征峰相对峰面积的RSD均小于3％，表明仪器精密度良好。
4.2.重复性实验
三个品种药材粉末按供试品溶液制备方法进行制备6份，按上述色谱条件检测色谱指纹图谱。结果表明，测定各特征峰相对峰面积的RSD均小于3％，表明其重复性较好，符合色谱指纹图谱要求。
4.3.样品稳定性考察
三个品种的药材粉末供试品溶液，室温放置，分别在0,2,4,8,12,24,48,72h按上述色谱条件检测色谱指纹图谱，测得各特征峰的相对峰面积的RSD均小于3％，表明供试品溶液在72h内稳定。
5.相似度评价
采用中药色谱指纹图谱相似度评级系统—Chempattern 2017数据处理软件，分别对人参、三七、西洋参样品进行化学计量学分析。构建人参、三七、西洋参药材皂苷类成分HPLC指纹图谱共有模式所采用的参数如下：特征峰筛选采用试验中位数法，特征峰值计算采用了数学均数，以获得样本较稳健的特征，计算得到的共有模式。指认并确定了16个色谱峰为14批人参样品所共有，峰2为人参皂苷Re、峰3为人参皂苷Rg1、峰5为人参皂苷Ro、峰7为人参皂苷Rb1、峰8为人参皂苷Rc、峰10为人参皂苷Rd。共有峰信息图显示Rb1和Re信号峰面积比为1.5:1；人参皂苷Rb1和Rg1信号峰面积比为2.5:1；人参皂苷Rb1和Rc信号峰面积比为5:1；人参皂苷Rb1和Rd信号峰面积比为8:1。
西洋参皂苷类成分色谱指纹图谱中有12个主要峰为特征峰，峰1为人参皂苷Re，峰2为人参皂苷Rg1，峰3为人参皂苷Ro，峰5为人参皂苷Rb1，峰6为人参皂苷Rc，峰7为人参皂苷Rd。共有峰信息图显示Rb1和Re信号峰面积比为1.7:1；Rb1和Rg1信号峰面积比为20:1；Rb1和Rc信号峰面积比为12:1；Rb1和Rd信号峰面积比为7:1。
三七皂苷类成分指纹图谱中应有12个主要峰为特征峰，峰1为三七皂苷R1，峰2为人参皂苷Re，峰3为人参皂苷Rg1，峰4为人参皂苷Rb1，峰5为人参皂苷Rd。共有峰信息图显示Rg1和Re信号峰面积比为8:1；人参皂苷Rg1和三七皂苷R1信号峰面积比为4:1；人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1信号峰面积比为1.6:1；人参皂苷Rg1和人参皂苷Rd信号峰面积比为5:1。
结果显示，各共有峰面积占总峰面积均大于95％，相似度评价结果较为一致，符合中药色谱指纹图谱标准。在相似度计算的基础上，进一步对样品进行主成分分析。从收集到样本中共有峰载荷图贡献率来看，主成分分析与相似度计算的结果基本一致。人参皂苷Re，人参皂苷Rg1为不同批次人参差异的主要影响因素；三七皂苷R1和人参皂苷Re在主成分中的贡献率较大。西洋参药材中Rg1，Re，Ro，Rb1是差异主要因素。
从以上所述实例可以看出，本发明方法简便，适用性强，能同时用于人参、三七和西洋参皂苷类成分色谱指纹图谱的制定，可对离群样本和合格样本进行筛选，从而保证药材的品质。
实施例2
本实施例提供的适用于人参属中药材，为人参、三七、西洋参的破壁饮片。1.实验材料：
将人参，三七、西洋参药材分别粉碎成细粉；分别将细粉超微粉碎(南京天目TQG15超音速流化床气流粉碎分级机，频率设置为50kHz)40min得到粒径分布D90值均小于45.0μm的破壁粉体。具体样品信息见表3。
表3破壁饮片样品信息
2.仪器与试剂
Sartorius Secura 224-1CN万分之一电子天平；Thermo Fisher UltiMate 3000高效液相色谱仪(DAD检测器)；ZNH W-DL智能六联电热套(功率216W x 6，电压220V)，一恒电热HWS-26恒温水浴锅；Waters SymmertryC18(5μm,250mm×4.6mm)色谱柱。
人参皂苷Re(上海源叶生物科技有限公司，批号：B10M8S35243，HPLC>98％，供含量测定用)；人参皂苷Rg1(上海源叶生物科技有限公司，批号：Z26S7X21730，HPLC>98％，供含量测定用)；人参皂苷Rb1(上海源叶生物科技有限公司，批号：Z06M8L30693，HPLC>98％，供含量测定用)；人参皂苷Rc(上海源叶生物科技有限公司，批号：M27J8S40364，HPLC>98％，供含量测定用)；人参皂苷Ro(中国食品药品检定研究院，批号：111903-201805，供鉴别使用)；人参皂苷Rd(上海源叶生物科技有限公司，批号：Z13N8X48155，HPLC>98％，供含量测定用)；三七皂苷R1(成都瑞芬思生物科技有限公司，批号：S-002-180807，含量>98％，供含量测定用)。乙腈与甲醇为色谱纯，其它试剂为分析纯。
3.方法与结果
3.1.色谱条件的选择
