CN111157643A - 一种基于hplc技术治疗缺血性脑血管病的中药复方研究方法 - Google Patents

一种基于hplc技术治疗缺血性脑血管病的中药复方研究方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开的属于中药研究技术领域，具体为一种基于HPLC技术治疗缺血性脑血管病的中药复方研究方法，将称取的药材(除去蜈蚣)加入8倍超纯水，浸泡30min；然后加热煮沸10min，之后转小火煎煮50min，趁热用纱布过滤，得到药渣与煎出液；第二次煎煮向内加入6.4倍超纯水，同上，合并两次煎煮液，将蜈蚣研磨成粉状物加入煎煮液中，余温下搅拌并混合均匀；将混匀的煎煮液经离心、过滤、浓缩等处理后，将其最终浓缩至1mL含生药1.0g，取1mL NLXTD浓缩水煎液，经5％甲醇稀释后，过0.22μm滤膜待进样，运用高效液相色谱技术和主成分分析思想，建立并分析脑络欣通HPLC指纹图谱，更好的提高临床用药安全性，为临床用药提供更准确、可靠的标准，以保证用药的安全有效。

Description

一种基于HPLC技术治疗缺血性脑血管病的中药复方研究方法
技术领域
本发明涉及中药研究技术领域，具体为一种基于HPLC技术治疗缺血性脑血管病的中药复方研究方法。
背景技术
脑血管病(CVD)是指由各种病因导致供应脑部血液的血管发生病变所致的脑部病变，又称中风或卒中，其中缺血性脑血管疾病约占70％。因此，对ICVD的研究，一直以来都是国内外研究的难点和热点。大量文献表明，除了溶栓重组人组织纤维蛋白溶酶原激活剂(rt-PA),临床也广泛将中药及复方作为缺血性中风治疗的替代药物，比如脑络欣通方、补阳还五汤、脑心通方、侯氏黑散等。脑络欣通方是新安王氏内科著名医家王乐匋先生治疗缺血性中风的新安名方。全方活血寓补气之中，气贯经脉以助血行，营血流畅经脉得养，临床疗效显著。
大量文献表明，关于脑络欣通的作用机制、药理作用、临床应用已有初步研究成果，然而以上研究要以脑络欣通质量控制为基础进行更为客观性的研究，目前仅有少量文献研究脑络欣通方个别化学成分，缺乏对脑络欣通质量控制方面的研究，因此，中药及复方指纹图谱研究广泛应用于其质量控制。
发明内容
(一)解决的技术问题
本部分的目的在于概述本发明的实施方式的一些方面以及简要介绍一些较佳实施方式。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于目前仅有少量文献研究脑络欣通方个别化学成分，缺乏对脑络欣通质量控制方面的研究的问题，提出了本发明。
因此，本发明的目的是提供一种基于HPLC技术治疗缺血性脑血管病的中药复方研究方法，运用高效液相色谱技术和主成分分析思想，建立并分析脑络欣通HPLC指纹图谱，更好的提高临床用药安全性，为临床用药提供更准确、可靠的标准，以保证用药的安全有效。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种基于HPLC技术治疗缺血性脑血管病的中药复方研究方法，由以下重量配比制成，按脑络欣通原方比例分别称取黄芪30g，三七6g，川芎10g，天麻10g，当归10g，红花10g，蜈蚣2条，试剂分别为甲醇(色谱纯)、超纯水和分析纯。
作为本发明的一种优选方案，其中：脑络欣通方供试品溶液的制备方法：将称取的药材(除去蜈蚣)加入8倍超纯水，浸泡30min；然后加热煮沸10min，之后转小火煎煮50min，趁热用纱布过滤，得到药渣与煎出液；第二次煎煮向内加入6.4倍超纯水，同上，合并两次煎煮液，将蜈蚣研磨成粉状物加入煎煮液中，余温下搅拌并混合均匀；将混匀的煎煮液经离心、过滤、浓缩等处理后，将其最终浓缩至1mL含生药1.0g，取1mL NLXTD浓缩水煎液，经5％甲醇稀释后，过0.22μm滤膜待进样。
作为本发明的一种优选方案，其中：脑络欣通组方的7味药材分别黄芪为豆科植物蒙古黄芪的干燥根、三七为五加科植物三七的干燥根和根茎、川芎为伞形科植物川芎的干燥根茎、天麻为兰科植物天麻的干燥块茎、蜈蚣为蜈蚣科动物少棘巨蜈蚣的干燥体、当归为伞形科植物当归的干燥根、红花为菊科植物红花的干燥花。
作为本发明的一种优选方案，其中：标准品为对羟基苯甲醇、紫丁香苷、毛蕊异黄酮苷和芒柄花苷。
作为本发明的一种优选方案，其中：色谱柱：Unitary C18(4.6×250mm，5μm)，流动相：甲醇(A)-水(B)，检测波长：270nm，流速：0.8mL/min，柱温：27℃，进样量：20μl，时间梯度洗脱，分析时间：110min。
(三)有益效果