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters Symmertry C18柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm)；以乙腈为流动相A，甲醇为流动相B，含10mmol/L三乙胺水溶液(用磷酸调至pH 2.6～2.8)为流动相C，按下表中规定进行梯度洗脱；流速0.8mL/min；检测波长为203nm；柱温为50℃；进样量5μL；流动相梯度洗脱程序(见表4)。
表4流动相梯度
3.2.溶液的制备
3.2.1.标准品溶液的制备
对照品溶液的制备：取三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Ro、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rd对照品适量，分别加甲醇制成每1mL各含1mg对照品的溶液，作为对照品溶液。
3.2.2.供试品溶液的制备
取人参破壁饮片约1g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入甲醇40mL，用电热套加热回流提取1h，滤过，滤液蒸干，残渣用少量90％甲醇溶解，通过已准备好的中性氧化铝(5g，预先活化)柱中，先后用无水乙醇，50％乙醇各150mL洗脱，合并收集洗脱液，旋干，残渣用甲醇溶解，转移至5mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为人参供试品溶液；取三七破壁饮片约1g，精密称定，置圆底烧瓶中，加甲醇40mL，置电热套上加热回流提取1h，滤过，滤液蒸干，残渣加适量甲醇溶解，转移至5mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；取西洋参破壁饮片约1g，精密称定，加甲醇40mL，用电热套加热回流提取1h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品。
3.2.3.HPLC指纹图谱的分析
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定即得。
4.色谱指纹图谱方法学考察
4.1.精密度实验
分别取三个品种破壁饮片供试品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，检测色谱指纹图谱。结果表明，测定各特征峰相对峰面积的RSD均小于3％，表明仪器精密度良好。
4.2.重复性实验
三个品种破壁饮片分别按供试品溶液制备方法进行制备6份，按上述色谱条件检测色谱指纹图谱。结果表明，测定各特征峰相对峰面积的RSD均小于3％，表明其重复性较好，符合色谱指纹图谱要求。
4.3.样品稳定性考察
三个品种破壁饮片供试品溶液，室温放置，分别在0,2,4,8,12,24,48,72h，按上述色谱条件检测色谱指纹图谱，测得各特征峰的相对峰面积的RSD均小于3％，表明供试品溶液在72h内稳定。
5.色谱指纹图谱分析
所得的人参、三七、西洋参破壁饮片皂苷类成分色谱指纹图谱完整，峰分离度好，信息全面。
从以上实施例可以看出，本发明提供的方法操作简便，准确可靠。供试品方法适用于破壁饮片的皂苷成分的提取，优选的色谱条件适合于人参、三七、西洋参破壁饮片的色谱指纹图谱的建立以及质量控制。
实施例3
本实施例提供的适用于人参属中药材，为人参、三七、西洋参的药材提取物。具体为人参醇提取物、人参总皂苷提取物、三七醇提取物、三七总皂苷提取物、西洋参醇提取物、西洋参总皂苷提取物。
1.实验材料：
分别从人参、三七以及西洋参中提取分离而得人参醇提取物、人参总皂苷提取物、三七醇提取物、三七总皂苷提取物、西洋参醇提取物、西洋参总皂苷提取物。
上述中药材提取物制备方法如下：
a:将人参、三七和西洋参药材粉碎成粗粉,分别用95％乙醇加热回流提取3次，每次1h，合并提取液，浓缩至浸膏，干燥后分别得到人参醇提取物、三七醇提取物和西洋参醇提取物。
b：取人参切成厚片，加水煎煮两次，第一次2h，第二次1.5h，煎液滤过，合并滤液，通过D101型大孔树脂柱，水洗脱至无色，再用60％乙醇洗脱，收集60％乙醇洗脱液，滤液浓缩至浸膏，干燥即得人参总皂苷提取物。
c:取三七粉碎成粗粉，用70％的乙醇回流提取，滤过，滤液减压浓缩，滤过，过D101型大孔树脂柱，用水洗涤，弃去水洗液，以80％乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，脱色精制，减压浓缩至浸膏，干燥即得三七总皂苷提取物。
d:取西洋参粉碎成粗粉，经70％的乙醇加热回流提取3次，第一次1.5h，第二次1h，第三次1h，合并提取液，旋转蒸发至干。加入适量纯水溶解，通过D101型大孔树脂柱，先后用水、15％乙醇洗脱，弃去洗脱液，再用80％乙醇洗脱，收集80％乙醇洗脱液，滤液浓缩至浸膏，得西洋参总皂苷提取物。
2.仪器与试剂
Sartorius Secura 224-1CN万分之一电子天平；Thermo Fisher UltiMate 3000高效液相色谱仪(DAD检测器)；ZNH W-DL智能六联电热套(功率216W x 6，电压220V)，一恒电热HWS-26恒温水浴锅；Waters Symmertry C18(5μm，250mm×4.6mm)色谱柱。
人参皂苷Re(上海源叶生物科技有限公司，批号：B10M8S35243，HPLC>98％，供含量测定用)；人参皂苷Rg1(上海源叶生物科技有限公司，批号：Z26S7X21730，HPLC>98％，供含量测定用)；人参皂苷Rb1(上海源叶生物科技有限公司，批号：Z06M8L30693，HPLC>98％，供含量测定用)；人参皂苷Rc(上海源叶生物科技有限公司，批号：M27J8S40364，HPLC>98％，供含量测定用)；人参皂苷Ro(中国食品药品检定研究院，批号：111903-201805，供鉴别使用)；人参皂苷Rd(上海源叶生物科技有限公司，批号：Z13N8X48155，HPLC>98％，供含量测定用)；三七皂苷R1(成都瑞芬思生物科技有限公司，批号：S-002-180807，含量>98％，供含量测定用)。乙腈与甲醇为色谱纯，其它试剂为分析纯。
3.方法与结果
a)色谱条件的选择
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters Symmertry C18柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm)；以乙腈为流动相A，甲醇为流动相B，含10mmol/L三乙胺水溶液(用磷酸调至pH 2.6～2.8)为流动相C，按下表中规定进行梯度洗脱；流速0.8mL/min；检测波长为203nm；柱温为50℃；进样量5μL；流动相梯度洗脱程序(见表5)。
表5流动相梯度
b)溶液的制备
i.标准品溶液的制备
对照品溶液的制备：取三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Ro、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rd对照品适量，分别加甲醇制成每1mL各含1mg对照品的溶液，作为对照品溶液；
ii.供试品溶液的制备
分别取各个药材提取物30mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
iii.HPLC指纹图谱的分析
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定即得。
4.色谱指纹图谱方法学考察
a)精密度实验
分别取各个药材提取物供试品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，检测色谱指纹图谱。结果表明，测定各特征峰相对峰面积的RSD均小于3％，表明仪器精密度良好。
b)重复性实验
三个品种的药材提取物分别按供试品溶液制备方法进行制备6份，按上述色谱条件检测色谱指纹图谱。结果表明，测定各特征峰相对峰面积的RSD均小于3％，表明其重复性较好，符合色谱指纹图谱要求。
c)样品稳定性考察
三个品种药材提取物供试品溶液，室温放置，分别在0,2,4,8,12,24,48,72h，按上述色谱条件检测色谱指纹图谱，测得各特征峰的相对峰面积的RSD均小于3％，表明供试品溶液在72h内稳定。
5.色谱指纹图谱分析
所得的人参、三七、西洋参药材提取物的皂苷类成分色谱指纹图谱完整，峰分离度好，信息全面。
从以上实施例可以看出，本发明提供的方法操作简便，准确可靠。优选的色谱条件适合于人参、三七、西洋参药材提取物的色谱指纹图谱的建立以及质量控制。
Claims (10)
1.一种适用于人参属中药材及药材提取物的皂苷类成分色谱指纹图谱的建立方法，所述人参属中药材为人参、三七、西洋参原药材，或其饮片形式；所述药材提取物为人参、三七、西洋参的中药提取物形式，其特征在于包括如下步骤：
(1)供试品溶液的制备：对于药材，取药材粉末经甲醇加热回流提取，甲醇回流提取后，残渣采用适量甲醇溶解，再通过预先活化的中性氧化铝柱，先后用无水乙醇，50%乙醇洗脱，合并收集洗脱液，蒸干，残渣用适量甲醇溶解；对于药材提取物，取提取物用适量甲醇溶解；