本发明提供了一种基于HPLC技术治疗缺血性脑血管病的中药复方研究方法。具备以下有益效果：
运用高效液相色谱技术和主成分分析思想，建立并分析脑络欣通HPLC指纹图谱，更好的提高临床用药安全性，为临床用药提供更准确、可靠的标准，以保证用药的安全有效，成功建立并分析了12批脑络欣通样品HPLC指纹图谱，为脑络欣通方临床用药的安全性提供质量控制的依据，中药及复方指纹图谱作为建立其质量控制标准的有效方法受国内外一致认可，能够清楚地表示其中所含化学成分，具有全面性和特征性，从整体的水平上反应中药及复方质量控制是否符合要求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将结合附图和详细实施方式对本发明进行详细说明，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明一种基于HPLC技术治疗缺血性脑血管病的中药复方研究方法的12批脑络欣通方HPLC指纹图谱叠加图；
图2为本发明一种基于HPLC技术治疗缺血性脑血管病的中药复方研究方法的脑络欣通方样品和混合标准品色谱图；
图3为本发明一种基于HPLC技术治疗缺血性脑血管病的中药复方研究方法的脑络欣通方指纹图谱碎石图。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明作出进一步详细阐述。
请参阅图1-3，本发明实施例提供一种技术方案：一种基于HPLC技术治疗缺血性脑血管病的中药复方研究方法，由以下重量配比制成，按脑络欣通原方比例分别称取黄芪30g，三七6g，川芎10g，天麻10g，当归10g，红花10g，蜈蚣2条，试剂分别为甲醇(色谱纯)、超纯水和分析纯。
脑络欣通方供试品溶液的制备方法：将称取的药材(除去蜈蚣)加入8倍超纯水，浸泡30min；然后加热煮沸10min，之后转小火煎煮50min，趁热用纱布过滤，得到药渣与煎出液；第二次煎煮向内加入6.4倍超纯水，同上，合并两次煎煮液，将蜈蚣研磨成粉状物加入煎煮液中，余温下搅拌并混合均匀；将混匀的煎煮液经离心、过滤、浓缩等处理后，将其最终浓缩至1mL含生药1.0g，取1mL NLXTD浓缩水煎液，经5％甲醇稀释后，过0.22μm滤膜待进样。
仪器：戴安U3000系列高效液相色谱仪(美国赛默飞公司)；IKA RV10 digital旋转蒸发仪(德国IKA公司)；sartorius电子分析天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；R404A低温离心机(德国Eppendorf公司)；Milli-Q Gradient A10超纯水系统(密理博(上海)贸易有限公司)。
中药饮片材料：脑络欣通组方的7味药材分别购自安徽亳州广印堂中药有限责任公司(A1-G1)、安徽省安保药业有限责任公司(A2-G2，A3-G3)，经安徽中医药大学俞年军教授鉴定黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao.的干燥根、三七为五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根和根茎、川芎为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎、天麻为兰科植物天麻Gastrodia elata bl.的干燥块茎，蜈蚣为蜈蚣科动物少棘巨蜈蚣Scolopendra subspinipes mutilans L.Koch的干燥体、当归为伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根、红花为菊科植物红花Carthamus tinctoriusL.的干燥花，均符合2015《中国药典》第一部，见表1。
表1 7味药材具体来源及批次
Figure BDA0002353545470000051
色谱条件：色谱柱：Unitary C18(4.6×250mm，5μm)，流动相：甲醇(A)-水(B)按表2的梯度洗脱，检测波长：270nm，流速：0.8mL/min，柱温：27℃，进样量：20μl，时间梯度洗脱，分析时间：110min。
对照品溶液的制备：取各对照品适量，加5％甲醇水配制成含对羟基苯甲醇61.400μg/mL、紫丁香苷8.939μg/mL、毛蕊异黄酮苷13.000μg/mL、芒柄花苷10.886μg/mL的混合对照品溶液。
表2流动相的洗脱梯度
t/min A(甲醇％) B(水％)
0 5 95
10 5 95
20 10 90
35 20 80
60 35 65
75 45 55
100 60 40
105 40 60
110 5 95
实施例1：
精密度试验：取同一脑络欣通供试品溶液六份，在上述色谱条件下分别进样，记录色谱图中对羟基苯甲醇、紫丁香苷、毛蕊异黄酮苷和芒柄花苷峰的相对保留时间和相对峰面积，以特征共有峰中的9号峰为参照峰，结果表明二者RSD值均小于1.5％，符合指纹图谱建立的条件，说明仪器的精密度良好。
实施例2：
稳定性试验：取同一脑络欣通供试品溶液，在上述色谱条件下，分别于0，4，8，12和24h进样，计算不同时间点4个特征共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果显示RSD均小于5％，符合指纹图谱建立的条件，所得到的结果说明样品在室温下24h内较稳定。
实施例3：
重复性试验：取不同批脑络欣通提取液6份，在上述色谱条件下进样，计算各色谱图中4个特征共有峰的相对峰面积和相对保留时间的RSD，结果显示RSD均小于3.5％，符合指纹图谱建立的条件，说明该方法下得到的指纹图谱重复性良好。
样品溶液测定：根据随机数字法，运用SPSS 21.0将7味药材进行排列随机组方，按方法制备12批脑络欣通方供试品溶液，参照色谱条件，建立脑络欣通方指纹图谱。7味药材随机组合批次见表3。
表3三个不同批次的脑络欣通组方原药材随机组合
Figure BDA0002353545470000061
Figure BDA0002353545470000071
指纹图谱的建立：采用国家药典委员会的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”相似度评价软件，评价12批脑络欣通方药材的相似度，建立12批脑络欣通方样品的指纹图谱叠加图。
主成分分析：以脑络欣通方指纹图谱中的11个共有峰的峰面积为研究对象，运用SPSS 21.0对其进行主成分分析，对其进行降维处理，再根据各组方药材主成分综合得分并排序，评价各组方药材主成分分布情况。
批脑络欣通方HPLC指纹图谱的建立与相似度分析：成功地建立了脑络欣通方的HPLC指纹图谱，确定了11个共有峰，结果见图1；运用Origin Pro 8.0软件处理原始数据，从而建立12批脑络欣通方药材指纹图谱叠加图(图1)，再经过中药指纹图谱相似度分析得12批样品图谱之间相似度处于0.872-1.000之间，表明各批次样品间化学成分基本特征较为一致，结果见表4。其中S10、S12两批组方药材相似度较低，可能与药材产地不同有关。
表4 12批脑络欣通方药材相似度评价
编号 相似度 编号 相似度 编号 相似度
S01 1.000 S05 0.913 S09 0.904
S02 0.986 S06 0.996 S10 0.891
S03 0.904 S07 0.927 S11 0.940
S04 0.966 S08 0.996 S12 0.872
色谱峰的指认：本实验确定了11个共有峰，通过脑络欣通指纹图谱与标准品图谱比对，最终确定四种化学成分，图谱中4号峰与对羟基苯甲醇标准品出峰时间相对应，经反复进样，结果一致，即初步确定4号峰即为对羟基苯甲醇；同样发现6号峰与紫丁香苷的出峰时间相似，反复进样均无明显差异，最终确定6号峰为紫丁香苷；并依次确定8号峰为毛蕊异黄酮苷，11号峰为芒柄花苷。结果见图2。
主成分分析：中药及复方指纹图谱具有全面性、特征性等特点，但是由于其包含信息量过大，导致其数据处理和分析工作的难度。因此，本研究运用主成分分析法对脑络欣通方指纹图谱进行降维处理。以脑络欣通方指纹图谱特征共有峰峰面积为变量，经降维分析后，得到四个主成分(特征值大于1)，这四个主成分能反映全方85.01％的信息，再以4个主成分的特征根为权，计算12批脑络欣通方中主成分综合得分，间接反映出其中主成分的分布情况，如图3和表5-6所示。结果表明，第6批样品溶液的主成分得分排名第一，可作为下一步脑络欣通方谱效关系研究的指纹图谱序列。
表5脑络欣通方4个主成分的特征值、贡献率和累积贡献率
Figure BDA0002353545470000081
Figure BDA0002353545470000091
表6 12批次脑络欣通方各主成分得分、综合得分和排名
Figure BDA0002353545470000092
流动相的选择：本实验主要考察了流动相组成为“甲醇-水”和“乙腈-水所得到的色谱图，发现甲醇-水作为流动相整体响应值高于用乙腈-水作为流动相，且甲醇为实验室较常见使用试剂，价格便宜，方便获得，而乙腈价格较高，且洗脱效果不如前者，故最终采用甲醇-水作为流动相。