(2)对照品溶液制备包括：取三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Ro、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rd对照品，分别加入甲醇制成对照品溶液；
(3)建立人参属中药材的HPLC指纹图谱，并对皂苷成分特征峰进行化学归属；所述供试品和对照品的HPLC检测步骤中：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A为乙腈；流动相B为甲醇；流动相C为含10 mmol/L三乙胺水溶液，用磷酸调至pH 2.6~2.8；梯度洗脱；
梯度洗脱过程中，流动相A、流动相B和流动相C的变化为：
0-33min，流动相A 0%-37%，流动相B 40%-40%，流动相C 60%-23%；
33-65min，流动相A 37%-90%，流动相B 40%-10%，流动相C 23%-0%。
2.根据权利要求1所述的色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于，供试品溶液的制备中，加热回流条件为保持微沸状态。
3.根据权利要求1所述的色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述加热回流提取时间为1h。
4.根据权利要求1所述的色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述甲醇与药材的用量比为30-100mL:1-5g，甲醇与药材提取物的用量比为5-20mL:50-200 mg。
5.根据权利要求1所述的色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于，进行所述HPLC检测分析采用的色谱柱为Waters Symmertry C18，色谱柱长为250 mm，内径为4.6 mm，粒径为5 μm。
6.根据权利要求1所述的色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于，进行所述HPLC检测分析时紫外检测波长为203nm。
7.根据权利要求1所述的色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于，进行所述HPLC检测分析时进样体积为5 μL。
8.根据权利要求1所述的色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于，进行所述HPLC检测分析时流速为0.8mL/min。
9.根据权利要求1所述的色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于，进行所述HPLC检测分析时进样温度为50℃。
10.一种人参属中药材及药材提取物的皂苷类成分色谱指纹图谱的检测方法，所述人参属中药材为人参、三七、西洋参原药材，或其饮片形式；所述药材提取物为人参、三七、西洋参的中药提取物形式，其特征在于包括如下步骤：
（1）待测样品色谱图的制备：
对于药材，取药材粉末经甲醇加热回流提取，甲醇回流提取后，残渣采用适量甲醇溶解，再通过预先活化的中性氧化铝柱，先后用无水乙醇，50%乙醇洗脱，合并收集洗脱液，蒸干，残渣用适量甲醇溶解；对于药材提取物，取提取物用适量甲醇溶解；取待测样品溶液，注入超高效液相色谱仪，得到色谱图；
2）待测样品色谱图和标准对照色谱指纹图谱相似度计算：
将待测样品的色谱图通过共有模式的构建、相似度计算和主成分分析方法可对离群和合格样本进行有效筛选，比较待测样品的色谱图和标准对照色谱指纹图谱相似度；
其中，色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A为乙腈；流动相B为甲醇；流动相C为含10 mmol/L三乙胺水溶液，用磷酸调至pH 2.6~2.8；梯度洗脱；
梯度洗脱过程中，流动相A、流动相B和流动相C的变化为：
0-33min，流动相A 0%-37%，流动相B 40%-40%，流动相C 60%-23%；
33-65min，流动相A 37%-90%，流动相B 40%-10%，流动相C 23%-0%；
波长为203nm；进样体积为5 μL；流速为0.8mL/min；进样温度为50℃。
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