检测波长的选择：实验过程中对该样品进行了DAD扫描，比较了203nm、260nm、270nm、320nm波长，在实验过程中同时对样品进行了扫描，综合考虑各个色谱峰的强度比例、HPLC梯度洗脱中基线的稳定性等因素，试验结果表明，主要色谱峰均在270nm附近有较大吸收，且杂质峰相对较少，故测定波长选择270nm。
相似度分析与主成分分析：本实验运用随机数字表法进行组方，得12批不同批次、不同厂家脑络欣通方原药材。运用相似度分析法分析12批脑络欣通样品色谱图，结果表明12批样品相似度较好，即色谱行为较一致。因此，本研究建立了一种稳定、可靠、重复性好的脑络欣通方指纹图谱测定方法，可作为其质量控制方法；为了更清晰地反映12批脑络欣通样品指纹图谱信息，本研究采用主成分分析的降维思想，对12批样品进行主成分分析。12批样品主成分分布情况表明主成分综合得分第一者为S06批次组方，可为下一步脑络欣通方抗脑缺血损伤谱效关系研究中样品选择提供依据。
色谱峰的指认：本实验通过标准品比对初步检识出脑络欣通方中的4个化学成分，结果表明4号峰、6号峰、8号峰和11号峰分别对应对羟基苯甲醇、紫丁香苷、毛蕊异黄酮苷和芒柄花苷。其中毛蕊异黄酮苷和芒柄花苷为君药黄芪中的主要化学成分，对羟基苯甲醇为佐药天麻中的主要化学成分，紫丁香苷为使药红花中的主要化学成分。但是在本研究中，根据2015版《中国药典》，该方中部分指标性成分还未被检识出，可能是由于煮药温度和时间的问题导致成分含量过小，不能达到高效液相色谱的灵敏度以至于检测不出，如阿魏酸，羟基红花黄色素，天麻素，巴利森苷等。另外，三七中的三七皂苷和人参皂苷类化学成分是臣药三七发挥抗脑缺血作用的主要化学成分，由于其末端吸收(最大吸收波长为203nm)而未在本研究中检测出，但已有文献报道脑络欣通方中含有三七皂苷和人参皂苷类化学成分；黄芪中指标性成分为黄芪甲苷，但因其对紫外无吸收而未在本研究中检测出。因此针对以上局限性，本课题组在后期研究中运用高分辨率质谱进一步确认脑络欣通方中各种化学成分。
本研究成功地建立并分析了12批脑络欣通样品HPLC指纹图谱，为脑络欣通方临床用药的安全性提供质量控制的依据，并为下一步脑络欣通方抗脑缺血作用的谱效关系研究提供基础。
应当理解，虽然本说明书是按照各个实施例描述的，但并非每个实施例仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅是为了清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种基于HPLC技术治疗缺血性脑血管病的中药复方研究方法，其特征在于：由以下重量配比制成，按脑络欣通原方比例分别称取黄芪30g，三七6g，川芎10g，天麻10g，当归10g，红花10g，蜈蚣2条，试剂分别为甲醇(色谱纯)、超纯水和分析纯。
2.根据权利要求1所述的一种基于HPLC技术治疗缺血性脑血管病的中药复方研究方法，其特征在于：脑络欣通方供试品溶液的制备方法：将称取的药材(除去蜈蚣)加入8倍超纯水，浸泡30min；然后加热煮沸10min，之后转小火煎煮50min，趁热用纱布过滤，得到药渣与煎出液；第二次煎煮向内加入6.4倍超纯水，同上，合并两次煎煮液，将蜈蚣研磨成粉状物加入煎煮液中，余温下搅拌并混合均匀；将混匀的煎煮液经离心、过滤、浓缩等处理后，将其最终浓缩至1mL含生药1.0g，取1mL NLXTD浓缩水煎液，经5％甲醇稀释后，过0.22μm滤膜待进样。
3.根据权利要求1所述的一种基于HPLC技术治疗缺血性脑血管病的中药复方研究方法，其特征在于：脑络欣通组方的7味药材分别黄芪为豆科植物蒙古黄芪的干燥根、三七为五加科植物三七的干燥根和根茎、川芎为伞形科植物川芎的干燥根茎、天麻为兰科植物天麻的干燥块茎、蜈蚣为蜈蚣科动物少棘巨蜈蚣的干燥体、当归为伞形科植物当归的干燥根、红花为菊科植物红花的干燥花。
4.根据权利要求1所述的一种基于HPLC技术治疗缺血性脑血管病的中药复方研究方法，其特征在于：标准品为对羟基苯甲醇、紫丁香苷、毛蕊异黄酮苷和芒柄花苷。
5.根据权利要求1所述的一种基于HPLC技术治疗缺血性脑血管病的中药复方研究方法，其特征在于：色谱柱：Unitary C18(4.6×250mm，5μm)，流动相：甲醇(A)-水(B)，检测波长：270nm，流速：0.8mL/min，柱温：27℃，进样量：20μl，时间梯度洗脱，分析时间：110min。
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